任麗君，楊孝樸，包世俊，武小椿，馬永華，魏衍全

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

干擾素(interferon，IFN)是由機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性的糖蛋白[1-2]。根據(jù)干擾素的來(lái)源、生物學(xué)性質(zhì)及活性，將干擾素分Ⅰ型和Ⅱ型[3-4]。Ⅰ型干擾素主要起抗病毒和抗腫瘤作用[5]，包括 IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ和IFN-ζ，Ⅱ型干擾素僅有IFN-γ亞型，由抗原刺激細(xì)胞產(chǎn)生后在抗胞內(nèi)病原體的宿主防御中起關(guān)鍵作用[6-9]。1992年，日本東麗株式會(huì)社的Nakamura等首次分離到了貓干擾素基因，將其歸類為ω型干擾素，有研究表明IFN-ω對(duì)于貓白血病毒(FLV)和貓免疫缺陷病毒(FIV)共感染的貓以及細(xì)小病毒具有明顯治療效果，之后在此基礎(chǔ)上證明了IFN-ω相較于IFN-γ對(duì)FIV的復(fù)制有抑制作用且存在劑量依賴性[10-11]。由于貓ω干擾素(feline interferon，F(xiàn)eIFN-ω)的抗病毒能力相當(dāng)廣泛且具有顯著效果[12]，因此研究FeIFN-ω的抗病毒機(jī)制在治療有關(guān)貓病毒病的實(shí)踐中具有重要意義。IFN-γ作為一種新型干擾素，在抗腫瘤方面發(fā)揮較強(qiáng)的作用[13]，1995年雞IFN-γ基因被首次成功克隆，隨后成功表達(dá)出重組鵝、家兔、豬、牛等動(dòng)物的IFN-γ并將其用于臨床治療[14-15]，但有關(guān)貓的IFN-γ研究卻少被報(bào)道。大量研究顯示Ⅰ型與Ⅱ型干擾素均具有抗病毒活性，且IFN-γ與IFN-α、IFN-β和IFN-ω之間存在相互協(xié)同作用，能一同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[16-17]。

近年來(lái)，人們生活水平迅速提高，帶動(dòng)了寵物養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，與貓有關(guān)的疾病特別是病毒性疾病逐年增多。本研究首先對(duì)貓ω干擾素(FeIFN-ω)和貓γ干擾素(feline interferon-gamma，F(xiàn)eIFN-γ)的基因完成克隆，然后插入原核表達(dá)載體pET28a-SUMO構(gòu)建重組質(zhì)粒并摸索最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，最終以可溶性形式表達(dá)并純化出2種融合蛋白。本研究利用大腸埃希氏菌建立了FeIFN-ω和FeIFN-γ高效的原核表達(dá)系統(tǒng)，為后期研究干擾素抗病毒作用機(jī)制、開(kāi)發(fā)抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和主要試劑 大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21，北京擎科生物科技有限公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、卡那霉素，TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ，New England BioLabs公司產(chǎn)品；PMSF(苯甲基磺酰氟)、SUMO蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；Ni-NTA純化柱、蛋白濃縮柱、截留柱，Merck公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器與設(shè)備 高速臺(tái)式空冷型離心機(jī)，上海博翎儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；制冰機(jī)，常熟市雪科電器有限公司產(chǎn)品；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司產(chǎn)品；梯度基因擴(kuò)增儀，上海奧陸生物科技有限公司產(chǎn)品；紫外風(fēng)光光度計(jì)，美國(guó)GE公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩器，上海珂淮儀器有限公司產(chǎn)品；超低溫保存箱、生物安全柜，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 FeIFN-ω和FeIFN-γ蛋白的信號(hào)肽序列和理化性質(zhì)分析 通過(guò)SignalP-4.0 Server(網(wǎng)址：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和Expasy(網(wǎng)址：https://web.expasy.org/protparam/)在線服務(wù)器分別預(yù)測(cè)分析2種蛋白的信號(hào)肽段和理化性質(zhì)。

1.2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SUMO-FeIFN和pET28a-SUMO-FeIFN-γ的構(gòu)建 根據(jù)GenBank收錄的FeIFN-ω(GenBank No.NM-001089309.1)和FeIFN-γ(GenBank No.NM-001009873.1)的序列，舍棄掉信號(hào)肽后設(shè)計(jì)PCR引物。FeIFN-ω引物序列，F(xiàn):5'-GAAGGATCCTGTGCCCTGCCTGGGAGCCACG-3'，R:5'-TCCAAGCTTCTACGCAGTGCACATGCGGAT-3'。FeIFN-γ引物序列，F(xiàn):5'-TTGGTGGATCCTATTACTGTCAGGCCATGTTTT-3'，R:5'-TCCAAGCTTTCAAGATGACGCCAGGTCTCC-3'，并分別通過(guò)引物引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 25 s，56 ℃ 25 s，72 ℃ 35 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。接著，將PCR擴(kuò)增后的FeIFN-ω和FeIFN-γ的產(chǎn)物經(jīng)雙酶切(BamH Ⅰ/Hind Ⅲ)后回收目的基因片段，同時(shí)酶切、回收pET28a-SUMO載體片段，用T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切(BamH Ⅰ/Hind Ⅲ)驗(yàn)證后送于測(cè)序，測(cè)序正確后分別命名為pET28a-SUMO-FeIFN-ω和pET28a-SUMO-FeIFN-γ。

1.2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析 將重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-FeIFN-ω和pET28a-SUMO-FeIFN-γ分別轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞，用高溫消毒的涂菌棒將轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素(Kanamycin，Kan+)抗性的LB平板，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱12 h～16 h。之后挑取克隆菌落，接種于3 mL含Kan+的LB培養(yǎng)液中，用搖床以220 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。次日以1∶100轉(zhuǎn)接入100 mL含Kan+的LB培養(yǎng)液中，于37 ℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2 h，使菌液對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD 600 nm值達(dá)到0.6～0.8，取1 mL未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液作為對(duì)照，接著往剩余菌液中加入IPTG，終濃度為1 mmol/L，在16 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)10 h后以8 000 r/min離心10 min收集菌體，棄去上清后的菌體沉淀加10 mL結(jié)合緩沖液(50 mmol/L NaHPO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0)，使用移液器反復(fù)吹打，使菌體重懸，結(jié)束后加入PMSF。將重懸后的菌液超聲破碎，全程置于冰盒上工作，超聲3 s，停頓4 s，功率220 W，以菌液變得清澈透亮為準(zhǔn)，超聲結(jié)束后將菌液以10 000 r/min離心10 min左右。收集上清、沉淀制備樣品，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.4 SUMO-FeIFN-ω和SUMO-FeIFN-γ融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的篩選 在培養(yǎng)管中以1∶100加入菌液和含Kan+的LB液體培養(yǎng)液中，于16 ℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD 600 nm值到0.6～0.8時(shí)即可。將各培養(yǎng)管分別按IPTG濃度梯度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol/L)，誘導(dǎo)溫度(37、30、22、16 ℃)，時(shí)間梯度(3、6、9、12、15、18、21、24 h)進(jìn)行表達(dá)條件的篩選，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.5 SUMO-FeIFN-ω和SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的表達(dá)和純化 在確定最佳條件后擴(kuò)大培養(yǎng)菌液。將誘導(dǎo)、超聲后的上清用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行純化。首先將Ni親和層析柱用蒸餾水清洗，并用結(jié)合緩沖液平衡多次，接著將濾液加入層析柱后置于振蕩器結(jié)合，在室溫結(jié)合2 h，以0.5 mL/min～1 mL/min的流速收集流穿液；將層析柱的液體用洗滌緩沖液(50 mmol/L NaHPO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 8.0)以1 mL/min的流速清洗Ni柱，大約8倍～10倍柱體積的用量去除雜蛋白；最后用5倍～10倍柱體積的洗脫緩沖液(50 mmol/L NaHPO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，pH 8.0)以0.5 mL/min～1 mL/min的流速洗脫層析柱上的蛋白，收集的樣品均要置于冰上，最后用SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.6 SUMO-FeIFN-ω和SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的酶切和純化 將SUMO蛋白酶以1∶10比例加入融合蛋白液，4 ℃條件下酶切，分別收集不同時(shí)間段(3、6、9、12 h)的酶切產(chǎn)物。使用Millipore公司生產(chǎn)的30 ku截留柱和10 ku截留柱對(duì)2種酶切后的蛋白進(jìn)行脫鹽、濃縮和純化。根據(jù)試劑盒說(shuō)明，首先將酶切后的蛋白和交換buffer(50 mmol/L NaHPO4，300 mmol/L NaCl，pH 8.0，經(jīng)0.22 μm超濾膜超濾)混勻，在30 ku截留柱中加入3 mL蛋白，使用水平離心機(jī)以4 ℃、3 000 r/min離心10 min，再將3 mL交換buffer加入截留柱，濃縮到200 μL～500 μL，重復(fù)多次后收集每一次的流穿液，然后將流穿液依次加入到10 ku的截留柱中，每次3 mL，直至將上述流穿液全部加完，最后截留剩余體積大約為500 μL，即為去掉SUMO標(biāo)簽的目的蛋白。用SDS-PAGE電泳檢測(cè)，Bradford測(cè)定法測(cè)定目的蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 FeIFN-ω和FeIFN-γ蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析

通過(guò)SignalP-4.0 Server在線服務(wù)器分析FeIFN-ω和FeIFN-γ兩種蛋白的信號(hào)肽(圖1)。結(jié)果顯示，F(xiàn)eIFN-ω蛋白的信號(hào)肽序列是前23位氨基酸，屬于分泌性蛋白，第23位氨基酸和第24位氨基酸可能為信號(hào)肽的切割位點(diǎn)；FeIFN-γ蛋白的信號(hào)肽序列是前20位氨基酸，屬于分泌性蛋白，第20位氨基酸和第21位氨基酸可能為信號(hào)肽的切割位點(diǎn)。

A.FeIFN-ω；B.FeIFN-γ

2.2 FeIFN-ω和FeIFN-γ蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析

用Protparam在線服務(wù)器分析FeIFN-ω和FeIFN-γ兩種蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果表明，F(xiàn)eIFN-ω蛋白含有196個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為21.4 ku(去除信號(hào)肽為18.2 ku)，等電點(diǎn)為6.96，總體親水性平均值為-0.007；FeIFN-γ蛋白含有167個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為19.6 ku(去除信號(hào)肽為17.3 ku)，等電點(diǎn)為9.1，總體親水性平均值為-0.483。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)FeIFN-ω基因和FeIFN-γ基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果顯示，獲得的特異性目標(biāo)條帶大小分別約為522 bp和444 bp(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符。

A.FeIFN-ω;B.FeIFN-γ;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.陰性對(duì)照;2.樣品

2.4 重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-FeIFN-ω和pET28a-SUMO-FeIFN-γ的雙酶切鑒定

經(jīng)BamH Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切2 h后，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-FeIFN-ω在大約5 633 bp和522bp處出現(xiàn)2個(gè)條帶；重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ在大約5 633 bp和444 bp處出現(xiàn)2個(gè)條帶(圖3)，與預(yù)期結(jié)果相符。

A.pET28a-SUMO-FeIFN-ω;B.pET28a-SUMO-FeIFN-γ;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.重組質(zhì)粒;2.重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物A.pET28a-SUMO-FeIFN-ω;B.pET28a-SUMO-FeIFN-γ;M.DNA Marker DL 5 000;1.Recombinant plasmid;2.Recombinant plasmid digested by BamH Ⅰ/Hind Ⅲ

2.5 重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-FeIFN-ω和pET28a-SUMO-FeIFN-γ的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析結(jié)果

將構(gòu)建好的pET28a-SUMO-FeIFN-ω和pET28a-SUMO-FeIFN-γ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，將菌體超聲裂解，超聲時(shí)長(zhǎng)大約20 min時(shí)菌液變得清澈透亮，分別取蛋白上清和沉淀制樣，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后出現(xiàn)了明顯的表達(dá)條帶(圖4)，大小約為35 ku和34 ku，且上清中的條帶明顯大于沉淀，說(shuō)明融合蛋白以可溶性形式在大腸埃希氏菌中得到了表達(dá)。

A.pET28a-SUMO-FeIFN-ω;B.pET28a-SUMO-FeIFN-γ;M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.重組菌誘導(dǎo)前產(chǎn)物；2.重組菌誘導(dǎo)后產(chǎn)物；3.重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物上清；4.重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物沉淀A.pET28a-SUMO-FeIFN-ω;B.pET28a-SUMO-FeIFN-γ;M.Protein molecular weight Marker;1.Recombinant bacteria pre-induction products;2.Recombinant bacteria induced products;3.Supernatant of the recombinant bacteria induced product;4.Precipitate of the recombinant bacteria induced products

2.6 SUMO-FeIFN-ω和SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果

為了優(yōu)化融合蛋白表達(dá)條件，設(shè)置不同的誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)溫度的對(duì)照組，分別誘導(dǎo)之后收集菌體并制樣，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖5)，在IPTG終濃度分別為0.6 mmol/L、0.8 mmol/L時(shí)，2種融合蛋白即可獲得較高表達(dá)量；使用最佳濃度的IPTG時(shí)，在16 ℃時(shí)誘導(dǎo)2種融合蛋白的表達(dá)量明顯高于其他溫度時(shí)的表達(dá)水平；同樣在16 ℃誘導(dǎo)條件下，2種融合蛋白表達(dá)量分別在6 h和9 h 時(shí)達(dá)到最高，之后隨著時(shí)間的遞增趨于穩(wěn)定，再無(wú)明顯增多。所以確定2種融合蛋白最佳表達(dá)條件分別為：SUMO-FeIFN-ω融合蛋白加入IPTG終濃度為0.6 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)量最高；SUMO-FeIFN-γ融合蛋白加入IPTG終濃度為0.8 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)9 h時(shí)表達(dá)量最高。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A～C.pET28a-SUMO-FeIFN-ω ;A1～A9.以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L的IPTG濃度誘導(dǎo)的重組菌產(chǎn)物；B1～B4.37 ℃、30 ℃、22 ℃、16 ℃誘導(dǎo)的重組菌產(chǎn)物；C1～C9.重組菌誘導(dǎo)0、3、6、9、12、15、18、21、24 h的產(chǎn)物；D～F.pET28a-SUMO-FeIFN-γ; D1～D9.以0、0.2、0.4、0.6 mmol/L、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol/L的IPTG濃度誘導(dǎo)的重組菌產(chǎn)物；E1～E4.37 ℃、30 ℃、22 ℃、16 ℃誘導(dǎo)的重組菌產(chǎn)物；F1～F9.重組菌誘導(dǎo)0、3、6、9、12、15、18、21、24 h的產(chǎn)物

2.7 SUMO-FeIFN-ω和SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的純化結(jié)果

以摸索的最佳條件大量表達(dá)2種融合蛋白，將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體離心、重懸、冰浴超聲破碎，之后收集上清液，通過(guò)1.2.5的步驟純化蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表明，洗脫得到的2種融合蛋白分別在35 ku和34 ku處出現(xiàn)清晰的單一條帶(圖6)。

A.SUMO-FeIFN-ω;B.SUMO-FeIFN-γ;M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.樣品A.SUMO-FeIFN-ω;B.SUMO-FeIFN-γ;M.Protein molecular weight Marker;1.Sample

2.8 SUMO-FeIFN-ω和SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的酶切分析和純化結(jié)果

用SUMO蛋白酶切割純化后的2種融合蛋白，結(jié)果表明在4 ℃條件下酶切6 h后，去標(biāo)簽蛋白的量隨著時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)顯著增多(圖7)，所以選擇酶切6 h即可。酶切后通過(guò)1.2.6的步驟純化出的蛋白即為去除SUMO標(biāo)簽的FeIFN-ω和FeIFN-γ蛋白，用SDS-PAGE檢測(cè)表明獲得了純度較高且無(wú)雜蛋白的目的蛋白，去除SUMO標(biāo)簽后蛋白條帶大小分別約為18 ku和17 ku，與預(yù)期結(jié)果相符。利用Bradford測(cè)定法以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測(cè)得FeIFN-ω和FeIFN-γ蛋白含量分別為0.79 mg/mL和0.85 mg/mL。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A1～A6.SUMO蛋白酶；酶切SUMO-FeIFN-ω融合蛋白3、6、9、12、0 h；B1～B6.SUMO蛋白酶；酶切SUMO-FeIFN-γ融合蛋白3、6、9、12、0 h；C1～C5.SUMO-FeIFN-ω融合蛋白濃縮后截留液(30 ku截留柱)；酶切SUMO-FeIFN-ω融合蛋白6 h；SUMO-FeIFN-ω融合蛋白截留液(30 ku截留柱)；SUMO-FeIFN-ω融合蛋白流穿液(30 ku截留柱)；FeIFN-ω蛋白截留液(10 ku截留柱)；D1～D5.SUMO-FeIFN-γ融合蛋白濃縮后截留液(30 ku截留柱)；酶切SUMO-FeIFN-γ融合蛋白6 h；SUMO-FeIFN-γ融合蛋白截留液(30 ku截留柱)；SUMO-FeIFN-γ融合蛋白流穿液(30 ku截留柱)；FeIFN-γ蛋白截留液(10 ku截留柱)

3 討論

干擾素作為機(jī)體重要的防疫系統(tǒng)成員能夠?qū)共《靖腥?，防止病毒在體內(nèi)快速擴(kuò)散，而體外表達(dá)的干擾素與天然干擾素具有高度相似的生物學(xué)活性[16,18]。所以體外表達(dá)的貓干擾素有望增強(qiáng)寵物貓的免疫力，降低患病率和病死率。干擾素ω首先在人類中被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已鑒定出在貓、兔、牛和豬的基因組中均存在著有功能的IFN-ω[15]。1985年，IFN-ω基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)而且認(rèn)為該家族至少有4個(gè)成員，2007年楊利敏等研究貓干擾素ω并對(duì)其可溶性表達(dá)進(jìn)行初步研究[19-20]。但這些已報(bào)道的文獻(xiàn)中，貓干擾素ω在大腸埃希氏菌中主要以不可溶的包涵體形式表達(dá)。IFN-γ作為新的基因產(chǎn)品，其優(yōu)點(diǎn)是毒性小、抗原性弱并可多次利用，在抗腫瘤細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮主要作用，而將IFN-γ作為佐劑給動(dòng)物免疫時(shí)，可以增強(qiáng)機(jī)體的抵抗能力，表明IFN-γ在作為治療制劑或疫苗佐劑使用時(shí),能夠取得良好效果，也有研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ能夠誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá)[15,21]。目前IFN-γ已廣泛應(yīng)用于治療牛、羊、豬的疾病，而有關(guān)貓IFN-γ的研究和應(yīng)用鮮見(jiàn)報(bào)道。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)。對(duì)信號(hào)肽的預(yù)測(cè)可為表達(dá)前的引物設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建提供有價(jià)值信息[22]，分泌蛋白可能具備正常功能的前提是在其前體合成時(shí)需要去除信號(hào)肽段。本研究克隆不包含信號(hào)肽的成熟蛋白基因序列，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)和純化。大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)水平高、操作簡(jiǎn)便、容易培養(yǎng)和控制等優(yōu)點(diǎn)，但表達(dá)過(guò)程中目的蛋白容易形成包涵體，而非天然構(gòu)象的功能蛋白需要重新折疊復(fù)性才能獲得其原有的生物活性，所以有必要表達(dá)能夠直接折疊正確的可溶性蛋白。本研究中使用了帶有SUMO助溶標(biāo)簽的pET28a-SUMO表達(dá)載體，從而實(shí)現(xiàn)了兩種目的蛋白的可溶性表達(dá)。該表達(dá)載體是將pET28a進(jìn)行改造使其在N端His標(biāo)簽后融合一個(gè)SUMO標(biāo)簽，可以提高外源蛋白的可溶性表達(dá)水平，促進(jìn)其正確折疊且具備生物學(xué)活性[23]，使純化步驟更為簡(jiǎn)便。

對(duì)動(dòng)物干擾素進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了基因本身的序列影響表達(dá)量外，誘導(dǎo)表達(dá)條件(如誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度等)同樣重要[24]，所以要將表達(dá)條件作為關(guān)鍵部分進(jìn)行優(yōu)化和分析。誘導(dǎo)劑IPTG有細(xì)胞毒性，高濃度的IPTG可能會(huì)誘導(dǎo)融合蛋白快速、大量表達(dá)而形成包涵體[25]。本研究表明與未加入IPTG誘導(dǎo)劑相比，使用IPTG誘導(dǎo)劑的表達(dá)量明顯增多，但當(dāng)IPTG的終濃度分別為0.6 mmol/L、0.8 mmol/L時(shí)，2種融合蛋白的表達(dá)水平達(dá)到最高，之后便趨于穩(wěn)定；低溫能夠減慢蛋白合成的速率，改變多肽折疊的動(dòng)力學(xué)，增加蛋白的正確折疊[26]。本研究表明相同誘導(dǎo)條件下，16 ℃誘導(dǎo)時(shí)2種融合蛋白表達(dá)量最高，這與文獻(xiàn)報(bào)道的降低溫度可獲得融合蛋白的可溶性表達(dá)一致[27]；低溫下大腸埃希氏菌生長(zhǎng)緩慢，一般選擇通過(guò)延長(zhǎng)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間來(lái)增加蛋白表達(dá)量，但隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，菌體的生長(zhǎng)會(huì)趨于停滯，蛋白的表達(dá)不會(huì)再明顯增加[26]。本研究表明在16 ℃誘導(dǎo)下，2種融合蛋白表達(dá)量分別在6 h和9 h時(shí)達(dá)到最高，之后隨著時(shí)間的遞增變化并不顯著。所以確定最終能夠獲得2種融合蛋白高表達(dá)量的條件為：SUMO-FeIFN-ω融合蛋白使用IPTG的終濃度為0.6 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)6 h；SUMO-FeIFN-γ 融合蛋白使用IPTG的終濃度為0.8 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)9 h。進(jìn)一步說(shuō)明通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度和控制IPTG濃度、選擇合適的載體和表達(dá)宿主菌、優(yōu)化融合標(biāo)簽等方法可提高融合蛋白的可溶性表達(dá)[28]。本研究實(shí)現(xiàn)了2種融合蛋白的可溶性表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化后用SUMO蛋白酶在4 ℃條件下酶切6 h去除SUMO標(biāo)簽，再經(jīng)過(guò)2次截留柱純化后得到不含標(biāo)簽的FeIFN-ω和FeIFN-γ，為后期抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。