李婕 單紅麗 王長秘 倉曉燕 王曉燕 張榮躍 房超 韋美英 馬燕青 黃應(yīng)昆

摘要

2020年在廣西南寧市金光農(nóng)場發(fā)現(xiàn)‘桂糖58’和‘柳城05136’疑似感染甘蔗赤條病，為明確其病原，本研究對不同甘蔗品種進(jìn)行了發(fā)病率調(diào)查，并采集病樣進(jìn)行了PCR檢測分析。田間調(diào)查結(jié)果表明：不同品種自然發(fā)病率不同，‘桂糖58’發(fā)病率為29%～52.33%，發(fā)病嚴(yán)重田塊平均發(fā)病率為49.67%，發(fā)病中等田塊平均發(fā)病率為33.67%，發(fā)病較輕田塊平均發(fā)病率為29.89%;‘柳城05136’發(fā)病率為2%～27.67%，發(fā)病嚴(yán)重田塊平均發(fā)病率為21.67%，發(fā)病中等田塊平均發(fā)病率為21.22%，發(fā)病較輕田塊平均發(fā)病率為4.67%。PCR檢測分析表明：有19份樣品擴(kuò)增出550 bp的特異性條帶，陽性檢出率為95%，測序序列與Acidovorax avenae subsp. avenae 序列同源性高達(dá)100%，且在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支，證實檢測樣品為A.avenae subsp. avenae感染引起的甘蔗赤條病。本研究結(jié)果表明，‘桂糖58’為高感品種，‘柳城05136’為感病品種，今后應(yīng)積極采取相應(yīng)防控措施，防治該細(xì)菌病害擴(kuò)展蔓延，確保我國蔗糖產(chǎn)業(yè)安全可持續(xù)發(fā)展。

??關(guān)鍵詞

廣西;甘蔗赤條病;發(fā)病率;PCR檢測;系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號：

S435.661

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020662

Investigation and molecular detection of sugarcane red stripe caused by Acidovorax avenae subsp. avenae in Nanning， Guangxi

LI Jie1，SHAN Hongli1，WANG Changmi1，CANG Xiaoyan1，WANG Xiaoyan1，

ZHANG Rongyue1，F(xiàn)ANG Chao2，WEI Meiying2，MA Yanqing2，HUANG Yingkun1*

（1. Sugarcane Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Science， Yunnan

Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement， Kaiyuan661699， China; 2. Guangxi

Keimike Agricultural Technology Service Co. Ltd.， Nanning530000， China）

Abstract

In 2020， suspected sugarcane red stripe disease was found in ‘Guitang 58’ and ‘Liucheng 05136’ in Jinguang farm， Nanning city， Guangxi. In order to identify the pathogen， we investigated the incidence of different sugarcane varieties， and collected disease samples for PCR molecular detection and sequencing analysis. Field survey results showed that the incidence? of different varieties were different. The disease incidence in ‘Guitang 58’ was 29%-52.33%， the average disease incidence of severely， moderately and lighter affected fields was 49.67%， 33.67%， 29.89%， respectively. The disease incidence in ‘Liucheng 05136’ was 2%-27.67%， the average disease incidence of severely， moderately and lighter affected fields was 21.67%， 21.22% and 4.67%， respectively. PCR analysis showed that 19 samples amplified a 550 bp specific band with a positive detection rate of 95%. And the obtained sequences had 100% homology and were on the same branch with Acidovorax avenae subsp. avenae in phylogenetic tree， which confirmed that the tested samples were sugarcane red stripe disease caused by A.avenae subsp. avenae. The above results showed that ‘Guitang 58’ was highly susceptible variety and ‘Liucheng 05136’ was susceptible variety. In the future， corresponding prevention and control measures should be actively taken to prevent the spread of the bacterial disease and ensure the safe and sustainable development of sugar industry in China.

Key words

Guangxi;sugarcane red stripe disease;incidence;PCR detection;phylogenetic analysis

由燕麥?zhǔn)伤峋帑渷喎NAcidovorax avenae subsp. avenae引起的甘蔗赤條?。╯ugarcane red stripe disease）是一種世界性甘蔗細(xì)菌病害[1]。感病甘蔗葉片初期出現(xiàn)水漬狀褪綠條紋，很快發(fā)展成明顯的紅色條紋，長度和寬度不等，感染侵入頂端生長點可導(dǎo)致蔗莖壞死[2]。該病害于1890年在美國夏威夷首先報道[3]，目前在美國、澳大利亞、印度、古巴、伊朗、阿根廷、巴基斯坦和加蓬等50多個植蔗國家和地區(qū)均有發(fā)生[2 12]，曾在阿根廷、巴基斯坦等甘蔗種植國暴發(fā)流行，給當(dāng)?shù)卣崽钱a(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2， 12 13]。由黃單胞桿菌屬Xanthomonas sp. [14]和鏈格孢屬Alternaria sp. [15]真菌引起的甘蔗葉部病害癥狀與A.avenae subsp. avenae引起的甘蔗赤條病癥狀相似，感病蔗葉均會產(chǎn)生紅色或紅褐色條紋，僅從發(fā)病癥狀進(jìn)行診斷容易誤診。

近年來，甘蔗赤條病在我國云南、廣東、廣西、福建蔗區(qū)均有報道，多為局部零星發(fā)生[16 18]。2020年，本團(tuán)隊在廣西南寧市金光農(nóng)場叫琳基地‘桂糖58’和‘柳城05136’甘蔗上發(fā)現(xiàn)疑似甘蔗赤條病癥狀， 準(zhǔn)確進(jìn)行病原的鑒定是病害精準(zhǔn)科學(xué)防控的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。為此，本研究結(jié)合田間發(fā)病癥狀、PCR分子檢測及測序分析進(jìn)行了病原鑒定，并對不同品種自然發(fā)病率進(jìn)行了調(diào)查統(tǒng)計，研究結(jié)果可為不同區(qū)域甘蔗品種布局及甘蔗赤條病的抗性鑒定提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1病害調(diào)查及樣品采集

2020年5月，在廣西壯族自治區(qū)南寧市金光農(nóng)場叫琳基地發(fā)現(xiàn)‘桂糖58’（一年宿根）和‘柳城05136’（一年宿根）疑似感染甘蔗赤條病，每個品種按發(fā)病重、中、輕各隨機選擇3個點取樣調(diào)查，每個點取3行各300株有效蔗株調(diào)查發(fā)病情況，記錄發(fā)病株數(shù)，觀察并記錄病害癥狀。按以下公式計算發(fā)病率。

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）× 100%。

1.2蔗葉總DNA的提取

采集20份具有典型癥狀的甘蔗植株，稱取各待測發(fā)病甘蔗葉片0.2 g，加入液氮研磨成粉狀，采用北京全式金生物技術(shù)公司的 Easy Pure plant Genomic DNA Kit按照說明書方法提取葉片總DNA，用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀檢測提取DNA質(zhì)量， 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3甘蔗赤條病菌PCR檢測

參照Song等[19]根據(jù)甘蔗赤條病菌16S23S核糖體ITS區(qū)域設(shè)計的特異性引物Oaf1：5′ GTCGGTGCTAACGACATGG3′和Oar1：5′AGACAT

CTCCGCTTTCTTTCAA3′、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序進(jìn)行甘蔗赤條病菌PCR檢測，預(yù)期目的片段長度為550 bp。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。陽性對照甘蔗赤條病菌基因組DNA為云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室鑒定保存，陰性對照為健康組培苗，空白對照為無菌雙蒸水。

1.4PCR產(chǎn)物克隆、測序及序列分析

PCR擴(kuò)增目的片段用北京天根生化科技有限公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化。純化的PCR產(chǎn)物用全式金生物科技有限公司的pEASYT5 Zero Cloning Kit進(jìn)行克隆，并轉(zhuǎn)化E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取10個樣品各挑取6個陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。測序結(jié)果首先在GenBank進(jìn)行BLAST檢索，然后用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用DPS V18.10 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及分析，并對結(jié)果進(jìn)行Duncan氏新復(fù)極差法分析比較差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1甘蔗赤條病田間癥狀觀察

甘蔗赤條病最初表現(xiàn)為水漬狀褪綠條紋，不久即擴(kuò)展為長條狀紅色病斑，最后變?yōu)槔跎蛏罴t色。條紋通常發(fā)生于嫩葉中部近中脈處（圖1a），有些則集中于葉基部（圖1b）。條紋與葉脈平行，病健交界明顯，寬0.5～4 mm，長幾厘米至蔗葉全長（圖1c）。常常2條或數(shù)條條紋合并連接形成寬帶狀病斑（圖1d）。病葉下表皮通?？梢娂?xì)菌溢出物。心葉受到病菌的侵染，后期可導(dǎo)致心葉腐爛，心葉很容易從葉鞘中拉出，并發(fā)出特殊惡臭（圖1e）。

2.2甘蔗赤條病發(fā)生情況調(diào)查

對疑似甘蔗赤條病為害的‘桂糖58’和‘柳城05136’田間發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計分析（表1）。結(jié)果顯示：‘桂糖58’發(fā)病率為29%～52.33%;發(fā)病嚴(yán)重田塊，發(fā)病率為45%～52.33%，平均發(fā)病率為49.67%;發(fā)病中等田塊，發(fā)病率為30%～40.67%，平均發(fā)病率為33.67%;發(fā)病較輕田塊，發(fā)病率為29%～30.67%，平均發(fā)病率為29.89%?！?5136’發(fā)病率為2%～27.67%;發(fā)病嚴(yán)重田塊，發(fā)病率為16%～27.67%，平均發(fā)病率為21.67%;發(fā)病中等田塊，發(fā)病率為18.33%～26.33%，平均發(fā)病率為21.22%;發(fā)病較輕田塊，發(fā)病率為2%～9%，平均發(fā)病率為4.67%。

顯著性分析表明（表1），‘桂糖58’發(fā)病嚴(yán)重田塊與發(fā)病中等、發(fā)病較輕田塊的平均發(fā)病率差異顯著，后兩者之間差異不顯著;‘柳城05136’發(fā)病嚴(yán)

重、發(fā)病中等田塊與發(fā)病較輕田塊的平均發(fā)病率差

異顯著，發(fā)病嚴(yán)重田塊與發(fā)病中等田塊的平均發(fā)病率差異不顯著。

2.3甘蔗赤條病菌PCR檢測

對典型癥狀樣品進(jìn)行了甘蔗赤條病特異性PCR檢測，結(jié)果顯示，20份樣品中，19份樣品和陽性對照均能擴(kuò)增出大小約550 bp的目的條帶，而陰性對照和空白對照均未擴(kuò)增出預(yù)期目的條帶（圖2），表明檢測樣品為A.avenae subsp. avenae感染引起的甘蔗赤條病。

2.4序列分析

從PCR檢測陽性樣品中隨機選取10個PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，大小均為550 bp。通過BLAST比對，選擇其中2個序列進(jìn)行進(jìn)一步分析，序列（GenBank登錄號：MW280446MW280447）與A.avenae subsp. avenae （GenBank登錄號：AY080998）16S23S rDNA核苷酸序列相似性達(dá)98.05%，與廣東湛江‘云蔗082060’上的A.avenae subsp. avenae（GenBank登錄號：KY363756）序列同源性高達(dá)100%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，所得序列與A.avenae subsp. avenae處于同一分支上，親緣關(guān)系最近（圖3），進(jìn)一步證實了檢測樣品為A.avenae subsp. avenae感染引起的甘蔗赤條病。

3討論

僅通過田間發(fā)病癥狀進(jìn)行診斷容易導(dǎo)致誤判，基于PCR分子檢測技術(shù)進(jìn)行快速分子診斷具有準(zhǔn)確、快速、高效等特點，已廣泛應(yīng)用于各種病害的檢測和鑒定。目前已建立成熟穩(wěn)定的甘蔗赤條病分子檢測方法，即Song等根據(jù)A.avenae subsp. avenae的16S23S核糖體ITS區(qū)域設(shè)計的特異性引物Oaf1/Oar1，擴(kuò)增目的條帶大小約為550 bp[19]。 本研究利用該引物對，對廣西南寧市金光農(nóng)場叫琳基地‘桂糖58’和‘柳城05136’疑似甘蔗赤條病樣品進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及測序分析，證實檢測樣品為A.avenae subsp. avenae感染引起的甘蔗赤條病。

A.avenae subsp. avenae寄主范圍廣泛，除侵染甘蔗外，還可侵染多種禾本科植物，包括玉米、水稻、高粱、黍、燕麥、大麥、小米和狐尾草Setaria viridis等[19 25]，這些中間宿主為甘蔗赤條病的發(fā)生危害提供了初侵染源。近年來，甘蔗赤條病在我國廣西、云南、廣東、福建等蔗區(qū)零星發(fā)生，但部分蔗區(qū)發(fā)病率高達(dá)80%[16]。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)：‘云蔗03194’高度感病，發(fā)病率一般為8%～30%，嚴(yán)重田塊高達(dá)80%[16]，‘福農(nóng)38號’為感病品種，發(fā)病率為23%[17]，‘ROC 16’‘ROC 25’‘粵糖93159’‘粵糖00236’‘桂糖94116’‘桂引5號’和‘閩糖11610’也為感病品種[18，26]。本研究在廣西南寧市金光農(nóng)場叫琳基地發(fā)現(xiàn)甘蔗赤條病，并進(jìn)行了田間自然發(fā)病率調(diào)查，明確了‘桂糖58’為高感品種，發(fā)病率為29%～52.33%;‘柳城05136’為易感品種，發(fā)病率為2%～27.67%。因此，今后各蔗區(qū)調(diào)種、運種時應(yīng)加強對該病害的檢疫和監(jiān)測，防止該病害隨蔗種在各蔗區(qū)傳播蔓延，同時應(yīng)及時清除病株。此外，在品種布局時，應(yīng)避免在赤條病發(fā)生區(qū)種植‘桂糖58’‘柳城05136’和‘云蔗03194’等高感或易感赤條病品種。

A.avenae subsp. avenae屬于革蘭氏陰性菌，最適生長溫度為30～35℃[27]，致死溫度為51～52℃[28]。在田間主要靠風(fēng)、雨傳播，也可通過蔗種、機械損傷、昆蟲等進(jìn)行傳播[18，28]，該病原菌可在土壤中存活長達(dá)1個月，感病枯老蔗葉、蔗莖中的病原體4個月后仍有致病力[28]。由于甘蔗是無性繁殖作物，甘蔗赤條病可通過蔗種進(jìn)行傳播，而蔗種溫水處理脫毒技術(shù)已廣泛應(yīng)用于甘蔗宿根矮化病的防控，并取得較好的效果[29 30]。因此，除了種植抗病品種、化學(xué)防控及科學(xué)田間管理等措施外，今后可考慮開展甘蔗赤條病溫水脫毒處理防控效果研究，為該病害的防控提供一條經(jīng)濟(jì)、有效的新途徑。

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收稿日期：2020 12 10修訂日期：2021 01 06

基金項目：

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（糖料）建設(shè)專項資金（CARS170303）;云嶺產(chǎn)業(yè)技術(shù)領(lǐng)軍人才培養(yǎng)項目（2018LJRC56）;云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（YNGZTX-4-92）

* 通信作者

Email：huangyk64@163.com