吳昊天,滿(mǎn)初日嘎,王鳳陽(yáng),李 昌,金寧一,陳巧玲*
(1.海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南???570228;2.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長(zhǎng)春 130122)
小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)也稱(chēng)為羊瘟、小反芻獸假性牛瘟、肺腸炎,是一種以山羊、綿羊、鹿、駱駝以及其他野生小反芻動(dòng)物為主要感染對(duì)象的病毒性疾病。近年來(lái)在牛、水牛、牦牛、豬、狗、吸血蠓等多種動(dòng)物體內(nèi)都分離到PPRV或檢測(cè)到過(guò)病毒核酸,或可在實(shí)驗(yàn)條件下人為感染[1]。駱駝和牛已經(jīng)被證實(shí)是PPRV的偶然宿主,感染PPRV的駱駝和牛不會(huì)繼續(xù)傳播PPRV[2]。PPR分為急性型、標(biāo)準(zhǔn)型和溫和型,典型臨床癥狀為發(fā)熱、腹瀉、呼吸困難、口腔與鼻黏膜潰瘍和結(jié)膜炎等[3],急性型患畜出現(xiàn)發(fā)熱和結(jié)膜炎癥狀后便迅速死亡,標(biāo)準(zhǔn)型則會(huì)出現(xiàn)多種典型臨床癥狀,少部分僅有口腔病變的溫和型病羊能夠恢復(fù),多數(shù)會(huì)在發(fā)病后數(shù)天內(nèi)死亡[4]。
PPR是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須報(bào)告的動(dòng)物疫病,在我國(guó)屬于一類(lèi)動(dòng)物疫病。PPR給全球養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的損失。根據(jù)OIE、世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)的數(shù)據(jù),截止2019年5月,全球仍有67個(gè)國(guó)家有PPR流行,這些國(guó)家的小反芻動(dòng)物數(shù)占世界總數(shù)的68%,超3億以飼養(yǎng)小反芻動(dòng)物為生的家庭受PPR直接影響[5]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全球每年因PPR帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)15億~20億美元。我國(guó)周邊國(guó)家如印度、阿富汗、巴基斯坦、尼泊爾等,PPR疫情常年呈地方性流行,給我國(guó)的PPR防控帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
PPR的病原是小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV),為單股負(fù)鏈RNA病毒,屬副黏病毒科、麻疹病毒屬的成員。自然條件下主要感染各類(lèi)小反芻動(dòng)物,人工條件下可以在原代牛和綿羊細(xì)胞以及某些細(xì)胞系(如Vero細(xì)胞和B95a細(xì)胞)中生長(zhǎng)。該病毒感染細(xì)胞3 d~5 d后,會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞出現(xiàn)特定的細(xì)胞病變,最初細(xì)胞呈葡萄簇狀,然后空泡化,細(xì)胞質(zhì)顆粒化,最后形成特異性合胞體。PPRV大小為150 nm~700 nm,由N蛋白、P蛋白和L蛋白相連共同組成的核衣殼復(fù)合體與單股負(fù)鏈無(wú)節(jié)段RNA基因組構(gòu)成。PPRV基因組包含6個(gè)基因,分別編碼核衣殼蛋白N、磷蛋白P、融合蛋白F、基質(zhì)蛋白M、血凝素蛋白H/HN和大蛋白L等6種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)以及C、V兩種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),依次為3′-N-P/C/V-M-F-H/HN-L-5′。其中M、F、H和N 4種蛋白質(zhì)能夠形成PPRV的病毒樣顆粒(VLPs),可誘導(dǎo)山羊產(chǎn)生足夠抵抗PPRV感染的中和抗體[6]。
N蛋白是PPRV最主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一。N蛋白的作用是與M蛋白共同促進(jìn)病毒的組裝,并參與P-L聚合物復(fù)合物形成。PPRV的 N蛋白編碼區(qū)起始于核苷酸位點(diǎn)108(UAC),終止于1 685位點(diǎn)(AUU),蛋白大小為59 ku,其最高免疫活性區(qū)在425-472氨基酸位點(diǎn)。根據(jù)不同毒株間基因相似度可以將N蛋白劃分為4個(gè)區(qū)域,分別為區(qū)域1(氨基酸位點(diǎn)1-120位)、區(qū)域2(氨基酸位點(diǎn)122-145位)、區(qū)域3(146-398位)和區(qū)域4(421-525位),其中區(qū)域3保守性最高,區(qū)域4保守性最低[7]。
P蛋白基因起始于1 807位堿基,編碼大小約60 ku的P蛋白,這段基因序列的替代閱讀框也可以產(chǎn)生C蛋白和V蛋白兩種非結(jié)構(gòu)蛋白。麻疹病毒屬病毒的P蛋白都是磷酸化蛋白,存在5個(gè)保守的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。P蛋白有助于L蛋白的正確折疊。研究表明,P蛋白可以抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子 1 (STAT1)的磷酸化,進(jìn)而阻斷JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑,從而抑制干擾素產(chǎn)生[8]。
M蛋白基因位于3 428-4 445位堿基之間,麻疹病毒屬中高度保守,在屬內(nèi)相似度高達(dá)91%,作用為連接N蛋白與表面糖蛋白。M蛋白還是促進(jìn)PPRV的病毒樣顆粒組裝和釋放的組分[9]。
H蛋白基因位于7 326-9 155位堿基之間,麻疹病毒屬的H蛋白位于囊膜,可將病毒吸附于宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜上。PPRV的H蛋白還具有紅細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶的作用,因此也被稱(chēng)為血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)。H蛋白在PPRV感染山羊的過(guò)程中,可以降低山羊體內(nèi)能夠抑制PPRV復(fù)制的親環(huán)蛋白A(CypA)的水平,從而拮抗山羊的抗病毒反應(yīng)[10]。麻疹病毒屬中H蛋白的保守性極低,是不同種類(lèi)的麻疹病毒細(xì)胞嗜性以及產(chǎn)生的體液免疫不同的主要原因。
F蛋白基因位于5 526-7 166位堿基之間,F(xiàn)蛋白與H/HN蛋白定位于病毒囊膜上,F(xiàn)蛋白的主要作用是在H蛋白協(xié)助下介導(dǎo)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合。在共表達(dá)PPRV的F與H蛋白的Vero-DST細(xì)胞中,F(xiàn)蛋白和H蛋白也能誘導(dǎo)細(xì)胞間形成合胞體[11]。副黏病毒科的F蛋白首先在宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成前體F0蛋白,然后在酶的作用下分解為由二硫鍵相連的F1和F2組成的功能性F蛋白。在PPRV通過(guò)出芽的方式被釋放到細(xì)胞外時(shí),H蛋白以及F蛋白有可能會(huì)殘留在宿主細(xì)胞膜上,這些殘留的蛋白會(huì)作為靶標(biāo)誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)被感染細(xì)胞的抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)[12]。
L蛋白是PPRV中分子質(zhì)量最大的蛋白,與P蛋白一起發(fā)揮RNA聚合酶活性,負(fù)責(zé)基因組RNA的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。L蛋白還能對(duì)病毒mRNA進(jìn)行加帽、甲基化等加工修飾作用。近年的研究確定了L蛋白的RNA三磷酸酶(RTPase)活性的最小結(jié)構(gòu)域,該區(qū)域位于L蛋白C末端,氨基酸位點(diǎn)1 640-1 840之間,這段區(qū)域依賴(lài)于鎂離子或者錳離子發(fā)揮RTPase活性[13]。
PPRV只有一個(gè)血清型,但根據(jù)F基因部分序列和N基因的序列可以進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,其中N基因的分析能夠按照地理來(lái)源將PPRV分類(lèi),F(xiàn)基因偏向于以時(shí)間軸反映PPRV的演化過(guò)程[14]。對(duì)N基因的部分序列分析,可以將PPRV在不同地區(qū)的分離株分為4個(gè)不同的譜系,其中譜系Ⅰ和譜系Ⅱ來(lái)自于西非,譜系Ⅲ來(lái)自于東非、阿拉伯和南印度,譜系Ⅳ來(lái)自于中東、印度等亞洲地區(qū)。
我國(guó)PPR的流行可以根據(jù)時(shí)間大致劃分為三個(gè)階段,分別為2007年-2013年、2013年-2014年以及2014年以后。2007年,在西藏阿里地區(qū)發(fā)現(xiàn)了國(guó)內(nèi)首例PPR,在此之后的幾年疫情通過(guò)混群混牧和引種等方式向東緩慢傳播,并分別于2008年和2010年在西藏那曲和阿里地區(qū)暴發(fā)。2013年-2014年P(guān)PR在全國(guó)各地暴發(fā),形成了一次大流行。2013年新疆伊犁發(fā)生PPR疫情,同年新疆哈密地區(qū)、阿克蘇地區(qū)發(fā)生疫情。2014年1月至3月,甘肅、內(nèi)蒙古、安徽和重慶等地依次暴發(fā)PPR疫情,總體表現(xiàn)為由西向東傳播,到2014年4月,全國(guó)包括西藏、新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、湖南、遼寧、江西、安徽、江蘇和重慶等20個(gè)省、直轄市和自治區(qū)均有報(bào)告PPR疫情[15]。
近年來(lái),PPR在我國(guó)呈散發(fā)流行。2015年-2020年,我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部通報(bào)的疫情一共5起,均發(fā)生于2018年和2020年。其中2020年的2起疫情均為輸入性疫情,涉及新疆、遼寧、湖南、江蘇和青海。PPRV除了在家畜中流行以外,也多次在野生動(dòng)物中發(fā)現(xiàn),2016年在新疆烏魯木齊和庫(kù)車(chē)的北山羊和鵝喉羚種群中發(fā)現(xiàn)PPRV感染,引起7只動(dòng)物死亡[16];2018年在甘肅發(fā)現(xiàn)了野生普氏原羚感染PPRV[17];2019年在青海發(fā)現(xiàn)了野生巖羊感染PPRV[18],這些野生動(dòng)物感染的病例警示了PPRV有在國(guó)內(nèi)形成自然疫源地的風(fēng)險(xiǎn)。2013年11月至2018年11月國(guó)內(nèi)報(bào)道的PPR病例數(shù)為294例。Ma J[19]等將這段時(shí)期內(nèi)的PPR病例劃分為了三個(gè)時(shí)空相關(guān)的分布集群,分別為東北群、華東群和華南群,并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)刈罡珊翟路莸慕涤炅繒?huì)顯著影響PPR暴發(fā)。
聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織于2015年提出了至2030年全球范圍內(nèi)PPR根除計(jì)劃,同年我國(guó)農(nóng)業(yè)部也提出了至2020年國(guó)內(nèi)PPR根除計(jì)劃,按照計(jì)劃,PPR被列入強(qiáng)制免疫疾病。近兩年國(guó)內(nèi)部分省市對(duì)PPRV的血清學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,這些省市的羊場(chǎng)的PPRV血清免疫抗體陽(yáng)性率普遍達(dá)到了國(guó)家規(guī)定的70%以上,部分地方如山東省[20]、江蘇太倉(cāng)市[21]、四川攀枝花市[22]等地區(qū)平均抗體陽(yáng)性率達(dá)到了90%以上,全國(guó)僅有少數(shù)縣市如安徽省蕪湖市及淮南市[23]的部分羊場(chǎng)仍然未能達(dá)標(biāo)。
PPRV在世界范圍內(nèi)主要分布于非洲、中東以及南亞地區(qū),呈現(xiàn)由西向東擴(kuò)散的趨勢(shì)。從PPRV 4個(gè)譜系的流行區(qū)域來(lái)看,譜系Ⅰ主要分布于西非的科特迪瓦、塞內(nèi)加爾和幾內(nèi)亞等國(guó)家;譜系Ⅱ主要分布于西非的加納、尼日利亞、馬里等國(guó)家;譜系Ⅲ主要分布于東非的埃塞俄比亞、蘇丹、索馬里等國(guó)家和阿拉伯半島南部的阿曼和阿聯(lián)酋等國(guó)家;譜系Ⅳ主要分布于北非的阿爾及利亞、埃及等國(guó)家、中東的土耳其、以色列、沙特阿拉伯等國(guó)家、南亞的印度、孟加拉等國(guó)家。我國(guó)流行的PPRV均為譜系Ⅳ,整個(gè)譜系Ⅳ又分為4個(gè)分支,分別是土耳其分支、非洲分支、印度分支和中國(guó)2013年-2017年分支。
在2014年P(guān)PR大暴發(fā)后,我國(guó)多個(gè)省市分離出了PPRV毒株。盛琰翔[24]對(duì)來(lái)自江蘇、西藏、貴州等13個(gè)省份時(shí)間跨度從2013年-2017年的53株P(guān)PRV的全基因組和來(lái)自其他國(guó)家(地區(qū))的16株代表性PPRV毒株的全基因組進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示,這段時(shí)期內(nèi)我國(guó)的PPRV主要來(lái)自于譜系Ⅳ,并且與2007年西藏PPRV毒株同源性最高。根據(jù)王凈等[25]的研究,2013年-2014年P(guān)PRV毒株與2007年西藏PPRV毒株又可以進(jìn)一步劃分到2個(gè)分支中。
PPRV的6個(gè)基因的表達(dá)量、突變速度和突變程度各有不同。2014年-2017年,全國(guó)28個(gè)PPRV毒株中共出現(xiàn)518個(gè)核苷酸突變位點(diǎn),有137個(gè)導(dǎo)致了氨基酸變異,其中L基因突變位點(diǎn)最多,M基因最為保守[24]。6個(gè)基因中,編碼核衣殼蛋白的N蛋白是表達(dá)量最高的,雖然N蛋白不能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生保護(hù)性抗體,但是由于N蛋白可以進(jìn)行原核表達(dá)且表達(dá)量高能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生大量抗體,是血清學(xué)檢測(cè)最常用的抗原。在目前的分子檢測(cè)中N基因也是最常用基因。F基因保守度較高,編碼PPRV主要的保護(hù)性抗原,也可以作為PPRV檢測(cè)的靶基因。M基因是PPRV中最為保守的基因,但是由于麻疹病毒屬內(nèi)該基因同源性較高,少用于PPRV的分子檢測(cè)。H基因是PPRV主要保護(hù)性抗原基因之一,但是保守性低,在PPRV中突變速度最快,也少用于分子檢測(cè)。關(guān)于針對(duì)L基因的檢測(cè)方法目前尚未建立。
RT-PCR和RT-qPCR是目前PPRV分子檢測(cè)最常用的方法,已經(jīng)報(bào)道的RT-PCR和RT-qPCR方法主要針對(duì)的靶基因?yàn)镹、F基因。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《小反芻獸疫診斷技術(shù)》中采用的PPRV分子檢測(cè)方法為針對(duì)N基因的RT-PCR和RT-qPCR。Halecker S等[26]將磁珠提取RNA技術(shù)和RT-qPCR凍干試劑組合成了能夠快速利用RT-qPCR檢測(cè)PPRV的檢測(cè)試劑盒,該試劑盒除了能在30 min~40 min內(nèi)得出結(jié)果外,還能有效區(qū)分PPRV和其他麻疹病毒屬病毒。朱小甫等[27]建立了針對(duì)F基因的RT-nPCR方法,相較于RT-PCR大大提高了檢測(cè)的靈敏度。多項(xiàng)研究將各類(lèi)等溫檢測(cè)技術(shù)如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)應(yīng)用于小反芻獸疫病毒檢測(cè)。這兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)速度快,檢測(cè)條件要求低。Mahapatra M等[28]研發(fā)了針對(duì)PPRV的N基因的RT-LAMP檢測(cè)技術(shù),準(zhǔn)確度與RT-qPCR相當(dāng),而且無(wú)需提取病料的RNA。徐瀅等[29]使用SYBR GreenⅠ對(duì)PPRV的F基因RT-LAMP產(chǎn)物染色,建立了可視化的RT-LAMP檢測(cè)方法,靈敏度高于傳統(tǒng)的RT-PCR。Li Y L等[30]針對(duì)PPRV的N基因開(kāi)發(fā)了實(shí)時(shí)RT-RPA檢測(cè)方法,與RT-qPCR靈敏度和特異性相當(dāng),但更加簡(jiǎn)便快捷。將PPRV的檢測(cè)與其他常見(jiàn)病原的檢測(cè)集成為多重檢測(cè)體系也是研究熱點(diǎn)。霍曉麗等[31]建立了綿羊肺炎支原體與PPRV的雙重RT-PCR檢測(cè)方法;范晴等[32]建立了藍(lán)舌病毒與PPRV的雙重RT-LAMP檢測(cè)方法、王璐瑤等[33]建立了山羊痘病毒與PPRV的雙重PCR檢測(cè)方法。隨著更多前沿的分子檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用,PPRV的分子檢測(cè)正向著快速化、高通量化發(fā)展。
由于PPR帶來(lái)的損失巨大,且PPRV在自然環(huán)境下難以生存且需要密切接觸傳播,而且PPR減毒活疫苗能夠提供針對(duì)所有毒株的長(zhǎng)期保護(hù),具備被根除的條件,我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2015年底制定了全國(guó)PPR消滅計(jì)劃。該計(jì)劃目標(biāo)為到2020年,除毗鄰PPR疫情國(guó)家的陸地邊境縣(團(tuán)場(chǎng))或沿邊境線(xiàn)30 km范圍內(nèi)的免疫隔離帶以外,力爭(zhēng)達(dá)到全國(guó)非免疫無(wú)疫區(qū)標(biāo)準(zhǔn)。自2018年以后我國(guó)沒(méi)有再出現(xiàn)過(guò)本土PPR病例,直到2021年我國(guó)已經(jīng)完成了全國(guó)消滅小反芻獸疫的任務(wù)。OIE和FAO也于2016年宣布了全球根除PPR計(jì)劃,計(jì)劃于2030年前在世界范圍內(nèi)根除PPR。目前世界范圍內(nèi)PPR根除計(jì)劃面臨的主要問(wèn)題為PPR大多流行于非洲和南亞地區(qū)的欠發(fā)達(dá)國(guó)家,沒(méi)有足夠的資金和技術(shù)支持PPR根除計(jì)劃。此外,過(guò)去曾經(jīng)認(rèn)為野生動(dòng)物在PPR傳播中沒(méi)有流行病學(xué)意義,但是越來(lái)越多的研究表明瀕危野生動(dòng)物不但會(huì)受到PPRV威脅,而且在PPRV的傳播中有重要意義[34]。除了我國(guó)多次在野生動(dòng)物中檢測(cè)到PPRV以外,近年來(lái)我國(guó)周邊鄰國(guó)也有在野生動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)PPRV的報(bào)道,2016年-2017年蒙古國(guó)賽加羚羊等野生有蹄類(lèi)種群就暴發(fā)了一次譜系Ⅳ PPRV引起的PPR疫情[35]。要完成全球范圍內(nèi)根除PPR的計(jì)劃,首先是需要進(jìn)一步研究PPRV在野生動(dòng)物中的傳播機(jī)制,防止自然疫源地的形成;其次是需要研發(fā)在欠發(fā)達(dá)國(guó)家或者野外環(huán)境下能夠使用的、穩(wěn)定準(zhǔn)確廉價(jià)易操作的PPRV檢測(cè)方法;已經(jīng)控制和消滅PPR的國(guó)家和地區(qū)要加強(qiáng)境外輸入的防控,仍在流行的國(guó)家和地區(qū)要推進(jìn)疫苗和快速檢測(cè)技術(shù)的推廣。
我國(guó)在2020年以及2021年初西北地區(qū)仍然發(fā)生了輸入型的PPR。輸入型PPR病例的發(fā)生與我國(guó)周邊,尤其是西南鄰國(guó)如印度、孟加拉國(guó)等國(guó)家的PPR持續(xù)流行密切相關(guān)。從這些國(guó)家進(jìn)口的動(dòng)物制品或者活體動(dòng)物有輸入PPRV的風(fēng)險(xiǎn),野生動(dòng)物的遷徙也會(huì)帶來(lái)潛在的PPRV輸入風(fēng)險(xiǎn)。分子流行病學(xué)研究也證明了我國(guó)曾流行的PPRV毒株與這些國(guó)家的PPRV毒株有密切的關(guān)系。鑒于我國(guó)各地養(yǎng)羊場(chǎng)的PPR抗體陽(yáng)性普遍達(dá)標(biāo),且周邊國(guó)家的PPR疫情仍然十分嚴(yán)峻的情況,為了在我國(guó)消滅PPR,目前我國(guó)PPR的預(yù)防與清除措施除了繼續(xù)保持羊群的免疫接種以外,重點(diǎn)應(yīng)放在防止感染動(dòng)物從境外輸入。目前帶毒動(dòng)物的輸入途徑主要為帶毒的野生動(dòng)物越境與家畜接觸和進(jìn)口帶毒家畜。除了加強(qiáng)邊境地區(qū)的畜群管理和野生動(dòng)物遷徙監(jiān)控以外,海關(guān)等檢疫機(jī)構(gòu)需要加強(qiáng)對(duì)PPRV的檢測(cè)力度。研發(fā)更加方便快捷的PPRV檢測(cè)手段對(duì)于海關(guān)、檢疫站以及養(yǎng)殖場(chǎng)動(dòng)物引進(jìn)檢疫都有重要的意義。整合PPR與其他羊常見(jiàn)疾病的綜合檢測(cè)方法目前還有待繼續(xù)研究開(kāi)發(fā)。多種日益成熟的新型檢測(cè)技術(shù)都有應(yīng)用于PPRV檢測(cè)的潛力,如基于各種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)的微流控芯片技術(shù)、基于CRISPR/Cas13a的SHERLOCK檢測(cè)技術(shù)等。結(jié)合各類(lèi)新型技術(shù)開(kāi)發(fā)小型化、快速化、簡(jiǎn)便化、高通量化和數(shù)字化的PPRV檢測(cè)方法是未來(lái)PPRV分子檢測(cè)的發(fā)展方向。