李欣燃， 陳玉萍， 石云麗， 王緒英， 翁貴英

（六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州六盤水 553000）

尼泊爾酸模（Rumex nepalensis Spreng）為廖科酸模屬多年生草本植物，具有抗菌、消炎、通便、抗?jié)兊榷喾N藥理作用（Woretaw 等，2021；文樂(lè)等，2019；Lopamudra 等，2003；Ghosh 等，2003），在我國(guó)主要分布于云、貴、川以及西藏等地（彭毅，2013），是一種傳統(tǒng)中草藥。 鑒于酸模屬植物具有一定的飼用價(jià)值（閻宏等，2002；霍貴成等，1997），因此， 尼泊爾酸模亦可作為飼料加以開發(fā)利用。多酚類化合物是植物體內(nèi)重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其應(yīng)用于飼料中可改善動(dòng)物生產(chǎn)性能， 提高動(dòng)物的抗炎及免疫力以及改善常見畜禽的肉品質(zhì) （蔣步云等，2014）。目前，對(duì)于尼泊爾酸模多酚類化合物的提取工藝及其抗氧化活性尚鮮見報(bào)道。

本研究通過(guò)超聲輔助的提取方法分別檢測(cè)尼泊爾酸模根、莖及葉三個(gè)部位總多酚的含量，并采用響應(yīng)面法對(duì)多酚含量最高的部位進(jìn)行提取工藝優(yōu)化， 同時(shí)通過(guò)檢測(cè)羥自由基和DPPH 自由基的清除率來(lái)對(duì)多酚提取物的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為該植物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)所用材料采自六盤水市水城區(qū)， 經(jīng)鑒定為廖科酸模屬草本植物尼泊爾酸模，樣品經(jīng)洗凈、風(fēng)干、粉碎后，過(guò)40 目篩備用。沒食子酸 （純度≥99%）， 生工生物工程有限公司；DPPH（純度>97%），北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與試劑 TD5 離型心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；UV-2100B 型紫外分光光度計(jì)， 北京東西分析儀器有限公司；GL2204B 型電子天平， 上海佑科儀器儀表有限公司；SB-800DT型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.125 g 于 250 mL 容量瓶中， 用蒸餾水定容至刻度，混勻備用，得到濃度為0.5 mg/mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。 移液器準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于 25 mL 容量瓶中，依次加入蒸餾水5 mL，酒石酸亞鐵溶液5 mL 后，再用pH 7.5 的磷酸鹽緩沖液補(bǔ)齊至25 mL，混勻、靜置15 min 后于540 nm 波長(zhǎng)測(cè)量上述各標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=14.704x-0.0227（R2=0.9971）。 其尼泊爾酸模多酚得率計(jì)算公式如下：

尼泊爾酸模多酚得率/%=提取液中多酚質(zhì)量/待測(cè)樣品質(zhì)量×100。

1.3.2 根莖葉含量比較 取尼泊爾酸模根、莖、葉三個(gè)部位樣品各1 g，在超聲時(shí)間40 min，乙醇體積分?jǐn)?shù) 50%，料液比 1∶100（g/mL）的條件下分別進(jìn)行超聲提取，檢測(cè)并比較各部位多酚得率，選取得率最高的部位進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 選取尼泊爾酸模多酚含量最高部位依次進(jìn)行單因素試驗(yàn)。 當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為 1∶100（g/mL），分別檢測(cè)超聲時(shí)間為 20、30、40、50、60、70 min 時(shí)尼泊爾酸模選取部位的多酚得率；當(dāng)料液比為 1∶100（g/mL），超聲時(shí)間為40 min， 分別檢測(cè)乙醇體積分?jǐn)?shù)為 30%、40%、50%、60%、70%、80%時(shí)尼泊爾酸模選取部位的多酚得率；當(dāng)超聲時(shí)間為40 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 50%，分別檢測(cè)料液比為 1∶70、1∶80、1∶90、1∶100、1∶110、1∶120（g/mL）時(shí)尼泊爾酸模選取部位的多酚得率。

1.3.4 響應(yīng)面法試驗(yàn) 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以多酚得率為響應(yīng)值， 結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行工藝驗(yàn)證。

1.3.5 抗氧化活性檢測(cè) 將尼泊爾酸模選取部位的多酚提取液進(jìn)行梯度稀釋，依次為0.6、0.5、0.4、0.3 mg/mL 以及0.2 mg/mL，并對(duì)各濃度提取液進(jìn)行羥自由基清除試驗(yàn)和DPPH 清除試驗(yàn)， 同時(shí)以抗壞血酸作為平行對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼泊爾酸模中各部位多酚得率 由圖1 可知，分別將尼泊爾酸模根、莖及葉各部位多酚得率進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，根部多酚得率為6.92%，顯著高于莖部（4.37%）和葉部（5.99%）多酚得率，故后續(xù)試驗(yàn)選取尼泊爾酸模根部作為研究對(duì)象， 進(jìn)行多酚提取條件的優(yōu)化。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果 選取尼泊爾酸模根部進(jìn)行單因素試驗(yàn)。 對(duì)于超聲時(shí)間而言（圖2），當(dāng)達(dá)到40 min 時(shí)，多酚得率最高，為6.95%，隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，多酚得率略微有所下降，可能是由于超聲時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致少量多酚類化合物的破壞；對(duì)于料液比而言（圖 3），當(dāng)比例為 1∶80（g/mL）時(shí)，多酚得率達(dá)到最高，為6.95%，隨著料液比的增加，多酚得率基本不變， 說(shuō)明在此條件下多酚化合物已基本析出； 對(duì)于乙醇體積分?jǐn)?shù)而言 （圖4），在50%時(shí)多酚得率達(dá)到最高，為6.90%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚得率反而降低，可能是此時(shí)有機(jī)溶劑與多酚類化合物的極性最接近， 多酚得率最高。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

圖3 料液比對(duì)多酚得率的影響

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響

2.3 多酚提取工藝優(yōu)化

2.3.1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)結(jié)果 根據(jù)尼泊爾酸模根部多酚提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果， 采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理對(duì)影響其多酚得率三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，具體結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.2 回歸模型及方差分析 通過(guò)Design-Expert.8.0.6 對(duì)表1 中尼泊爾酸模根部多酚得率相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到多元回歸擬合方程為Y =-141.51550 +0.21948A +2.63588B +0.25100C +2.35000×10-3AB+3.67500×10-3AC-8.25000×10-4BC-8.04500×10-3A2-0.013345B2-4.42000×10-3C2。

由表2 可知，該模型P < 0.05，差異極顯著，失擬誤差無(wú)顯著差異， 表明該模型與實(shí)際擬合度較好。 模型中 B、A2和 B2表現(xiàn)為差異極顯著，C 表現(xiàn)為差異顯著，A、AB、AC、BC 和 C2表現(xiàn)為無(wú)差異， 三個(gè)因素對(duì)尼泊爾酸模根部多酚得率的影響大小因素依次為B＞C＞A， 即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.3.3 響應(yīng)面圖形分析 各因素交互作用對(duì)尼泊爾酸模根部多酚得率的影響情況詳見圖5。 可以發(fā)現(xiàn)各響應(yīng)面坡度變化較為平緩， 說(shuō)明時(shí)間和料液比、時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)之間交互作用對(duì)尼泊爾酸模根部多酚影響作用不顯著。

圖5 各交互因素對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面法得到尼泊爾酸模根部多酚的最佳提取工藝為：超聲時(shí)間41.50 min，料液比 1∶104.13（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù) 55.37%，其多酚得率的預(yù)測(cè)值為7.21%。 為方便實(shí)際生產(chǎn)試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)用操作，將以上操作條件簡(jiǎn)化為：超聲時(shí)間 42 min，料液比 1：104（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，進(jìn)行三次平行操作取平均值，得到尼泊爾酸模根部多酚的平均得率為7.24%， 其與預(yù)測(cè)值（7.21%）的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%。

2.4 抗氧化活性檢測(cè) 尼泊爾酸模根部多酚提取液抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果如圖6 所示。 羥自由基清除能力和DPPD 自由基清除能力與Vc 的變化趨勢(shì)基本一致，隨著多酚含量的減少清除率降低。同時(shí)多酚提取液的清除活性略低于Vc。 經(jīng)過(guò)計(jì)算， 尼泊爾酸模根部多酚的羥自由基和DPPH 自由基的清除率IC50值分別為0.36 mg/mL 和0.28 mg/mL，表明其具有較好的抗氧化活性。

圖6 多酚提取物和抗壞血酸對(duì)羥自由基及DPPH 自由基清除試驗(yàn)

3 結(jié)論

尼泊爾酸模根部多酚提取的最佳條件為超聲時(shí)間 42 min，料液比 1∶104（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，此時(shí)多酚得率為7.24%，與預(yù)測(cè)得率7.21%的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%，說(shuō)明優(yōu)化的工藝可靠。提取物對(duì)羥自由基和DPPH 自由基的清除率IC50值分別為0.36 mg/mL 和0.28 mg/mL，表明其具有較好的抗氧化活性。 研究結(jié)果可為尼泊爾酸模的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。