張 恒，何 靜*，張小彥，張樹衡，李彥湘，張金花，程 永，李紅磊

(1.甘肅農業(yè)大學 林學院，甘肅 蘭州 730070；2.先正達(中國)投資有限公司，上海 200120)

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科多年生灌木，是食品與中藥制劑的常用原料，有治療腫瘤、抗疲勞、抗氧化、抗炎、護肝等多種功效[1-5]。枸杞不僅具有較高經(jīng)濟效益，因其可在重鹽堿地和干旱地區(qū)生存，也是優(yōu)良的生態(tài)修復樹種[6-7]，目前，已在寧夏、甘肅、青海和新疆等多個省份大面積種植[8]。然而，隨著枸杞栽培面積的不斷增加，枸杞病蟲害的發(fā)生率也逐年攀升，其中以枸杞根腐病的發(fā)生與危害程度最為突出。

枸杞根腐病作為一種土傳病害，已在我國各大枸杞產(chǎn)區(qū)發(fā)生[9]，主要危害栽培枸杞的根部或根莖部，常造成枸杞產(chǎn)量和品質下降，甚至導致樹木死亡，嚴重影響了枸杞的經(jīng)濟效益與生態(tài)效益。因環(huán)境差異，各地區(qū)枸杞根腐病的主要病原菌不盡一致[10-11]，經(jīng)鑒定甘肅省枸杞根腐病的主要病原菌為腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)[12]。目前，防治枸杞根腐病的主要途徑有生物防治和化學防治等。化學防治具有見效快和施用便捷等特點，在枸杞根腐病的防治過程中發(fā)揮了重要作用，有效地預防了枸杞根腐病的蔓延和加重。目前生產(chǎn)上用于枸杞根腐病防治的化學藥劑主要以多菌靈和甲基托布津等苯并咪唑類殺菌劑為主[13]，但因其作用位點單一，可預期產(chǎn)生抗藥性的風險較高[14]。因此，研究篩選防治枸杞根腐病的高效低毒殺菌劑并通過復配實現(xiàn)增效作用，不但可以降低抗藥性的風險，還可擴大防治譜，增強藥效，減少防治成本。

氟唑菌酰羥胺(pydiflumetofen)是由先正達公司研發(fā)的新型吡啶酰胺類殺菌劑，主要作用于琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)，通過干擾呼吸電子傳遞鏈復合體Ⅱ上的三羧酸循環(huán)來抑制線粒體的功能，阻止其產(chǎn)生能量，抑制病原菌生長，最終導致其死亡，已有報道稱氟唑菌酰羥胺對鐮刀菌有抑制作用[15]。咪鮮胺(prochloraz)為甾醇合成抑制劑類殺菌劑，主要影響甾醇的生物合成，使菌體細胞功能受到破壞，達到抑菌效果。已有研究發(fā)現(xiàn)咪鮮胺對腐皮鐮刀菌具有較好的抑菌效果[16-19]。由于咪鮮胺在土壤中的半衰期長、持效性好，因此長期處于含有一定質量濃度咪鮮胺的土壤中的病原菌存在一定抗藥性風險[20]。本研究測試了氟唑菌酰羥胺、咪鮮胺復配劑對腐皮鐮刀菌的室內毒力，旨在探明上述2種作用機制不同的藥劑對腐皮鐮刀菌的抑制效果，篩選最佳復配比例，為研究開發(fā)新的枸杞根腐病防治制劑、降低抗藥性風險提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種 來自甘肅農業(yè)大學森保實驗室保存的腐皮鐮刀菌，分離自枸杞根腐病病株，試驗前經(jīng)活化處理。

1.1.2 供試藥劑 99.7%氟唑菌酰羥胺TC，瑞士先正達作物保護有限公司；95.0%咪鮮胺TC，江蘇龍燈化學有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試藥劑對腐皮鐮刀菌菌絲的抑制效果 采用生長速率法[21]。將氟唑菌酰羥胺和咪鮮胺分別用丙酮配制成母液，按3∶2、9∶1、10∶1、5∶1、1∶3、2∶1、2∶3、3∶7、3∶1、1∶10、1∶5、8∶2、1∶1、1∶9、1∶2、7∶3、2∶8的有效質量濃度比例進行復配，用無菌水將各供試藥劑稀釋到所需質量濃度，分別加入滅菌后的PDA培養(yǎng)基中制成最終有效質量濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含藥PDA培養(yǎng)基，以含有等量丙酮的PDA培養(yǎng)基為對照，每處理重復3次。各處理與對照的培養(yǎng)基中丙酮含量均為0.16%。將直徑為7 mm的菌餅倒置在制作好的PDA平板中央，置于28 ℃、濕度為40%的黑暗條件下培養(yǎng)，待對照菌落生長至平板的80%時，采用十字交叉法測量菌落直徑，并按下式計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=

(1)

以藥劑質量濃度的對數(shù)值及對應的抑制百分率的幾率值作回歸分析，得出各處理的抑制率幾率值(y)與質量濃度對數(shù)(x)之間的毒力回歸方程、EC50值和相關系數(shù)。

1.2.2 最佳增效配比對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果 采用孢子萌發(fā)法[22]。將氟唑菌酰羥胺和咪鮮胺分別用丙酮配制成母液，按3∶2的有效質量濃度比例進行復配，用無菌水將各供試藥劑稀釋到所需質量濃度。腐皮鐮刀菌于28 ℃、濕度為40%的黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，在無菌環(huán)境中，從加入適量無菌水的PDA培養(yǎng)基上刮下菌絲與孢子，過濾后6 000 r·min-1離心，棄去上清液，用PD培養(yǎng)基調制懸浮液，將配置好的藥劑與懸浮液各吸取30 μL滴加于試管中搖勻，使其在低倍鏡下每視野約20～40個孢子。吸取1滴藥劑與懸浮液的混合液倒懸于載玻片上，制成最終有效質量濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含藥PD培養(yǎng)基載玻片。以含有等量丙酮的PD培養(yǎng)基載玻片為對照，每處理3個重復。各處理與對照的培養(yǎng)基中丙酮含量均為0.16%。置培養(yǎng)皿內保濕，(26±1) ℃恒溫培養(yǎng)6 h后，在低倍鏡下隨機抽取5個視野，約100個分生孢子，統(tǒng)計孢子萌發(fā)情況(以孢子芽管長度大于孢子短半徑者視為萌發(fā))，按下式計算孢子萌發(fā)相對抑制率。

(2)

孢子萌發(fā)相對抑制率=

(3)

以藥劑質量濃度的對數(shù)值及對應的抑制百分率的機率值作回歸分析，得出各處理的抑制率幾率值(y)與質量濃度對數(shù)(x)之間的毒力回歸方程、EC50值和相關系數(shù)。

1.2.3 復配增效評價方法 按Wadley法評價氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復配抑制腐皮鐮刀菌菌絲生長與孢子萌發(fā)的聯(lián)合毒力。

Wadley公式：

(4)

(5)

式中：A、B為單劑；a、b為相應單劑在混劑中的比例；ob為實際觀察值；th為理論值。

SR>1.5為增效作用；0.5≥SR≤1.5為相加作用；SR<0.5為拮抗作用。

1.2.4 最佳增效配比對腐皮鐮刀菌孢子芽管伸長的抑制效果 按照1.2.2方法制備孢子懸浮液，吸取1滴藥劑與懸浮液的混合液倒懸于載玻片上，制成最終有效質量濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含藥PD培養(yǎng)基載玻片，以含有等量丙酮的PD培養(yǎng)基為對照，置培養(yǎng)皿內保濕，(26±1) ℃恒溫培養(yǎng)6 h后，隨機抽取20個分生孢子，測量孢子芽管長度，每處理3次重復。按下式計算芽管伸長抑制率。

芽管伸長抑制率=

(6)

1.2.5 最佳增效配比對腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制效果 按照1.2.1方法制備最終有效質量濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含藥PDA培養(yǎng)基，以含有等量丙酮的PDA培養(yǎng)基載玻片為對照，將腐皮鐮刀菌菌餅接種于含藥培養(yǎng)基上，置于28 ℃、濕度為40%的黑暗條件下培養(yǎng)7 d，在無菌環(huán)境中，從加入無菌水的PDA培養(yǎng)基上刮下菌絲與孢子，用4層紗布過濾出菌絲后，混勻孢子懸浮液，在血球計數(shù)板上統(tǒng)計各處理孢子數(shù)量，每處理3次重復。按下式計算產(chǎn)孢量抑制率。

產(chǎn)孢量抑制率=

(7)

1.2.6 最佳增效配比對腐皮鐮刀菌菌絲干重的抑制效果 按照1.2.2方法制備孢子懸浮液，吸取30 μL接種于滅菌后的PD培養(yǎng)基中，搖床28 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)12 h后，于無菌環(huán)境中分別加入各質量濃度處理試劑，使其終有效質量濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1，對照PD培養(yǎng)基中加入等量的丙酮，繼續(xù)于搖床上培養(yǎng)12 h后，用2層濾紙抽濾出菌絲，50 ℃烘干至恒重后，在電子天平上稱量菌絲干重，每處理3次重復。按下式計算菌絲干重抑制率。

菌絲干重抑制率=

(8)

2 結果與分析

2.1 氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復配對腐皮鐮刀菌菌絲生長的聯(lián)合毒力

由表1可知，氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺單劑的EC50值分別為0.120 8、0.365 8 mg·L-1，表現(xiàn)為咪鮮胺的抑菌效果較好。在復配試驗中，不同供試比例的氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復配均有較強的抑菌效果。全部供試復配比例的EC50值均小于氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑處理。

表1 氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺及其復配劑對腐皮鐮刀菌菌絲生長的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of pydiflumetofen,prochloraz and their compound on mycelial growth of Fusarium solani

氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺配比為3∶2、9∶1、10∶1、5∶1、1∶3、2∶1、2∶3、3∶7、3∶1、1∶10、1∶5、8∶2、1∶1、1∶9、1∶2、7∶3時的增效系數(shù)(SR)均大于1.5，表現(xiàn)為增效作用。在氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺配比為2∶8時的SR值為0.5～1.5，表現(xiàn)為相加作用。氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺各復配比例的增效強弱依次為：3∶2、9∶1、10∶1、5∶1、1∶3、2∶1、2∶3、3∶7、3∶1、1∶10、1∶5、8∶2、1∶1、1∶9、1∶2、7∶3、2∶8。其中，以氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復配比例在3∶2時的增效作用最大，其SR達到了4.560 0，可作為氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復配防治枸杞根腐病的最佳配比處理。

2.2 最佳配比對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果

由表2可知，氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑對腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)均具有一定的抑制效果，其EC50值分別為0.116 7 mg·L-1和1 455.784 8 mg·L-1，其中以氟唑菌酰羥胺對腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)抑制效果較好。氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺配比為3∶2時的EC50值為0.060 2 mg·L-1，對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果優(yōu)于2種單劑，增效系數(shù)(SR)為3.102 9，表現(xiàn)為增效作用。

表2 氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺及其復配劑對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of pydiflumetofen,prochloraz and their compound on spore germination of F.solani

2.3 最佳配比對腐皮鐮刀菌芽管伸長的抑制效果

由圖1可知，氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑的各質量濃度處理對腐皮鐮刀菌孢子的芽管伸長均具有一定的抑制效果，其中以氟唑菌酰羥胺對腐皮鐮刀菌孢子芽管伸長的抑制效果較好。各處理對腐皮鐮刀菌孢子芽管伸長的抑制率均隨處理質量濃度增加而升高。復配處理在0.8 mg·L-1質量濃度下對腐皮鐮刀菌孢子芽管伸長的抑制率達83.30%，顯著高于2種單劑。

2.4 最佳配比對腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制效果

由圖2可知，氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑的各質量濃度處理對腐皮鐮刀菌孢子產(chǎn)孢量均具有一定的抑制效果，以氟唑菌酰羥胺對腐皮鐮刀菌孢子產(chǎn)孢量的抑制效果較好。復配處理在0.1 mg·L-1質量濃度處理下，對腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制率顯著高于2種單劑處理。在有效質量濃度為0.4 mg·L-1時，復配處理對腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制率達100%。在有效質量濃度為0.8 mg·L-1時，氟唑菌酰羥胺與復配處理對腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制率均達100%。

2.5 最佳配比對腐皮鐮刀菌菌絲干重的抑制效果

由圖3可知，氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑的各質量濃度處理對腐皮鐮刀菌菌絲干重均具有一定的抑制效果，其中以氟唑菌酰羥胺單劑處理對腐皮鐮刀菌菌絲干重的抑制效果較好。各處理對腐皮鐮刀菌孢子菌絲干重的抑制率均隨處理質量濃度增加而升高。復配處理在0.8 mg·L-1質量濃度處理下，對腐皮鐮刀菌菌絲干重的抑制率達到66.71%，顯著高于2種單劑處理。

3 結論與討論

3.1 結論

選用氟唑菌酰羥胺單劑與咪鮮胺單劑及其二者不同比例的復配處理對枸杞根腐病主要病原菌——腐皮鐮刀菌進行了菌絲生長、孢子萌發(fā)、芽管伸長、產(chǎn)孢量、菌絲干重的抑制試驗。結果表明：氟唑菌酰羥胺單劑與咪鮮胺單劑及其復配處理對供試腐皮鐮刀菌的各生長發(fā)育階段均具有不同程度的抑制作用。在單劑處理中，以咪鮮胺對腐皮鐮刀菌的菌絲生長抑制作用較好，以氟唑菌酰羥胺對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)、芽管伸長、產(chǎn)孢量、菌絲干重的抑制效果較好。在復配處理中，以氟唑菌酰羥與咪鮮胺配比為3∶2時，對腐皮鐮刀菌菌絲生長抑制的增效作用最強，其增效系數(shù)SR值達到了4.560 0，可作為氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復配防治枸杞根腐病的最佳比例。3∶2復配處理對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制有增效作用，其增效系數(shù)SR值達到了3.231 1。氟唑菌酰羥胺、咪鮮胺單劑及3∶2復配處理的各質量濃度處理對腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量、芽管伸長、菌絲干重均具有一定的抑制效果，在質量濃度為0.8 mg·L-1時，3∶2復配處理對腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制率達100%，對芽管伸長、菌絲干重的抑制率均顯著高于2種單劑處理，在低質量濃度下增效作用不顯著。該研究結果將為預防腐皮鐮刀菌對氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑產(chǎn)生耐藥性具有重要意義。

3.2 討論

在單劑處理中，氟唑菌酰羥胺和咪鮮胺在對腐皮鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用強弱表現(xiàn)并不一致，這可能與二者的作用位點和抑菌機制不同有一定關系。咪鮮胺可抑制菌體麥角甾醇合成，故對消耗能量較小的菌絲生長的抑制作用更為明顯[23]，而對孢子萌發(fā)沒有明顯的抑制效果。劉礎榮等[24]在篩選防治紅棗黑斑病的殺菌劑時發(fā)現(xiàn)：以三唑類為代表的麥角甾醇生物抑制劑對病原菌孢子萌發(fā)沒有明顯的抑制效果，這與本研究結果一致。氟唑菌酰羥胺作為吡啶酰胺類殺菌劑，主要抑制菌體的能量代謝，因此，這對需要較大能量的孢子萌發(fā)過程影響較大[25]。在質量濃度為0.8 mg·L-1時，3∶2復配處理對腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制率達到了100%，芽管伸長、菌絲干重的抑制效果均顯著高于2種單劑處理，在低質量濃度下增效作用不顯著，因此復配劑在田間病情嚴重時適當增加施用質量濃度，增效效果可能更明顯。

氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺對枸杞根腐病的防治鮮有報道。本研究中，咪鮮胺作為甾醇生物合成抑制劑(sterol biosynthesis inhibitors,SBIs)中應用最廣泛的C-14α-脫甲基化酶抑制劑(C-14-α-demethylation inhibitors,DMIs)，對核桃黑斑病[26]、藍莓根腐病[27]、水稻惡苗病[28]等多種病害具有防治作用。但有研究表明，一些病原菌已對咪鮮胺產(chǎn)生了一定的抗藥性風險。在江蘇省部分稻區(qū)，田間惡苗病菌對咪鮮胺已有一定的抗藥性[29-31]。中國華北地區(qū)瓜類尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)在藥劑選擇壓力下也可形成抗咪鮮胺群體，具有抗藥性風險[32]。咪鮮胺為甘肅枸杞產(chǎn)區(qū)、青海枸杞產(chǎn)區(qū)的常用殺菌劑[33]，故降低腐皮鐮刀菌對其的抗性風險尤為重要。

在許多情況下，病原菌對SBIs殺菌劑的抗藥性機制是由于抗藥性突變體能夠主動將藥物排出體外[34-36]，即藥物外排泵基因過表達。本研究選用吡啶酰胺類殺菌劑——氟唑菌酰羥胺作為咪鮮胺的復配制劑，可通過抑制病原菌ATP的產(chǎn)生，發(fā)揮其抑制菌體線粒體功能的作用，影響病原菌的能量代謝，限制藥劑外排泵對咪鮮胺的主動運輸。當咪鮮胺與氟唑菌酰羥胺復配劑被應用于枸杞根腐病的田間防治時，在造成腐皮鐮刀菌麥角甾醇被抑制的同時，可能影響線粒體呼吸作用，例如A.Ciriglianoetal[37]發(fā)現(xiàn)酵母細胞中麥角甾醇被抑制時，會引起線粒體DNA的丟失，從而影響線粒體呼吸作用。2種機制相互作用，表現(xiàn)出氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復配劑的抑菌增效作用，該研究結果將為研究開發(fā)新的枸杞根腐病防治制劑、降低抗藥性風險提供理論參考。