張鳳枰 ， 雷寶良 ， 楊發(fā)樹 ， 宋 濤 ， 吳 芳 ， 盧加文

（1.宜賓學(xué)院，四川宜賓 644000；2.四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司，四川成都 610041；3.通威股份有限公司水產(chǎn)畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點實驗室，四川成都610093；4.通威股份有限公司水產(chǎn)健康養(yǎng)殖四川省重點實驗室，四川成都 610093）

噁唑烷硫酮由R 基團上帶有β-羥基的硫葡萄糖苷經(jīng)酶解再環(huán)化而形成， 是十字花科植物及其近緣植物白花菜科中（如油菜、西蘭花、甘藍等）大量存在的硫代葡萄糖苷的酶解產(chǎn)物 （李鮮等，2006）。 油菜是世界第三大油料作物，2019 年我國油菜籽總產(chǎn)量為1348.47 萬t， 油菜籽制油后產(chǎn)生大約760 萬t 的菜籽餅粕。菜籽餅粕是優(yōu)良的飼料蛋白質(zhì)資源，是飼料中硫代葡萄糖苷的主要來源，硫代葡萄糖苷的含量限制了菜籽餅粕的有效利用。 噁唑烷硫酮具有水溶性，但沒有揮發(fā)性，其能誘發(fā)動物碘缺乏及甲狀腺、肝和腎腫大，降低動物的采食量和生長率，高劑量甚至可以引起死亡。 反芻動物、豬、兔、家禽和魚對飼糧中硫代葡萄糖苷總量的耐受量分別為 1.50 ~ 4.22、0.78、7.00、5.40 μmol/g 和 3.60 μmol/g （董曉芳和佟建明，2013；Martland 等，1984），長期攝入含硫代葡萄糖苷的菜籽粕可造成動物生殖功能受損（Taljaard，1993）。為保證養(yǎng)殖動物健康和生產(chǎn)、人類健康及環(huán)境安全，歐洲議會和歐盟理事會第2002/32/EC 指令、《GB 13078-2017 飼料衛(wèi)生標準》 規(guī)定了飼料原料和飼料產(chǎn)品中噁唑烷硫酮的限量標準。 因此，噁唑烷硫酮的快速準確定量檢測對于菜籽餅粕安全高效利用、保障飼料質(zhì)量安全具有非常重要的意義。 本文根據(jù)菜籽及其加工產(chǎn)品、禽配合飼料、水產(chǎn)配合飼料、濃縮飼料、精料補充料的特點，從白芥子酶用量、酶解條件、樣品質(zhì)量、測定波長的選擇、方法學(xué)考察等方面開展系統(tǒng)研究， 旨在建立紫外分光光度法測定飼料中的噁唑烷硫酮檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和樣品

1.1.1 儀器 Lambda 35 紫外可見分光光度計（PerkinElmer 公司）；CP224S 電子分析天平（Sartorius 公司）；WH-3 微型漩渦混合儀 （上海滬西分析儀器有限公司）；DZKW-4 恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；ZHWY-2112F 恒溫振蕩器 （上海智城分析儀器制造有限公司）；Allegra 64R 冷凍離心機（Beckman Coulter 公司）。

1.1.2 試劑 石油醚（沸程30 ~ 60 ℃）、二氯甲烷、無水乙醇、檸檬酸、磷酸氫二鈉、鹽酸、氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑公司）；商品白芥子酶 （Sigma 公司）；5-乙烯基-噁唑-2-硫酮對照品（HPLC≥98%）（源葉生物公司）；實驗用水為Milli-Q Gradient 超純水。

1.1.3 樣品 白芥種子、油菜籽、菜餅、菜籽粕、池塘養(yǎng)魚配合飼料、草魚配合飼料、魚用膨化配合飼料、肉小雞配合飼料、蛋雞配合飼料、肉大鴨配合飼料、乳豬配合飼料、草蝦膨化配合飼料、產(chǎn)蛋雞濃縮飼料、蛋雞濃縮飼料、奶牛精料補充料、肉羊精料補充料、肉牛精料補充料、成貓糧等樣品，由通威股份有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 白芥子酶的制備 稱取50 g 白芥（Sinapis alba L.）種子（按照 GB/T 5520 做發(fā)芽率實驗，72 h內(nèi)發(fā)芽率須大于85%，保存期不超過兩年）粉碎后，置于500 mL 燒杯中，加入100 mL 石油醚（沸程30 ~ 60 ℃），攪拌 2 min，靜置，棄去上層液體，重復(fù)脫脂10 次，使脂肪含量低于2%，置通風櫥內(nèi)使溶劑揮干，然后再粉碎一次，80%通過0.28 mm實驗篩，裝在密閉容器中，置于－18 ℃ 以下保存，有效期為6 個月。為保證白芥子酶活性，制備過程中環(huán)境溫度須保持在30 ℃以下， 兩次粉碎注意少量多次，防止粉碎機過熱。

1.2.2 試樣溶液制備 平行做兩份實驗。 準確稱取預(yù)先于（103±2）℃干燥至恒重的試樣 0.2 g（精確到 0.0001 g） 置于 10 mL 離心管中， 加入 100 mg 白芥子酶、2.0 mL pH 7.0 緩沖溶液，渦旋混合1 min，置于（35±1.0）℃恒溫水浴中酶解反應(yīng) 120 min； 取出冷卻至室溫， 準確加入2.5 mL 二氯甲烷，渦旋混合1 min，室溫下200 次/min 振蕩提取30 min，于 20 ℃下 5000 r/min 離心 20 min。 準確移取6 mL 無水乙醇于具塞試管中， 用微量移液器準確移取離心管下層有機相溶液50 μL， 加入到裝有無水乙醇的具塞試管中，蓋上塞，渦旋混合1 min，將具塞試管放入恒溫水浴中，（50±1.0）℃下加熱反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，所得溶液為試樣溶液。 同時做空白實驗，除不加試樣外，空白實驗采用與試樣完全相同的步驟。

1.2.3 測定 在儀器最佳條件下， 將試樣溶液加入10 mm 比色皿中，以空白實驗溶液為空白對照，用紫外分光光度計分別于235、245 nm 和255 nm波長處測定試樣溶液的吸光度值。

1.2.4 結(jié)果計算 試樣中噁唑烷硫酮的含量w以質(zhì)量分數(shù)表示，單位為mg/kg（以干基計），按下式計算：

式中：A235、A245、A255分別為試樣溶液在 235、245、255 nm 處的吸光度值；m 為試樣的質(zhì)量；4.42為單位校正吸光度值所代表的5-乙烯基-2-噁唑烷硫酮的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 白芥子酶添加量的選擇 為考察白芥子酶添加量對測定結(jié)果的影響， 選用噁唑烷硫酮含量較高的菜籽粕樣品， 按照1.2.2 制備的白芥子酶、商品白芥子酶（Sigma 公司，批號：T4528-200UN）開展酶解效果比較實驗， 白芥子酶的添加量分別為 20、40、60、80 mg 和 100 mg，結(jié)果見表 1。 添加量分別為60、80、100 mg 芥子酶的測定結(jié)果基本一致，白芥子酶和商品酶（Sigma）的酶解后噁唑烷硫酮測定結(jié)果基本一致。

表1 不同添加量白芥子酶酶解后菜籽粕樣品的噁唑烷硫酮測定結(jié)果 mg/kg

為進一步確定白芥子酶的添加量， 選取181006 和181008 批次白芥種子制備芥子酶，繼續(xù)用噁唑烷硫酮含量高的菜籽粕開展酶解效果實驗， 白芥子酶的添加量分別為 20、40、60、80 mg和100 mg。 酶解效果實驗結(jié)果見表2。 白芥子酶添加量為20 ~ 60 mg 時， 菜籽粕樣品的噁唑烷硫酮測定結(jié)果隨著添加量的增多呈增長趨勢，可能白芥子酶添加量不夠，酶解不完全，不能將菜籽粕中硫代葡萄糖苷全部酶解； 芥子酶添加量為60 ~ 100 mg 時，菜籽粕樣品噁唑烷硫酮測定結(jié)果基本一致，RSD 在0.54% ~ 3.02%， 表明芥子酶添加量充足、酶解完全，菜籽粕中硫代葡萄糖苷已完全分解。

表2 不同批次、不同添加量白芥子酶酶解實驗結(jié)果

白芥子酶的酶解實驗結(jié)果表明， 樣品中硫代葡萄糖苷含量不同，若要酶解完全，所需要芥子酶添加量不同，含量越高，所需白芥子酶的添加量越大。考慮不同來源白芥種子酶活性有所差異，為確保菜籽及其加工產(chǎn)品、 禽配合飼料、 水產(chǎn)配合飼料、 濃縮飼料和精料補充料樣品硫代葡萄糖苷酶解完全， 保證實際飼料樣品中噁唑烷硫酮檢測結(jié)果準確，最終確定白芥子酶的添加量為100 mg。

2.2 酶解溫度的選擇 溫度是影響酶解效果的重要因素，使用181002 批次白芥子酶，選擇中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕樣品，選擇15、25、35 ℃進行酶解實驗， 測定噁唑烷硫酮含量， 結(jié)果見表3。 25、35 ℃下測定結(jié)果基本一致，為保證酶解效果，最終選擇酶解溫度為35 ℃。

表3 不同溫度酶解實驗結(jié)果

2.3 酶解時間的確定 酶解時間也是影響酶解效果的重要因素， 繼續(xù)使用181002 批次白芥子酶，選擇中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕樣品，選擇酶解時間為60、120、180 min 進行酶解實驗，測定菜籽粕樣品中的噁唑烷硫酮含量，結(jié)果見表4。酶解60、120、180 min 測定結(jié)果基本一致，為保證酶解效果，最終選擇酶解時間為120 min。

表4 不同時間酶解實驗結(jié)果

2.4 不同產(chǎn)地白芥子酶的酶解效果比較 分別采集四川、河北、黑龍江、甘肅、遼寧、內(nèi)蒙古、安徽等地產(chǎn)的白芥種子，制備白芥子酶，測定中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕、 池塘養(yǎng)魚配合飼料中噁唑烷硫酮含量，結(jié)果見表5 ~ 表7。 使用不同產(chǎn)地的白芥子酶，中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕、池塘養(yǎng)魚配合飼料的噁唑烷硫酮測定結(jié)果相對標準偏差在1.88% ~ 6.07%，測定結(jié)果基本一致，不同產(chǎn)地的白芥子酶均滿足實驗要求。

表5 中含量菜籽粕噁唑烷硫酮測定結(jié)果比較實驗

表6 高含量菜籽粕噁唑烷硫酮測定結(jié)果比較實驗

表7 池塘養(yǎng)魚配合飼料噁唑烷硫酮測定結(jié)果比較實驗

2.5 樣品質(zhì)量的選擇 Wetter 和 Youngs（1976）、戈蘭英等（1985 ）、佘珠花等（2003）均稱取 0.1 g油菜籽、菜籽粕樣品測定，考慮配合飼料、濃縮飼料和精料補充料中添加的菜籽粕較少， 飼料產(chǎn)品中的噁唑烷硫酮含量較低，應(yīng)適當提高稱樣量。參照NY/T 1799-2009《菜籽餅粕及其飼料中噁唑烷硫酮的測定 紫外分光光度法》， 分別稱取0.2、0.3、0.4、0.5 g 菜籽粕、池塘養(yǎng)魚配合飼料樣品，考察不同稱樣量噁唑烷硫酮的測定結(jié)果。結(jié)果表明，0.2、0.3、0.4、0.5 g 稱樣量的測定結(jié)果基本一致，最終確定稱樣量為0.2 g（表8 和表9）。

表8 中含量菜籽粕不同稱樣量噁唑烷硫酮測定結(jié)果比較

表9 池塘養(yǎng)魚配合飼料噁唑烷硫酮測定結(jié)果比較

2.6 空白實驗 為考察白芥子酶、樣品空白對測定結(jié)果的影響，取白芥子酶置于（103±2）℃烘箱中4 h 滅活，分別選用白芥子酶、滅活白芥子酶、菜籽粕、池塘養(yǎng)魚配合飼料、產(chǎn)蛋雞配合飼料樣品，按照上述實驗步驟， 分別測定 235、245、255 nm處吸光度，結(jié)果見表10。

表10 空白實驗結(jié)果

結(jié)果表明，在規(guī)定的實驗條件下，白芥子酶、滅活白芥子酶、菜籽粕、池塘養(yǎng)魚配合飼料、產(chǎn)蛋雞配合飼料等在235、245、255 nm 處均有一定的吸收， 但校正吸光度為0 或負值， 且絕對值非常低， 不會對噁唑烷硫酮的測定結(jié)果造成影響，因此，空白實驗確定為：同時做空白實驗，除不加實樣外，空白實驗采用與試樣完全相同的實驗步驟。

2.7 測定波長的選擇 根據(jù) 《ISO 5504:1992 菜籽餅粕中總異硫氰酸酯含量和乙烯基噁唑烷硫酮含量的測定》， 噁唑烷硫酮測定波長為220 ~ 280 nm， 最大吸收波長大約在 250 nm 處。 Wetter 和Youngs（1976）用二氯甲烷萃取硫甙酶解產(chǎn)物，取定量的二氯甲烷萃取液，加95%乙醇水浴生成噁唑烷硫酮， 然后在紫外區(qū) 235、245、255 nm 處測定其吸光度，校正吸光度，以5-乙烯基-2-噁唑烷硫酮表示噁唑烷硫酮的含量。 戈蘭英（1985）采用硫脲改良法測定油菜籽中的噁唑烷硫酮， 油菜籽不殺活，pH 7.0、40 ℃酶解 1 h， 用二氯甲烷萃取硫甙酶解產(chǎn)物，離心，用95%乙醇衍生，于235、245、255 nm 處測定其吸光度，校正吸光度，計算得到噁唑烷硫酮的含量， 與Wetter 和Youngs 方法測定結(jié)果一致。

使用5-乙烯基-噁唑-2-硫酮對照品（HPLC≥98%）， 用無水乙醇配制成 9.4 μg/mL 標準溶液， 同時按照上述試樣前處理步驟制備試劑空白、菜籽粕、草魚配合飼料試樣溶液，在200 ~350 nm 波段掃描吸光度，結(jié)果見圖1。

圖1 試劑空白（a）、菜籽粕（b）、草魚配合飼料（c）試樣溶液和5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標準溶液（d）200 ~ 350 nm 紫外吸收光譜圖

結(jié)果表明，空白溶液、菜籽粕、水產(chǎn)配合飼料在200~280 nm 波段均有吸收，且在200~220 nm波段吸光度均較高；9.4 μg/mL 5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標準溶液在215 ~ 250 nm 波段均有吸收，且在 235 nm 處吸光度最強。 根據(jù) Wetter 和Youngs（1976）和華欲飛（1994）等研究成果，由于菜籽粕、使用菜籽粕的飼料中含有蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)影響，考慮飼料、菜籽粕其他物質(zhì)的吸收干擾和試劑的吸收干擾， 實際測定的吸光度為噁唑烷硫酮和蛋白質(zhì)、脂肪等所有物質(zhì)的吸光度之和，且測定的目標化合物為噁唑烷硫酮系列物質(zhì)， 綜合ISO 5504-1992、NY/T 1799-2009 和文獻（佘珠花等，2003；華欲飛，1994；戈蘭英等，1985；Wetter 和Youngs，1976），需要測定 235、245、255 nm 的吸光度， 并依據(jù)校正吸光度消除雜質(zhì)干擾原理， 采用235 nm 和255 nm 吸光度之和的一半作為基線，實現(xiàn)245 nm 處的吸光度消除雜質(zhì)干擾，即為：

2.8 精密度實驗 按照上述確定的條件， 選擇菜餅和魚用膨化配合飼料樣品完成8 個平行實驗，結(jié)果見表11。 菜餅的水產(chǎn)配合飼料測定結(jié)果相對標準偏差分別為2.23%和5.89%，測定結(jié)果重復(fù)性好。

表11 精密度實驗結(jié)果

2.9 回收率和定量限 選擇乳豬配合飼料（未使用菜籽粕）、蛋雞配合飼料和菜籽粕樣品，配制適當濃度的5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標準溶液，稱取0.2 g 試樣后，分別添加3 個濃度梯度5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標準溶液， 按照上述確定方法完成回收率實驗，結(jié)果見表12。

表12 乳豬配合飼料、蛋雞配合飼料和菜籽粕回收率實驗結(jié)果

結(jié)果表明，在150~600 mg/kg，乳豬配合飼料中噁唑烷硫酮的平均回收率為92.4%~116.0%，相對標準偏差為3.16%~8.03%； 在200~800 mg/kg，蛋雞配合飼料中噁唑烷硫酮的平均回收率為99.9%~109.7%，相對標準偏差為1.34%~2.70%；在800~3200 mg/kg， 菜籽粕中噁唑烷硫酮的平均回收率為86.1%~116.9%，相對標準偏差為1.27%~3.75%。

為確定本方法的定量限， 選擇未使用菜籽粕的乳豬配合飼料、草蝦膨化配合飼料，配制適當濃度的5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標準溶液，稱取0.2 g試樣后，分別添加 100、150、200、250 mg/kg 4 個濃度梯度5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標準溶液，按照上述確定方法完成回收率實驗，結(jié)果見表13。

表13 乳豬配合飼料和草蝦膨化配合飼料回收率實驗結(jié)果

結(jié)果表明，乳豬配合飼料、草蝦膨化配合飼料加標濃度100 mg/kg 的平均回收率分別為173.3%和169.5%， 相對標準偏差分別為7.25%和4.66%， 這可能是因為5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標準溶液添加濃度較低， 由于樣品基質(zhì)存在一定的干擾，導(dǎo)致試樣溶液吸光度值偏高，最終導(dǎo)致加標100 mg/kg 濃度時的回收率偏高。 在150 ~ 250 mg/kg， 乳豬配合飼料噁唑烷硫酮的平均回收率為91.7% ~ 112.9%， 相對標準偏差為2.48%~4.66%；在150~250 mg/kg，草蝦膨化配合飼料噁唑烷硫酮的平均回收率為96.9%~120.6%，相對標準偏差為1.23%~4.11%， 說明5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標準溶液添加濃度在150 mg/kg 以上時，樣品基質(zhì)干擾不足以影響加標回收率，加標回收率均能滿足實驗要求，綜合考慮兩次回收率實驗結(jié)果，確定本方法的定量限為150 mg/kg，與Wetter和 Youngs（1976）研究結(jié)果一致。

2.10 水產(chǎn)配合飼料中添加菜籽粕驗證實驗 為進一步驗證方法的準確性、可信度，采用未添加菜籽粕的草蝦膨化配合飼料，粉碎后，添加噁唑烷硫酮含量較高的菜粕， 分別按照10%、20%、30%比例添加至草蝦膨化配合飼料中，充分混合均勻，測定添加菜籽粕后草蝦膨化配合飼料樣品中噁唑烷硫酮的含量，結(jié)果見表14。

表14 水產(chǎn)配合飼料菜籽粕添加實驗結(jié)果

結(jié)果表明， 添加菜籽粕后草蝦膨化配合飼料噁唑烷硫酮實際測定值與理論值比值為99.1% ~111.9%，進一步證明本次修訂的標準方法測定結(jié)果可信度高。

2.11 實際樣品測定結(jié)果 實際樣品測定結(jié)果見表15。

表15 菜籽餅粕、配合飼料、濃縮飼料和精料補充料實際樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

試樣中的硫代葡萄糖苷在pH 7.0 緩沖液中，在白芥子酶作用下水解生成異硫氰酸酯，用二氯甲烷萃取后， 帶羥基的異硫氰酸酯與乙醇反應(yīng)，環(huán)化生成噁唑烷硫酮，使用紫外分光光度法測定，方法的定量限為150 mg/kg，平均回收率為86.1% ~ 116.9%，適用于菜籽及其加工產(chǎn)品，以及含有菜籽及其加工產(chǎn)品的配合飼料、 濃縮飼料和精料補充料中噁唑烷硫酮的測定， 方法重復(fù)性好、可信度高。