張艷芳，李 鵬，潘耀謙*，劉興友*

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007； 2.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是人類消化道常見(jiàn)的致命性惡性腫瘤，在全球發(fā)病率很高，死亡率位列惡性腫瘤的第3位，每年因CRC死亡的人數(shù)高達(dá)50萬(wàn)，對(duì)人類健康的危害很大[1]。導(dǎo)致CRC發(fā)生的病因很多，但近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)改變，特別是菌群失調(diào)在CRC發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[2-4]。人類腸道有一個(gè)數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，包括細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)等，其中細(xì)菌占據(jù)主要地位，約有1 000余種。據(jù)報(bào)道，成人腸道系統(tǒng)中至少有100萬(wàn)億個(gè)微生物，質(zhì)量約為1.5 kg，是人體細(xì)胞總數(shù)的10倍，其編碼的基因數(shù)目是人類基因的150倍。這些微生物群與腸道黏膜免疫系統(tǒng)等組成復(fù)雜的腸道微生態(tài)。一旦微生態(tài)平衡被打破，就會(huì)引起腸道疾病和腫瘤的發(fā)生。近年來(lái)[5-7]，通過(guò)基因組序列檢測(cè)、宏基因組學(xué)及高通量測(cè)序技術(shù)運(yùn)用，不僅發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的腸道微生態(tài)的破壞，腫瘤組織和周圍正常組織的菌群存在很大差異(前者是后者的250倍，而CRC組織中的數(shù)量更是高達(dá)1 000倍以上)，而且還揭示具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)數(shù)量與CRC的發(fā)生有密切關(guān)系。最近的一些研究[8-10]證明，具核梭桿菌在改變的結(jié)直腸微生態(tài)中異常活躍，是誘發(fā)結(jié)直腸癌重要病因。迄今為止，具核梭桿菌促進(jìn)CRC發(fā)生和發(fā)展的作用機(jī)理還不清楚。作者查閱了大量有關(guān)文獻(xiàn)，就具核梭桿菌促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)理做一綜述。

1 具核梭桿菌對(duì)結(jié)腸和CRC組織固有免疫細(xì)胞的抑制作用

固有免疫(innate immunity)是機(jī)體在種系發(fā)育和進(jìn)化過(guò)程中形成的一系列天然免疫防御功能，在啟動(dòng)及調(diào)節(jié)特異性免疫方面發(fā)揮重要作用，而且對(duì)機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)也起著不可忽視的作用。具核梭桿菌對(duì)固有免疫細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用[11]，從而影響了機(jī)體對(duì)CRC特異性免疫的形成。

1.1 具核梭桿菌對(duì)髓源性免疫細(xì)胞的影響

Kostic等在CRC小鼠模型中發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌能增強(qiáng)腫瘤負(fù)荷、促炎標(biāo)志物和髓系免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，特別是CD11b+細(xì)胞，包括樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞。Castellarin等的研究表明，CD11b+骨髓細(xì)胞在促進(jìn)腫瘤發(fā)展和血管生成中起關(guān)鍵作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages，TAMs)可通過(guò)產(chǎn)生介質(zhì)(如表皮生長(zhǎng)因子和促血管生成素)等來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。灌注具核梭桿菌的小鼠在腫瘤微生態(tài)環(huán)境中增加了TAMs種群(是正常組織的7.8倍)，并導(dǎo)致對(duì)CD4+T細(xì)胞的抑制，影響了適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生。血管生成為腫瘤細(xì)胞提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以促進(jìn)其進(jìn)一步生長(zhǎng)和發(fā)展[12]。促進(jìn)血管生成的條件有很多，比如缺氧。組織器官在缺氧的條件下[13]，缺氧誘導(dǎo)因子1 (hypoxia inducible factor 1,HIF 1))可增加血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptors,VEGFRs)。Mendes等的研究也獲得了相同結(jié)果，即用具核梭桿菌感染上皮細(xì)胞通過(guò)上調(diào)VEGF和VEGFR1/2而增加血管生成。低氧和HIF1在腫瘤微生態(tài)環(huán)境中的另一作用與促進(jìn)骨髓源性抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells，MDSCs)的形成有關(guān)，MDSCs在腫瘤中起免疫抑制細(xì)胞的作用[14]。已有研究表明，MDSCs可減少T細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤(rùn)，阻止T細(xì)胞對(duì)CRC細(xì)胞的侵?jǐn)_，并通過(guò)增加基質(zhì)金屬蛋白酶-9而增加血管生成和維持干細(xì)胞的特性。Toor等證明，灌注具核梭桿菌小鼠的MDSCs和腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor associated neutrophils，TANs)的數(shù)量增多。MDSCs能生成高水平的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和精氨酸酶-1，表明它們可通過(guò)抑制T細(xì)胞而幫助癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃避，而TANs也參與了腫瘤的發(fā)展、血管生成和轉(zhuǎn)移。另外，給小鼠灌注具核梭桿菌改變了腸道微生態(tài)后，局部組織中增加的另一種髓系免疫細(xì)胞是CD103+調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞。這些細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)Foxp3+功能，而抑制T細(xì)胞的表達(dá)從而減弱了抗腫瘤免疫。

總之，具核梭桿菌通過(guò)改變結(jié)直腸的微生態(tài)環(huán)境，抑制各種髓源性免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展，并通過(guò)抑制T細(xì)胞來(lái)干擾特異性免疫的形成。

1.2 具核梭桿菌對(duì)NK細(xì)胞的抑制作用

具核梭桿菌可通過(guò)抑制自然殺傷(natural killing，NK)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用來(lái)協(xié)助CRC細(xì)胞逃逸免疫殺傷[15-16]。NK細(xì)胞屬于固有免疫系統(tǒng)，有2種受體類型,即激活受體和抑制受體。激活受體可以與腫瘤蛋白、病毒成分、自身分子和應(yīng)激誘導(dǎo)分子結(jié)合，并將之消除。而抑制受體則導(dǎo)致NK細(xì)胞功能降低。T細(xì)胞免疫球蛋白及免疫受體酪氨酸抑制基序(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif [ITIM] domain，TIGIT)是一種作用于NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的抑制性受體，與配體結(jié)合后可通過(guò)細(xì)胞質(zhì)域、ITIM和免疫受體尾部酪氨酸樣基序啟動(dòng)對(duì)信號(hào)的抑制，使NK細(xì)胞活性降低。研究表明[17]，具核梭桿菌與人的TIGIT (hTIGIT)受體在NK細(xì)胞上相互作用，可啟動(dòng)抑制性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。從CRC患者組織中分離的帶有具核梭桿菌的細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)證明具核梭桿菌通過(guò)激活hTIGIT來(lái)抑制NK細(xì)胞。

2 具核梭桿菌特異性毒性因子對(duì)CRC發(fā)生的影響

具核梭桿菌的毒性因子可通過(guò)調(diào)整結(jié)直腸的微生態(tài)或改變細(xì)胞的信號(hào)通路，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化或突變，進(jìn)而出現(xiàn)癌變傾向、免疫逃避和癌變。具核梭桿菌可以產(chǎn)生3種特異性毒性因子，即侵襲細(xì)胞的梭桿菌黏附素A(Fusobacteriumadhesin A，F(xiàn)adA)、毒害細(xì)胞的凝集素，即梭桿菌自動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)蛋白2(Fusobacteriumautotransporter protein 2，F(xiàn)ap2)和外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)。這3種毒力因子可相互作用于腸上皮細(xì)胞，并在其他一些因素的參與下，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞突變和腫瘤形成。

2.1 黏附素FadA的毒性作用

FadA毒力因子既可協(xié)助具核梭桿菌對(duì)腸上皮或CRC細(xì)胞的黏附和侵害，又能激活細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而促進(jìn)腸上皮突變。Sun G H等[6,9,11]發(fā)現(xiàn)了具核梭桿菌的FadA毒力因子，有利于其黏附和侵入包括CRC細(xì)胞在內(nèi)的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，加速了CRC患者腸上皮細(xì)胞的細(xì)菌性癌變。FadA是具核梭桿菌產(chǎn)生的高度保守的毒力因子，主要以兩種形式存在，即前體非分泌型FadA(pre-FadA)和成熟的分泌型FadA(mFadA)。pre-FadA定位于內(nèi)膜中，只能溶于酸性胞質(zhì)中，而mFadA主要存在于菌體胞膜表面，可溶于酸性和中性胞質(zhì)中。當(dāng)pre-FadA和mFadA在中性胞質(zhì)中彼此分開(kāi)時(shí)，它們呈失活狀態(tài)，并不表達(dá)功能。一旦胞質(zhì)變成酸性時(shí)兩者即可結(jié)合在一起，形成FadA復(fù)合物(FadAc)。FadAc具有強(qiáng)烈的活性，是具核梭桿菌黏附和侵入宿主上皮細(xì)胞并表達(dá)功能的活性毒力因子。

據(jù)認(rèn)為[18]，具核梭桿菌通過(guò)其菌膜上的FadA與宿主腸上皮細(xì)胞接觸，激活了上皮細(xì)胞的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路。在健康人的上皮細(xì)胞中，β-catenin只是作為一種細(xì)胞骨架蛋白，在胞膜處與鈣黏附蛋白(E-cadherin)形成復(fù)合體，借以維持同型細(xì)胞的特性，防止細(xì)胞的移動(dòng)和變態(tài)。只有當(dāng)細(xì)胞外Wnt信號(hào)分子及其配體與細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合后，才能啟動(dòng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路。業(yè)已發(fā)現(xiàn)在具核梭桿菌陽(yáng)性CRC組織中不僅Wnt及其物質(zhì)過(guò)量表達(dá)，而且顯示出更高水平的β-catenin。據(jù)認(rèn)為[19]，F(xiàn)adA具有Wnt信號(hào)分子配體的作用。當(dāng)FadA激活Wnt信號(hào)分子并與細(xì)胞膜上的特異性受體卷曲蛋白(Frizzled，F(xiàn)rz)結(jié)合后，即可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，使其下游靶基因，如 c-myc、cyclin D1和WISP等轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化和突變。在這一通路中具有兩種至關(guān)重要的致癌基因，即c-myc和cyclin D1，它們都有相關(guān)的下游效應(yīng)，均能有力地促進(jìn)癌細(xì)胞的生存與發(fā)展。c-myc能誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞形態(tài)變化，增強(qiáng)細(xì)胞的非錨定依賴生長(zhǎng)能力;而Cyclin D1在從G0/G1期到S期的轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用，在許多癌癥中均呈現(xiàn)上調(diào)。研究表明，CRC患者中cyclin D1癌基因表達(dá)增加[20]，其過(guò)表達(dá)與CRC患者的預(yù)后不良有關(guān)。此外，在人類結(jié)腸癌和正常鄰近組織標(biāo)本中，CRC患者fadA基因表達(dá)升高。因此，有人認(rèn)為FadA基因表達(dá)水平有望成為結(jié)腸癌診斷和預(yù)后判斷的參考指標(biāo)。

2.2 凝集素Fap2的毒性作用

Fap2主要通過(guò)兩種方式對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，一是通過(guò)凝集作用使具核梭桿菌與上皮細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致上皮細(xì)胞損傷或突變；二是抑制固有免疫細(xì)胞的活性，發(fā)揮具核梭桿菌致病作用。研究發(fā)現(xiàn)[1-2,6]具核梭桿菌產(chǎn)生的Fap2蛋白通過(guò)與CRC中過(guò)表達(dá)的D-半乳糖-β(1，3)-N-乙酰-D-半乳糖胺(D-galactose-β(1,3) -N-acetyl-D-galactosamine,Gal-GalNAc)結(jié)合，在介導(dǎo)CRC中的細(xì)菌富集和細(xì)胞的突變過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，他們用O-glycanase抑制Gal-GalNAc的表達(dá)，從而減輕具核梭桿菌在CRC中的積累。Casasanta M A等[21]證明Fap2可介導(dǎo)具核梭桿菌與小鼠CRC細(xì)胞特異性結(jié)合，并且Gal-GalNAc在CRC細(xì)胞中呈高水平表達(dá)。如果抑制Fap2或宿主上皮Gal-GalNAc的表達(dá)則可阻止具核梭桿菌誘發(fā)的CRC形成?？傊現(xiàn)ap2是具核梭桿菌產(chǎn)生的可與上皮細(xì)胞生成的Gal-GalNAc相互識(shí)別的特異性凝集素，能夠引起具核梭桿菌與CRC中過(guò)表達(dá)的Gal-GalNAc特異性結(jié)合。另外，產(chǎn)生Fap2的具核梭桿菌還可通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入結(jié)直腸，定植在腸上皮或腫瘤上，改變其微生態(tài)環(huán)境，從而引起上皮的突變或促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

另外，具核梭桿菌的Fap2還能與TIGIT分子結(jié)合，抑制適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生。研究證明，除NK細(xì)胞外，其他腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞，包括CD4+和CD8+T細(xì)胞，均表達(dá)TIGIT受體。Gur等曾證明具核梭桿菌通過(guò)Fap2介導(dǎo)的TIGIT相互作用，可抑制T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。具核梭桿菌抑制蛋白可使人的T細(xì)胞在細(xì)胞周期的G1期發(fā)生阻滯。具核梭桿菌這種從不同的方面抑制具有特異性免疫作用細(xì)胞的活性，干擾了適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生，從而有利于癌細(xì)胞的分化，生長(zhǎng)，并能促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

2.3 外膜囊的毒性作用

眾所周知[22]，革蘭氏陰性細(xì)菌能夠分泌一種毒性因子的傳遞系統(tǒng)，即OMVs。具核梭桿菌表面的蛋白和FadA可促進(jìn)OMVs與宿主上皮細(xì)胞相互作用，并借助OMVs內(nèi)蛋白酶來(lái)降解腸上皮細(xì)胞膜的E-cadherin。E-cadherin是一種緊密連接蛋白，可促進(jìn)細(xì)菌入侵和誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。此外，來(lái)自具核梭桿菌的OMVs還可誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，成為腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要途徑。具核梭桿菌和OMVs都能上調(diào)EMT標(biāo)記物，包括E-cadherin、整合素抑制因子(integrin inhibitor )、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)和纖連蛋白1(fibronectin-1)。Yan等也證明在帶有EMT標(biāo)記物和腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)標(biāo)記的CRC Ⅲ/Ⅳ期患者之間，具核梭桿菌水平呈現(xiàn)正相關(guān)，并認(rèn)為具核梭桿菌可能在EMT- CSCs交互過(guò)程中促進(jìn)CRC的發(fā)展。另外，Melinda A等[23]證明，具核梭桿菌的OMVs還有促進(jìn)IL-8和TNF的分泌，具有誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的作用。

3 具核梭桿菌的促癌性miRNA形成

研究證明[24-25],在APCmin/+小鼠模型試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌感染CRC細(xì)胞后，激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路，導(dǎo)致miRNA21 表達(dá)增加，而該miRNA可以增強(qiáng)CRC細(xì)胞的侵襲活性并形成異種移植腫瘤。該臨床研究顯示，腫瘤組織中同時(shí)具有大量具核梭桿菌DNA和miRNA21患者的預(yù)后較差。Hur K等[26]證明有多種miRNAs在CRC的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用，其中一些還被用作CRC診斷和進(jìn)展的生物標(biāo)志物。Shi等證明miRNA 21在腸道慢性炎癥和結(jié)腸炎相關(guān)CRC的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。Yang Y等[24]在體內(nèi)外研究了具核梭桿菌在CRC進(jìn)展中的作用及其機(jī)制，報(bào)道了用具核梭桿菌對(duì)CRC細(xì)胞株的處理，增加了細(xì)胞的增殖和侵襲，而具核梭桿菌對(duì)APCMin/+小鼠的作用則增加了腫瘤數(shù)量、腫瘤負(fù)荷和腫瘤大小。用具核梭桿菌處理CRC細(xì)胞株后，芯片分析顯示657個(gè)miRNAs中，有50個(gè)miRNAs上調(diào)，52個(gè)miRNAs下調(diào)，其中miRNA 21表達(dá)率最高。因此，miRNA 21被認(rèn)為是與具核梭桿菌誘發(fā)CRC的miRNA，有可能成為檢測(cè)CRC的標(biāo)志。

另外，進(jìn)一步的調(diào)查顯示[27]，RASA1屬于RAS GTPase激活蛋白家族，是miRNA 21的直接靶標(biāo)，抑制miRNA 21可增加RASA1表達(dá)。RASA1可以與RAS癌蛋白結(jié)合并使其失活。因此，miRNA 21可能是具核梭桿菌促進(jìn)生成的有助瘤生長(zhǎng)的miRNA。Yang Y等[24]提出了具核梭桿菌可以激活腸上細(xì)胞TLR4/MYD88/NF-κB信號(hào)通路，借以調(diào)節(jié)miRNA 21的表達(dá)。

4 具核梭桿菌性促炎因子對(duì)CRC細(xì)胞的影響

據(jù)Nasser H G等[16,28-29]報(bào)道，具核梭桿菌與其他引起腸道腫瘤相關(guān)的細(xì)菌不同，它不能直接引起腸管的炎性反應(yīng)，不會(huì)加劇結(jié)腸炎、腸炎或炎癥相關(guān)的腸道病變，但由它刺激產(chǎn)生的促炎因子卻可以加速腫瘤的發(fā)生。暴露于具核梭桿菌的ApcMin/+小鼠的腫瘤，表現(xiàn)出與人類具核梭桿菌陽(yáng)性結(jié)直腸癌相同的促炎表達(dá)特征。然而，在這些小鼠中沒(méi)有觀察到任何腸炎的變化。受試的ApcMin/+小鼠在沒(méi)有任何腸炎或肉眼炎癥的情況下，具核梭桿菌則能加速腫瘤的發(fā)生。

Yang Y等[24]研究表明炎癥因子有助于CRC的發(fā)展。根據(jù)他們對(duì)感染具核梭桿菌小鼠的血清分析，包括 IL-17F、IL-21、IL-22和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3 α(macrophage inflammatory protein 3 alpha，MIP3α)在內(nèi)的炎癥因子呈上調(diào)狀態(tài)。IL-17F、IL-21和IL-22是TH-17細(xì)胞的主要細(xì)胞因子，在腫瘤發(fā)生中具有雙重作用。Jiang等曾報(bào)道IL-17F、IL-21和IL-22在患CRC病人體內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，但在特定條件下，這些因素可發(fā)揮抗腫瘤作用。例如，IL-17F可以抑制促血管生成因子，包括VEGF和前列腺素E2。這些有爭(zhēng)議的影響可能是這些促炎因子由不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生的。Rezasoltani S等[24,30]認(rèn)為TLR識(shí)別配體后可通過(guò)接頭蛋白傳遞細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)，激活 NF-κB 和MAPK途徑[31]，誘導(dǎo)炎癥因子(TNFα、IL-1β、IL-6、IL-12)、血管生成因子、生長(zhǎng)因子，細(xì)胞黏附分子和基質(zhì)降解酶的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。具核梭桿菌產(chǎn)物和髓樣細(xì)胞 TLR 結(jié)合，促進(jìn)炎性因子IL-1、IL-6、IL-22和IL-23的釋放，而IL-23能活化下游TH-17細(xì)胞[32]，后者分泌的IL-17和IL-22可活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)，激活的STAT3可以調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，加速腫瘤血管的形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲。

5 小結(jié)

本文從具核梭桿菌對(duì)固有免疫的抑制作用、特異性毒性因子的致病性、miRNA21的形成及作用和促炎性因子的產(chǎn)生等方面綜述了具核梭桿菌的致病機(jī)理，從中可以發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌是通過(guò)多種途徑引起結(jié)直腸局部的微生態(tài)平衡破壞，從而促進(jìn)腸上皮的轉(zhuǎn)化和突變，誘導(dǎo)CRC細(xì)胞的產(chǎn)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的。