胡海紅 吳怡雯 李 擎 張以寧 彭 晶 謝志忠 雷小勇 楊曉燕

（南華大學衡陽醫(yī)學院，藥學院藥物藥理研究所，衡陽 421001）

HMGA2是位于人染色體12q 13～15區(qū)域，長度 超過140 kb的基因組，其編碼的蛋白長度少于12 kb由108個氨基酸組成的高遷移率族（high mobility group，HMG）蛋白家族中的主要成員之一［1］。HMG基因家族編碼的蛋白質雖然沒有轉錄活性即它沒有直接參與轉錄過程，但是可以通過其他的途徑來參與DNA功能的調控，比如DNA復制、DNA重組和DNA的修復等過程［2］。并且值得注意的是，與正常的組織細胞相比，HMGA2在胃癌等人類常見的癌癥中差異表達，并且可以通過各種機制參與癌細胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥過程發(fā)揮著致癌基因的作用［3-9］。

在人類的基因組中有超過98%的DNA序列與蛋白質的編碼無關，這種被稱之為非編碼RNA［10-11］。miRNA是一種長度為19～25個核苷酸的內源性小分子，隨著腫瘤探究的進一步發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)非編碼RNA并不直接參加蛋白質的轉錄和翻譯過程，而是能調節(jié)人類DNA組中其他與蛋白質編碼有關DNA的表達，從而參加腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［12-13］。miRNA主要與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）結合，引起靶DNA的mRNA降解或轉錄后抑制，引起相關DNA表達水平的改變［14］。miR-33b-5p作為胃癌中篩選出來的差異表達的miRNA，也被證明可以與HMGA2等多個靶基因的3'-UTR結合，但是兩者之間的機制尚不明確，于是本課題組采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)來驗證兩者之間是否存在靶向關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 293T細胞系源于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，由南華大學藥物藥理研究所保存；TOP10感受態(tài)細胞購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.1.2 試劑 GV272線性載體及miR-33b-5p質粒均購自上海吉凱基因化學技術有限公司；Normal-RunTM250 bp-Ⅱ DNA Ladder 以及PCR擴增引物由上海捷瑞生物工程有限公司提供（表1）；GeneRuler 10 kb DNA Ladder 購自賽默飛世爾科技公司；限制性內切酶購自New England Biolabs有限公司；Taq Plus DNA聚合酶、克隆試劑盒購自Vazyme公司；PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自TaKaRa公司；Endo-Free midi Plasmid Kit 購自天根生化科技（北京）有限公司；X-tremegene HP轉染試劑購自Roche公司。

1.1.3 儀器 PCR儀（No：ABI9700）購自上海賽默生物科技有限公司；測序儀（No：ABI3730）購自美季生物公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（No：DYY-6C）購自普陽科學儀器研究所；凝膠成像儀（No：Tanon-2500）購自天能公司；恒溫培養(yǎng)箱（No：GHP-9080）購自上海一恒科學儀器有限公司；超凈工作臺（No：BCM-1600A）購自蘇州安泰空氣技術有限公司；高速離心機（No：Legend Micro17）購自賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學的靶基因預測和數(shù)據(jù)挖掘miR-33b-5p的靶基因預測 利用miRDB、miRTar-Base、TargetScan等生物信息學數(shù)據(jù)庫及相關軟件預測miR-33b-5p的靶基因以及與HMGA2結合的序列。

1.2.2 化學合成的目的基因序列 通過NCBI數(shù)據(jù)庫篩選出HMGA2基因3'-UTR的基因序列，由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成PCR擴增體系的引物（表1），然后配制50 μl的PCR擴增基因序列反應體系，反應體系的試劑和用量如下：ddH2O 32.5 μl；5×Prime STAR Buffer 10 μl；dNTP Mix（2.5 mmol/L） 4.0 μl；擴增引物（10 μmol/L）各1 μl；PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μl；DNA模板1 μl。將上述反應體系的組分吹打混勻、離心，然后放在PCR儀中進行反應。

表1 PCR用于擴增HMGA2基因3'-UTR的引物序列Tab.1 Primer sequence for 3'-UTR of HMGA2 used in PCR

1.2.3 目的基因片段與酶切載體進行交換 收集PCR擴增體系中的產(chǎn)物將其與GV272載體（圖1）進行重組結合。在冰水浴中制備10.0 μl交換反應體系，在37 ℃下反應30 min，用移液管吹打混合，離心5 min，防止產(chǎn)生氣泡。本研究設計了如下3組：①陽性對照組：2.5 μl ddH2O；2.0 μl 5×CE ⅡBuffer；2.5 μl GV272載體；2.0 μl GAPDH 基因片段；1.0 μl ExnaseTMⅡ。②陰性對照組：4.5 μl ddH2O；2.0 μl 5×CE Ⅱ Buffer；2.5 μl GV272 載體；未加入基因片段；1.0 μl ExnaseTMⅡ。③實驗組：3.5 μl ddH2O；2.0 μl 5×CE Ⅱ Buffer；2.5 μl GV272 載體；1.0 μl HMGA2基因片段；1.0 μl ExnaseTMⅡ。

圖1 GV272載體圖譜Fig.1 GV272 vector map

1.2.4 含有目的基因的載體酶切 將實驗組中的交換產(chǎn)物純化后加入50 μl的載體酶切反應體系中：41.5 μl ddH2O；5 μl 10× Buffer；0.5 μl 100×BSA；2 μl重組質粒；1 μl XbaⅠ（20 U/μl）。37 ℃下反應2 h后將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 PCR鑒定 取10 μl上述重組反應產(chǎn)物和100 μl感受態(tài)細胞（TOP10 competent cell）于離心管中，混勻，置于冰上30 min。將混合后的離心管置于42 ℃的水浴中90 s，然后迅速轉移到冰水浴中孵育2 min。在離心管中加入500 μl的Luria-Bertani培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)皿上振蕩培養(yǎng)1 h。取2 μl復蘇菌液均勻涂于含氨芐毒素的培養(yǎng)板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。

配制20 μl如下鑒定反應體系：9.2 μl ddH2O；10 μl 2×Taq Plus DNA聚合酶；正反向擴增引物各0.4 μl（10 μmol/L）；單個菌落?；靹?，離心5 min，用無菌槍頭挑起單個菌落，放入20 μl鑒定體系中吹混勻，置于PCR儀（ABI9700）中進行反應。反應條件如下：1個循環(huán)：94 ℃下反應 3 min；22個循環(huán)：①94 ℃下反應30 s；②55 ℃下反應30 s；③72 ℃下反應30 s；1個循環(huán)：72 ℃下反應5 min；1個循環(huán)：4 ℃，∞。將鑒定體系中的產(chǎn)物設置8個獨立實驗組，然后設置3個對照組，分別是ddH2O陰性對照、空載自連陰性對照組、GAPDH陽性對照組，然后將其進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 測序 將鑒定出的陽性轉化子接種于含有適量含氨芐霉素的Luria-Bertani液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，取適量菌液進行測序（由上海吉凱有限公司完成）。

1.2.7 雙熒光素酶活性驗證 使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細胞，待細胞呈指數(shù)型生長后將其接種至24孔板上（500 μl/孔），置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后按照X-tremegene HP轉染試劑說明書進行細胞瞬時轉染。轉染48 h后，加入300 μl裂解液置于4 ℃的冰箱中充分裂解20 min，振蕩混勻后吸取40 μl的細胞裂解液加入Lockwell maxisorp檢測板中，加入20 μl螢火蟲熒光酶檢測試劑，混勻后立即使用酶標儀檢測螢火蟲熒光酶的熒光值；加入20 μl Stop & Glo?Reagent后再用酶標儀檢測海腎熒光酶的熒光值，進行3次重復實驗。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有組別的數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或者單因素方差分析，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-33b-5p的靶基因預測結果 利用miRDB、miRTarBase、TargetScan三個數(shù)據(jù)庫進行miR-33b-5p靶基因的篩選，并且利用STRING在線數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）和Cytoscape工具軟件（version 3.8.2）進行可視化分析并且構建PPI網(wǎng)絡圖（圖2）。然后將數(shù)據(jù)庫中的靶基因進行兩兩交叉比對，最終得到20個目標基因。隨后在TargetScan軟件中進行靶點預測發(fā)現(xiàn)miR-33b-5p與HMGA2的3'-UTR存在互補結合位點（圖3）。

圖2 miR-33b-5p靶基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖Fig.2 Protein interaction network diagram of miR-33b-5p target genes

圖3 miR-33b-5p 與HMGA2 3'-UTR的結合序列比對Fig.3 Alignment of binding sequence between miR-33b-5p and HMGA2 3'-UTR

2.2 目的基因的片段與載體成功結合 經(jīng)過酶切的含有目的基因的載體在瓊脂糖凝膠電泳圖中有兩條顯色帶（圖4），GV272線性載體的標準分子大小為5 kb，圖4A的顯色帶1正好與Marker的第一條帶（5 kb）平齊；圖4B的條帶2位于100 bp與250 bp之間，與合成的HMGA2基因片段的分子大小209 bp恰好吻合，該結果說明目的基因的片段與載體成功結合。

圖4 重組質粒經(jīng)酶切后的電泳圖結果Fig.4 Electrophoresis results of recombinant plasmid after digestion

2.3 PCR鑒定結果 PCR鑒定結果顯示，野生型及突變型HMGA2 3'-UTR雙熒光素酶重組質粒陽性轉化子PCR產(chǎn)物大?。?66 bp，陰性轉化子PCR產(chǎn)物大?。?53 bp。接下來將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，野生型質粒的電泳結果如圖5A所示，5～12為轉化子的顯色條帶，除了9～10號條帶沒有顯色外，大部分轉化子的分子大小均位于500～750 bp之間。突變型質粒的電泳結果如圖5B所示，5～12為轉化子的顯色條帶，除了8、11號條帶沒有顯色外，其余各組轉化子的分子大小均位于500～750 bp之間，該結果說明重組質粒得到的轉化子大多數(shù)為陽性轉化子，野生型及突變型重組載體基本構建成功。

圖5 熒光素酶報告基因質粒瓊脂糖電泳結果圖Fig.5 Results of agarose electrophoresis of luciferase reporter gene plasmid

2.4 測序結果 測序結果如圖6所示（測序過程由上海吉凱基因化學技術有限公司進行），經(jīng)過基因序列比對后發(fā)現(xiàn)，野生型（圖6A）HMGA2 3'-UTR（HMGA2-wt-3'UTR）和突變型（圖6B）HMGA2 3'-UTR（HMGA2-mut-3'UTR）的基因序列與原序列并未發(fā)生改變，說明HMGA2 3'-UTR雙熒光素酶報告載體構建成功。

圖6 野生型 HMGA2 3'-UTR（A） 和突變型 HMGA2 3'-UTR（B） 重組質粒的測序圖譜Fig.6 Sequencing map of wild-type HMGA2 3'-UTR（A）and mutant HMGA2 3'-UTR（B） recombinant plasmid

2.5 miR-33b-5p與HMGA2靶向驗證結果 雙熒光素酶報告系統(tǒng)的結果如表2所示，與野生型質粒（HMGA2-wt-3'-UTR）+miR-NC組相比，野生型質粒（HMGA2-wt-3'-UTR）+miR-33b-5p組熒光素酶的相對表達量降低了約17%，并且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明miR-33b-5p可以與野生型HMGA2的3'-UTR結合并且抑制其表達；但是突變型質粒（HMGA2-mut-3'-UTR）+miR-NC組與突變型質粒（HMGA2-mut-3'-UTR）+miR-33b-5p組的熒光素酶的相對表達量沒有明顯差異，說明miR-33b-5p不可以與突變型HMGA2的3'-UTR結合。

表2 各組293T細胞中熒光素酶的相對活性（±s，n=3）Tab.2 Relative activity of luciferase in each group of 293T cells（±s， n=3）

表2 各組293T細胞中熒光素酶的相對活性（±s，n=3）Tab.2 Relative activity of luciferase in each group of 293T cells（±s， n=3）

Note：Compared with HMGA2-wt-3'-UTR+miR-NC， 1）P＜0.05.

Groups HMGA2-wt-3'-UTR+miR-NC HMGA2-wt-3'-UTR+miR-33b-5p HMGA2-mut-3'-UTR +miR-NC HMGA2-mut-3'-UTR+miR-33b-5p Relative activity of luciferase 1.00±0.06 0.73±0.061）1.00±0.04 1.07±0.04

3 討論

HMGA2在胃癌等常見癌癥中異常表達，并且通過不同的信號通路和作用機制發(fā)揮致癌基因的作用。miRNA雖然不直接參與蛋白質的編碼過程，但可以通過其他的途徑來間接地影響蛋白質的表達水平，從而發(fā)揮致癌或者抑癌的作用。miRNA與靶基因的3'-UTR存在著互補結合位點，可以通過直接與之結合使mRNA直接降解或者抑制后續(xù)的翻譯過程來影響相關蛋白的表達。隨著人們對癌癥研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)miRNA的靶向治療是一種非常好的治療方式，相比于常規(guī)的放療和化療來說，它的作用靶點更為單一，可以減少對正常細胞的損害，提高患者的術后治療效果，目前人們將兩種治療手段結合取得了較好的效果。

本研究通過生物信息學的相關方法和有關的靶點預測軟件，成功篩選出了miR-33b-5p的靶基因HMGA2以及結合位點，并且構建HMGA2 3'-UTR的雙熒光素酶報告基因載體驗證miR-33b-5p和HMGA2之間存在靶向關系。在本研究中，經(jīng)過一系列實驗驗證HMGA2基因片段和載體是成功結合了的，在后續(xù)的基因測序中發(fā)現(xiàn)重組結合后的基因序列與原基因序列并沒有發(fā)生突變，說明載體構建成功。另外在雙熒光素酶報告基因的實驗中發(fā)現(xiàn)miR-33b-5p可以降低野生型HMGA2基因3'-UTR雙熒光素酶活性，但是對于突變型質粒的活性則沒有抑制作用。本研究驗證了miR-33b-5p與HMGA2之間存在靶向關系，為后續(xù)具體分子機制的研究奠定了基礎。