吳浩馨， 胡中杰

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 肝病中心一科， 北京 100069

自發(fā)性細菌性腹膜炎(SBP)是在肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的腹腔感染，是肝硬化等終末期肝病患者常見并發(fā)癥。肝硬化腹水住院患者SBP發(fā)生率為7%～30%[1]，并發(fā)SBP患者的病死率高達20%～30%[2]。然而，SBP的早期臨床診斷、早期病原學(xué)診斷及早期抗感染治療仍是臨床醫(yī)師面臨的巨大挑戰(zhàn)[3]。如何快速診斷和精準(zhǔn)治療一直都是研究的重點。因此，本文綜述分子診斷技術(shù)在SBP診斷中的研究成果及最新進展。

1 SBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)及現(xiàn)狀

所有腹水患者在入院時，無論是否懷疑有臨床感染，均應(yīng)進行診斷性穿刺。目前，SBP國際上的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：在無明顯的腹腔內(nèi)、手術(shù)可治療的感染源情況下，嗜中性粒細胞絕對計數(shù)(PMN)≥250/mm3[4]。

理論上，通過檢測細菌本身來診斷細菌感染是金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床上往往很難實現(xiàn)。首先，樣本細菌數(shù)量少，導(dǎo)致細菌培養(yǎng)的敏感度相對較低：有研究[5]報道，即使在感染性休克中，血液細菌的培養(yǎng)陽性率也只有69%。其次，Potgieter等[6]提出，在慢性病患者的血液中，存在大量有效休眠的微生物。這意味著細菌可以寄居在循環(huán)的免疫細胞中，無法被培養(yǎng)。第三，細菌培養(yǎng)時間較長，而抗菌治療時機的延誤可顯著增加病死率。最后，部分細菌培養(yǎng)陽性的患者沒有腹膜炎的相關(guān)臨床癥狀，即所謂的細菌性腹水，在國際SBP的診斷指南中，腹水培養(yǎng)陽性也不是診斷SBP的必要條件[7]。

2 SBP的分子診斷原理及應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來，細菌DNA(bacterial DNA,bactDNA)檢測和測序已被應(yīng)用于多種傳染病的診斷，分子技術(shù)可以在4～5 h內(nèi)檢測出少量的細菌DNA[4,8-9]。特別是對生長緩慢的細菌和生物化學(xué)上無法識別的細菌，用分子技術(shù)進行鑒定顯得尤為重要。隨著分子診斷技術(shù)的不斷優(yōu)化與發(fā)展，為SBP的診斷提供了機遇。

2.1 細菌DNA的診斷原理 細菌易位是肝硬化腹水并發(fā)細菌感染的重要病理機制，小腸細菌過度生長，當(dāng)達到一個臨界閾值可能易位進入腸系膜淋巴結(jié)、血液，最后進入腹水[10]。2002年,Such等[11]利用基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，首次在培養(yǎng)陰性的腹水和血液中檢測到細菌DNA，并提出通過檢測腹水或血液樣本的病原體核酸來作為細菌易位的替代標(biāo)志。但越來越多的證據(jù)表明，細菌易位可以是活菌，也可以是游離DNA[12]。因此，采用外切酶對樣本中游離核酸進行預(yù)處理，可減少游離核酸對活菌DNA檢測的干擾，能更準(zhǔn)確反映樣本中存在的具有感染性的活致病原[13]。然而，檢測到細菌DNA是否便可以診斷SBP呢？

2.2 細菌DNA定性不足以診斷SBP 2008年,Zapater等[14]分析了156例非感染性肝硬化腹水患者在12個月內(nèi)的臨床轉(zhuǎn)歸，結(jié)果表明，檢出細菌DNA的患者病死率較高，但bactDNA的存在并不能預(yù)測SBP的發(fā)展。2016年,Bruns等[15]在218例肝硬化合并感染癥狀的患者中發(fā)現(xiàn)，超過70%的肝硬化以及慢加急性肝衰竭患者的循環(huán)或腹水中存在bactDNA，但臨床證實沒有血流或腹腔感染。

bactDNA定性不足以診斷SBP可能的原因是：第一，細菌易位時被循環(huán)免疫細胞破壞而暴露出bactDNA，使得細菌DNA片段存于血液或腹水中，但尚不足以引起感染[16]。第二，腹水通過調(diào)理作用、白細胞吸引作用抑制細菌活性或殺死細菌[17]，在這過程中，細菌代謝產(chǎn)物可持續(xù)存在并被檢測到。

2.3 細菌DNA的定量檢測比定性檢測可能更有助于SBP的診斷 2014年，Krohn等[18]提出用實時熒光定量PCR (Q-PCR)來檢測腹水中細菌量的問題。2019年,Alvarez-Silva等[19]通過Q-PCR定量檢測bactDNA，發(fā)現(xiàn)失代償期肝硬化患者的腹水bactDNA定量與SBP沒有直接關(guān)系。Fagan等[20]在培養(yǎng)陰性的非中性粒細胞增高性腹水中發(fā)現(xiàn)，低水平細菌數(shù)量與炎癥標(biāo)志物關(guān)系不大，但bactDNA水平與中性粒細胞計數(shù)呈正相關(guān)。由此可見，SBP的發(fā)展不僅僅基于bactDNA的存在，也與其數(shù)量相關(guān)。

值得注意的是，在SBP的發(fā)生中，消化道屏障是第一道防線，而腹膜免疫功能則是關(guān)鍵的第二道防線[17]。在肝硬化非感染性腹水中，宿主的腹膜免疫反應(yīng)可以有效控制低水平的細菌，從而降低患者的SBP發(fā)病率和病死率。Q-PCR檢測也有其技術(shù)局限性，需要標(biāo)準(zhǔn)品來實現(xiàn)絕對定量，而不同分子遺傳學(xué)方法檢測到的腹水bactDNA有很大的差異[15]。因此，分子診斷技術(shù)也需要不斷地優(yōu)化與進步。另外，肝硬化腹水患者臨床病情復(fù)雜多樣，腹水量的變化對細菌絕對數(shù)量的判斷也可能有影響，但有關(guān)腹水量的變化和細菌數(shù)量之間的關(guān)系尚未有研究報道。因此，在檢測分析bactDNA的絕對水平時，也要考慮腹水量的變化。

2.4 細菌DNA數(shù)量結(jié)合其種類能更精準(zhǔn)地判斷SBP 細菌易位后是否引起感染，與宿主的防御、免疫功能，細菌的毒力及數(shù)量有關(guān)。細菌的毒力取決于細菌的種類。從細菌培養(yǎng)的結(jié)果來看，革蘭陰性菌、厭氧菌和腸球菌是造成肝硬化感染最常見的病原菌[21]。但隨著侵入性操作在臨床上的逐漸應(yīng)用，外源性感染途徑(如中心靜脈置管、經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門體分流術(shù))也逐漸增多。近十年來，葡萄球菌的感染率呈逐年增加的趨勢[22]。

2019年，Alvarez-Silva等[19]研究10例失代償期肝硬化患者腹水和血液的菌群特征發(fā)現(xiàn)，根據(jù)α-多樣性指數(shù)，在屬水平上腹水菌群多樣性要高于血液。腹水中最常見的是紫色桿菌屬、沙門菌屬、皺紋單胞菌屬。Chen等[23]發(fā)現(xiàn)，肝硬化腹水患者中，SBP發(fā)生率較高者，在門水平上以α-變形桿菌和γ-變形菌為主，尤其是莫拉氏菌和不動桿菌，這兩類種群也是臨床上重要的致病菌群。而病死率較高者主要以擬桿菌門和壁厚菌門為主，研究[24]表明這兩類群在腸道中占主導(dǎo)地位，可能是此類患者腸道黏膜屏障嚴重受損，從而造成病死率較高。近年來，隨著預(yù)防性抗菌藥物的應(yīng)用，因耐藥菌感染導(dǎo)致病死亡率明顯增加,尤其在亞洲地區(qū)[25]。最近一項關(guān)于全球耐藥菌的研究[26]發(fā)現(xiàn)，法國、意大利等國家以產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶的腸桿菌科多見；法國以萬古霉素耐藥腸球菌多見；荷蘭、英國等地以甲氧西林耐藥葡萄球菌多見。在亞洲，耐碳青霉烯類腸桿菌科和鮑曼氏菌比較普遍[25]。但是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科仍然是近年來最常見的多重耐藥菌。由此可見，檢測特定種類的細菌DNA可能比僅僅檢測細菌DNA的存在更重要。但分析特定細菌的種類和數(shù)量與臨床結(jié)果及系統(tǒng)性炎癥之間的關(guān)系尚待進一步的研究。

綜上所述，SBP是肝病進展的一個重要標(biāo)志，也是終末期肝病的一個決定性分水嶺。分子診斷技術(shù)為提高SBP的診斷效率提供了可能，2011年，Soriano等[27]采用PCR和測序技術(shù)檢測16S rDNA基因的方法對SBP的診斷做了一些探索，然而從對SBP診斷標(biāo)準(zhǔn)的認識，連續(xù)標(biāo)本的動態(tài)變化，以及分子檢測技術(shù)的提高等方面的不足使得此技術(shù)沒有真正應(yīng)用于臨床實踐，在Gu等[28]運用分子診斷技術(shù)進行快速病原學(xué)檢測的研究中，發(fā)現(xiàn)宏基因組測序(mNGS)技術(shù)對細菌檢測的靈敏度和特異度分別為79%和91%，在12例體液培養(yǎng)或PCR陰性但臨床判定最終確定了感染性診斷的患者中，60%的mNGS陽性。

因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)對SBP進行診斷具有巨大的潛能，通過對微生物進行定性定量的分析，以及根據(jù)測序結(jié)果對細菌種類進行判定，能夠更好的解釋臨床問題并服務(wù)于臨床實踐，所以仍需要進一步的研究。

3 展望

(1)肝硬化細菌性腹水發(fā)生率逐年上升可能是細菌的短暫定植，需要更加精確的定性定量分子技術(shù)以及宏基因測序進一步研究。(2)需要新的生物標(biāo)志物指導(dǎo)抗菌藥物的應(yīng)用，并評估抗菌藥物的治療效果。(3)通過細菌DNA的數(shù)量及分層從而準(zhǔn)確地描述肝硬化腹水的菌群特征，提供新的診斷依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：吳浩馨負責(zé)文獻檢索和論文撰寫；胡中杰負責(zé)論文審校。