余淑華 何春琳 張培 楊東偉

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）02-0191-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.02.11

摘 要 目的 研究番石榴葉總黃酮對高血壓模型大鼠心肌肥厚的改善作用。方法 從60只健康SD大鼠中隨機取10只作為正常組;另外50只大鼠復(fù)制高血壓模型，將其中建模成功的44只采用隨機體質(zhì)量排序法分為模型組、茴香霉素組[p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）激活劑，1 mg/kg]、番石榴葉總黃酮+茴香霉素組（200 mg/kg番石榴葉總黃酮+1 mg/kg茴香霉素）、番石榴葉總黃酮組（200 mg/kg），每組11只。正常組和模型組大鼠灌胃3%羥甲基纖維素鈉溶液，其余各組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，每天1次，連續(xù)6周。檢測大鼠血壓（收縮壓、舒張壓、平均動脈壓）水平和心臟指數(shù)、左心室指數(shù);檢測大鼠心肌組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6水平;觀察大鼠心肌組織的病理形態(tài)學(xué)變化;檢測大鼠心肌組織中p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）蛋白的表達水平。結(jié)果 與正常組比較，茴香霉素組、模型組大鼠的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓水平，心臟指數(shù)、左心室指數(shù)和心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05）;心肌細胞肥大，心肌纖維走向紊亂，心肌纖維間結(jié)締組織疏松水腫、增生，炎癥細胞浸潤增多等。與茴香霉素組、模型組比較，番石榴葉總黃酮+茴香霉素組、番石榴葉總黃酮組大鼠上述指標水平均顯著降低（P<0.05）;心肌細胞稍大、排列尚可，心肌細胞肥大程度及結(jié)締組織疏松水腫、增生情況減輕，且番石榴葉總黃酮組的改善效果更為顯著（P<0.05）。結(jié)論 番石榴葉總黃酮可降低高血壓模型大鼠的血壓水平，并改善其心肌肥厚，其作用機制可能與抑制p38 MAPK信號通路活性及炎癥因子表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 番石榴葉總黃酮;高血壓;心肌肥厚;p38 絲裂原活化蛋白激酶;炎癥因子;大鼠

Improvement effects of total flavonoids of Psidium guajava leaves on myocardial hypertrophy in hypertensive model rats

YU Shuhua1，HE Chunlin1，ZHANG Pei1，YANG Dongwei2（1. Dept. of Hypertension， Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University， Zhengzhou 450007， China; 2. Dept. of Cardiovascular Medicine， Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University， Zhengzhou 450007， China）

ABSTRACT OBJECTIVE To study the improvement effects of total flavonoids of Psidium guajava leaves on myocardial hypertrophy in hypertensive model rats. METHODS Ten rats were randomly selected from 60 healthy SD rats as the normal group; other 50 rats established hypertensive model， and 44 rats with successful modeling were randomly divided into model group， anisomycin group [p38 mitogen-activated protein kinase （p38 MAPK） activator， 1 mg/kg]， total flavonoids of P. guajava leaves+anisomycin group （200 mg/kg total flavonoids+1 mg/kg anisomycin） and total flavonoids of P. guajava leaves group （200 mg/kg） by random volume mass ranking method， with 11 rats in each group. Rats in normal group and model group were given 3% hydroxymethylcellulose sodium solution， and other groups were given relevant solution intragastrically， once a day， for consecutive 6 weeks. Blood pressure （systolic blood pressure， diastolic blood pressure， mean arterial pressure）， cardiac index and left ventricular index were measured. The levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）and IL-6 in myocardial tissue were detected. The pathomorphological changes of myocardial tissue were observed. The expression of p38 MAPK， phosphorylated p38 MAPK （p-p38 MAPK）， extracellular regulated protein kinase 1/2 （ERK1/2）， phosphorylated ERK1/2 （p-ERK1/2）， c-Jun N-terminal kinase （JNK） and phosphorylated JNK （p-JNK） in myocardial tissue were detected. RESULTS Compared with normal group， the systolic blood pressure， diastolic blood pressure， mean arterial pressure， cardiac index， left ventricular index as well as the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 and protein expression of p-p38 MAPK， p-ERK1/2 and p-JNK in myocardial tissue were increased significantly in anisomycin group and model group （P<0.05）; it was also found that hypertrophy of cardiomyocytes， disorder of myocardial fibers， looseness， edema and proliferation of connective tissue between myocardial fibers， increased infiltration of inflammatory cells， etc. Compared with anisomycin group and model group， the levels of above indexes in total flavonoids of P. guajava leaves+anisomycin group and total flavonoids of P. guajava leaves group were decreased significantly （P<0.05）; cardiomyocytes were slightly larger and arranged reasonably; the degree of myocardial hypertrophy， looseness， edema and proliferation of connective tissue were relieved， and the improvement effect of total flavonoids of P. guajava leaves group was more significant （P<0.05）. CONCLUSIONS The total flavonoids of P. guajava leaves can reduce blood pressure and improve myocardial hypertrophy in hypertensive model rats. Its mechanism may be related to the inhibition of p38 MAPK signal pathway activity and the expression of inflammatory factors.

KEYWORDS total flavonoids of Psidium guajava; hypertension; myocardial hypertrophy; p38 mitogen-activated protein kinase; inflammatory factors; rat

高血壓是一種常見的慢性疾病，也是心臟對慢性壓力、容量負荷的一種反應(yīng)，左心室心肌肥厚為其早期并發(fā)癥之一[1]。若不及時干預(yù)，持續(xù)性心肌肥厚可引發(fā)心力衰竭、惡性心律失常甚至猝死，是導(dǎo)致心血管疾病患病率、病死率升高的危險因素之一[2]。因此，臨床治療高血壓不僅需調(diào)整血壓水平，還應(yīng)防治高血壓性心肌肥厚，以改善患者預(yù)后。

目前，西醫(yī)在控制高血壓性心肌肥厚上仍無特效治療藥物。研究顯示，天然植物中提取的黃酮類化合物在心肌梗死、缺血再灌注損傷等疾病中具有心肌保護作用[3-4]。番石榴葉是一種常用中草藥，具有甘平養(yǎng)胃、生津止渴、斂澀固陰等功效，其有效成分番石榴葉總黃酮已被證實對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的乳鼠心肌細胞肥大具有抑制作用[5]，但番石榴葉總黃酮是否對高血壓性心肌肥厚具有改善作用，尚不明確。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信號通路存在于大多數(shù)細胞中，可將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞內(nèi)，從而參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等過程，已被證實為高血壓治療靶點之一，且在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6]。因此，基于該信號通路研究藥物的降壓和心肌肥厚的改善作用機制具有積極的指導(dǎo)意義。基于此，本研究復(fù)制大鼠高血壓模型，以探討番石榴葉總黃酮對該模型大鼠血壓和心肌肥厚的改善作用，并基于p38 MAPK信號通路深入研究其作用機制，以期為番石榴葉總黃酮的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：BP-2010A型小動物無創(chuàng)血壓儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），Vevo2100型微小超聲心動圖儀（加拿大VisualSonics公司），MultiSkan3型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Image Quant LAS4000型生物分子成像儀（美國Danaher公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

番石榴葉總黃酮浸膏由天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所制劑中心制備，每3.5 kg原藥材制成浸膏700 g;茴香霉素對照品（p38 MAPK通路激活劑，批號190212，純度≥99%）購自上海懋康生物科技有限公司;腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒均購自南京金益柏生物科技有限公司（批號分別為JEB-13521、JEB-13493、JEB-13635）;蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗大鼠p38 MAPK單克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK）單克隆抗體、兔抗大鼠細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase1/2，ERK1/2）單克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）單克隆抗體、兔抗大鼠c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）單克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化JNK（phosphorylated JNK，p-JNK）單克隆抗體、兔抗大鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號分別為181206、181115、190514、190628、180827、200105、190817、200424）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級健康SD雄性大鼠，7周齡，體質(zhì)量260～280 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0011。實驗前將大鼠在溫度（22±2） ℃、相對濕度55%、12 h光照環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，期間自由攝食、飲水。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院動物倫理委員會批準，且動物處置符合“3R”原則。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

從60只健康SD大鼠中隨機取10只作為正常組，另50只大鼠建立高血壓模型，具體方法如下：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg，下同）進行麻醉，于雙腎動脈上段0.5 cm處行腹主動脈分離，放置一小圓棒（直徑0.6 mm），一同結(jié)扎腹主動脈和小圓棒;將小圓棒抽出，使腹主動脈縮窄，然后縫合傷口[7]。造模4周后，采用小動物無創(chuàng)血壓儀檢測大鼠安靜狀態(tài)下的尾動脈血壓，當收縮壓≥140 mmHg和（或）舒張壓≥90 mmHg時（1 mmHg=0.133 3 kPa），表明造模成功。本研究造模成功的大鼠共44只。

將44只造模成功的大鼠采用隨機體質(zhì)量排序法分為模型組、茴香霉素組（1 mg/kg）、番石榴葉總黃酮+茴香霉素組（200 mg/kg 番石榴葉總黃酮+1 mg/kg茴香霉素）、番石榴葉總黃酮組（200 mg/kg），每組11只。茴香霉素劑量參考文獻[8]設(shè)置，番石榴葉總黃酮劑量參考文獻[9]設(shè)置。正常組大鼠術(shù)中僅分離腹主動脈，不作其他處理。正常組、模型組大鼠灌胃3%羥甲基纖維素鈉溶液，其余各組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)6周。

2.2 大鼠血壓水平的檢測

末次給藥后24 h，采用尾袖法將各組大鼠的尾部連接至小動物無創(chuàng)血壓儀，然后檢測各組大鼠的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓（平行測定3次，取平均值）。

2.3 大鼠心肌肥厚指標的檢測

血壓檢測結(jié)束后，各組隨機取5只大鼠，稱定體質(zhì)量，隨后腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行麻醉，快速斷頭處死，打開胸腔取出心臟，以生理鹽水沖洗，殘余液體以濾紙吸除干凈，然后稱定全心質(zhì)量;將心臟置于冰塊上，去除大血管、心包組織，沿室間隔去除心房、右心室，稱定左心室濕質(zhì)量;分別計算心臟指數(shù)（心臟指數(shù)=全心質(zhì)量/體質(zhì)量）、左心室指數(shù)（左心室指數(shù)=左心室濕質(zhì)量/體質(zhì)量）。

2.4 取材及處理

從各組剩余大鼠中隨機取5只，腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行麻醉，快速斷頭處死，迅速打開胸腔，剝?nèi)⌒呐K，沿房室環(huán)剪除心房及右心室游離壁，即得心肌組織。將各組大鼠的心肌組織分為3份，其中2份置于液氮中冷凍保存，1份置于4%多聚甲醛中固定，備用。

2.5 大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行檢測。各組分別取1份凍存的心肌組織，以生理鹽水沖洗，冰浴條件下研磨，以制備10%心肌組織勻漿;將組織勻漿以10 000 r/min離心15 min，取上清液，按酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書方法操作，采用酶標儀于450 nm波長處測定大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

2.6 大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取各組固定于4%多聚甲醛中的心肌組織適量，以流水沖洗，再進行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度為4 μm）。將所有切片經(jīng)乙醇梯度脫蠟后進行HE染色，然后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

2.7 大鼠心肌組織中p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。取各組另1份凍存的心肌組織適量，加入裂解液裂解，以14 000 r/min離心15 min，取上清液，以BCA法測定蛋白含量。蛋白經(jīng)煮沸變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉1 h;以TBST洗膜10 min×4次，加入p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;以TBST洗膜10 min×4次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 2 500），室溫孵育2 h;以TBST洗膜10 min×4次，加入ECL試劑顯色5 min，采用生物分子成像儀顯影曝光。采用Image J v1.8.0軟件對條帶灰度值進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 番石榴葉總黃酮對大鼠血壓水平的影響

與正常組比較，模型組和茴香霉素組大鼠的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組和茴香霉素組比較，番石榴葉總黃酮組、番石榴葉總黃酮+茴香霉素組大鼠的上述血壓水平均顯著降低（P<0.05）;與番石榴葉總黃酮+茴香霉素組比較，番石榴葉總黃酮組大鼠的上述血壓水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表1。

a：與正常組比較，P<0.05;b：與模型組比較，P<0.05;c：與茴香霉素組比較，P<0.05;d：與番石榴葉總黃酮+茴香霉素組比較，P<0.05

3.2 番石榴葉總黃酮對大鼠心肌肥厚指標的影響

與正常組比較，模型組和茴香霉素組大鼠心臟指數(shù)、左心室指數(shù)均顯著升高（P<0.05）;與模型組和茴香霉素組比較，番石榴葉總黃酮組、番石榴葉總黃酮+茴香霉素組大鼠心臟指數(shù)、左心室指數(shù)均顯著降低（P<0.05）;與番石榴葉總黃酮+茴香霉素組比較，番石榴葉總黃酮組大鼠心臟指數(shù)、左心室指數(shù)均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表2。

3.3 番石榴葉總黃酮對大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

與正常組比較，模型組和茴香霉素組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組和茴香霉素組比較，番石榴葉總黃酮組、番石榴葉總黃酮+茴香霉素組大鼠心肌組織中上述指標水平均顯著降低（P<0.05）;與番石榴葉總黃酮+茴香霉素組比較，番石榴葉總黃酮組大鼠心肌組織中上述指標水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表3。

3.4 番石榴葉總黃酮對大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)的影響

正常組大鼠心肌結(jié)構(gòu)完整，心肌細胞正常，心肌纖維排列整齊，無細胞腫脹。模型組和茴香霉素組大鼠心肌細胞異常肥大，心肌纖維走向紊亂、橫徑增加，心肌纖維間結(jié)締組織疏松水腫、增生，炎癥細胞浸潤增多，且茴香霉素組大鼠上述癥狀更為嚴重。與模型組和茴香霉素組比較，番石榴葉總黃酮組、番石榴葉總黃酮+茴香霉素組大鼠心肌細胞稍大、排列尚可，心肌細胞肥大程度及結(jié)締組織疏松水腫、增生情況減輕，炎癥細胞浸潤減少，其中番石榴葉總黃酮組大鼠改善更顯著。結(jié)果見圖1（正常組略）。

3.5 番石榴葉總黃酮對大鼠心肌組織中p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組和茴香霉素組大鼠心肌組織中p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組和茴香霉素組比較，番石榴葉總黃酮組、番石榴葉總黃酮+茴香霉素組大鼠心肌組織中上述3種蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05）;與番石榴葉總黃酮+茴香霉素組比較，番石榴葉總黃酮組大鼠心肌組織中上述3種蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見圖2、表4。

4 討論

長時間高血壓可引起心臟結(jié)構(gòu)異常，誘發(fā)心肌肥厚，主要特征為心肌細胞肥大、細胞間質(zhì)增生及蛋白含量增多[10]。心肌肥厚是一種病理狀態(tài)代償反應(yīng)，為心臟負荷、炎癥因子等多種外界因素及心肌內(nèi)在缺陷共同作用的結(jié)果[11]。因此，在控制血壓的同時，減輕機體炎癥反應(yīng)、抑制心肌細胞肥大、減輕心功能損害是治療高血壓性心肌肥厚的關(guān)鍵。近年來，臨床用于控制血壓、抑制心肌肥厚以及減輕心功能損害的藥物逐漸增多，但僅有少數(shù)高血壓患者的癥狀得以控制[12]。中醫(yī)藥防治高血壓所致心肌肥厚的臨床研究雖起步較晚，但進展較快，逐漸引起臨床高度關(guān)注。

相關(guān)報道顯示，異葉青蘭總黃酮、杭白菊總黃酮、榅桲總黃酮等多種植物黃酮類成分對實驗動物心肌肥厚具有明顯的抑制作用，表明黃酮類化合物對心肌肥厚具有潛在的治療作用[13-15]。基于此，本文研究了番石榴葉總黃酮對高血壓模型大鼠心肌肥厚的改善作用。TNF-α、IL-1β、IL-6可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進心肌細胞凋亡，進一步造成心肌組織壞死[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)番石榴葉總黃酮干預(yù)后，大鼠收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、心臟指數(shù)、左心室指數(shù)及心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著降低;進一步病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌細胞稍大、排列尚可，心肌細胞肥大程度及結(jié)締組織疏松水腫、增生情況減輕，炎癥細胞浸潤減少。這表明番石榴葉總黃酮對高血壓模型大鼠心肌肥厚的改善作用與抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的表達有關(guān)。

p38 MAPK信號通路是真核細胞的重要通路，活化的p38 MAPK進入細胞核后，可激活其下游底物，如ERK1/2、JNK等，從而調(diào)控細胞的生長[17]。有關(guān)報道顯示，p38 MAPK信號通路參與了心肌缺血、心肌肥厚、心力衰竭等病理過程，抑制該通路可減輕心肌肥厚[18]。另外，p38 MAPK信號通路還是細胞外多種炎癥刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核內(nèi)的重要通路，當其被激活后，可參與調(diào)控TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達，在高血壓及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[19]。茴香霉素是常用的p38 MAPK信號通路激活劑[20]，因此，本研究以茴香霉素為參照，探討番石榴葉總黃酮是否可通過影響p38 MAPK信號通路活性來改善高血壓模型大鼠的心肌肥厚。結(jié)果顯示，經(jīng)茴香霉素干預(yù)后，該組大鼠心肌肥厚程度較模型組大鼠更為嚴重，心肌組織中p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達水平均顯著升高，表明激活p38 MAPK信號通路可促進高血壓模型大鼠的心肌肥厚。而經(jīng)番石榴葉總黃酮干預(yù)后，該組大鼠心肌組織中上述3種蛋白的表達水平均顯著降低;進一步經(jīng)番石榴葉總黃酮和茴香霉素聯(lián)合干預(yù)后顯示，該組大鼠心肌組織中上述蛋白表達水平較番石榴葉總黃酮組顯著升高，表明番石榴葉總黃酮可通過抑制p38 MAPK信號通路活性而改善高血壓模型大鼠的心肌肥厚。

綜上所述，番石榴葉總黃酮可降低高血壓模型大鼠的血壓水平，并改善其心肌肥厚，其作用機制可能與抑制p38 MAPK信號通路活性及炎癥因子表達有關(guān)。

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（收稿日期：2021-07-20 修回日期：2021-11-16）

（編輯：唐曉蓮）