蔣海嬌，郭建華*，李永翔，史 秀

（齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

北冰紅葡萄是目前國(guó)內(nèi)外培育出的第一個(gè)釀造冰葡萄酒的山葡萄品種，是含山葡萄血緣的雜種后代[1]。具有較強(qiáng)的抗寒性和抗病性，產(chǎn)量穩(wěn)定，果粒出汁高，是我國(guó)北方寒冷地區(qū)釀造優(yōu)質(zhì)冰紅葡萄酒及干紅葡萄酒的原料[2-3]。其中，通化釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)的自然環(huán)境優(yōu)良，所以北冰紅葡萄也已經(jīng)成為當(dāng)?shù)靥厣玔4]。而且北冰紅葡萄富含花青素、維生素C（vitamin C，VC）以及白黎蘆醇等，釀造的葡萄酒色澤呈深寶石紅色，具有濃郁的蜂蜜香氣，醇厚宜人，有液體紫晶之稱[5-8]。

北冰紅山葡萄作為高檔冰紅葡萄酒原料，由其釀造的冰葡萄酒具有獨(dú)特的風(fēng)格，蜜香氣與果香氣馥郁宜人[9-11]。但北冰紅山葡萄果實(shí)酸度高，釀制的果酒出現(xiàn)品質(zhì)參差不齊等問(wèn)題。南海龍等[12]研究北冰紅冰葡萄酒的釀造工藝，表明北冰紅山葡萄是釀造高品質(zhì)冰酒的理想原料。佟曉芳[13]采用人工制冷冰凍的工藝，使葡萄汁中濃縮很高的糖、酸和風(fēng)味成分，利用冰凍條件的優(yōu)化，從而制成低成本高品質(zhì)的冰酒。金宇寧等[14]對(duì)吉林通化不同產(chǎn)區(qū)的北冰紅冰葡萄酒的理化指標(biāo)、香氣成分及感官特性進(jìn)行了分析比較。但在目前的研究中缺乏通過(guò)優(yōu)化北冰紅冰葡萄酒發(fā)酵工藝在一定程度上改善冰葡萄酒酒質(zhì)，豐富口感以及在不同發(fā)酵條件下對(duì)冰酒發(fā)酵性能的影響，而且單一的使用商業(yè)酵母進(jìn)行冰酒發(fā)酵，會(huì)造成冰酒口味缺乏典型性，香氣薄弱，很難表現(xiàn)出我國(guó)冰酒特色[15-16]。

本研究以北冰紅冰葡萄為原料，利用實(shí)驗(yàn)室篩選得到的冰酒專用酵母為發(fā)酵菌種，釀造成感官特性優(yōu)良的高品質(zhì)冰酒，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交優(yōu)化發(fā)酵工藝，旨在提高冰酒品質(zhì)及產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北冰紅冰葡萄：吉林省集安市上品酒莊；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：本實(shí)驗(yàn)室自行篩選、鑒定及保藏（菌落為圓形、白色、凸起，出芽生殖，耐酒精，高糖等抗性）；酒石酸：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水碳酸鈉：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；偏重亞硫酸鈉：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；果膠酶（酶活10萬(wàn)U/g）：河南萬(wàn)邦化工科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150II恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JBQ-ZD全溫振蕩器：常州普天儀器制造有限公司；DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌器：上海申安儀器有限公司；ES200精密電子天平：天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海雷磁-上海儀電科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺(tái)：上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 北冰紅冰葡萄酒的釀造工藝及操作要點(diǎn)[17，18]

北冰紅山葡萄→低溫榨汁→澄清處理→接種酵母→低溫發(fā)酵→發(fā)酵中止→澄清→過(guò)濾→殺菌→灌裝→成品

操作要點(diǎn)：

低溫榨汁：挑選無(wú)腐爛，無(wú)壞果的北冰紅冰葡萄，在-8 ℃的冰凍狀態(tài)下進(jìn)行低溫壓榨。

果膠酶處理：按0.04 mg/L的果膠酶添加量加入果漿中，在38 ℃的培養(yǎng)基中酶解5 h，進(jìn)行澄清。

酵母培養(yǎng)液：在100 mL已滅菌的冰葡萄汁液體培養(yǎng)基中，接入2～3環(huán)斜面保藏的酵母菌株，在30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

接種酵母：調(diào)整SO2（偏重亞硫酸鈉）的添加量在60mg/L，靜置2 h后，接種一定量的酵母培養(yǎng)液。

低溫發(fā)酵：將處理后的冰葡萄汁裝入發(fā)酵罐中，安上發(fā)酵栓。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置發(fā)酵溫度16 ℃條件下發(fā)酵20 d。

過(guò)濾除菌：發(fā)酵完成后，使用0.22 μm的過(guò)濾芯進(jìn)行除菌，得到冰葡萄酒樣品。

1.3.2 冰酒發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先以冰葡萄汁酵母接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、發(fā)酵溫度（10℃、13℃、16℃、20℃、25℃）、初始糖度（320g/L、340 g/L、360 g/L、380 g/L、400 g/L）、初始pH值（2.9、3.3、3.7、4.1、4.5）為影響因素。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以感官評(píng)分和酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取酵母菌接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始糖度（C）和初始pH值（D）為影響因素進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，每組試驗(yàn)做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization

1.3.3 檢測(cè)方法

還原糖、總酸、酒精度：參照國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測(cè)定[19]；pH：精密酸度計(jì)[20]。

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

組織10名葡萄酒品評(píng)培訓(xùn)人員，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]，從色澤、澄清度、果香、酒香、滋味、典型性對(duì)北冰紅冰葡萄酒進(jìn)行感官評(píng)分，滿分100分。冰葡萄酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 北冰紅冰葡萄酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of Beibinghong ice wine

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)助手V3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 北冰紅冰葡萄酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始含糖量對(duì)冰酒發(fā)酵性能及品質(zhì)的影響

酵母利用糖分轉(zhuǎn)化為酒精、酸和酯類等物質(zhì)[21]。由圖1可知，當(dāng)初始糖度為320 g/L時(shí)，發(fā)酵前4 d的降糖速率為40.75 g/L；初始糖度為360 g/L，發(fā)酵前4 d的降糖速率是37 g/L，而初始糖度為400 g/L時(shí)，降糖速率僅為22.5 g/L，這是由于高糖造成的滲透壓增大，酵母代謝異常，從而使發(fā)酵變得緩慢[22]，由此說(shuō)明初始含糖量對(duì)冰酒的發(fā)酵性能產(chǎn)生了很大的影響。

圖1 在不同初始糖度下冰葡萄酒殘?zhí)呛康淖兓疐ig.1 Changes of residual sugar contents of ice wine with different initial sugar contents

由圖2可知，隨著冰葡萄汁初始糖度在320～400 g/L范圍內(nèi)的升高，冰酒的酒精度持續(xù)下降，殘?zhí)遣粩嘣黾?，總酸和感官分值呈先升高后下降的趨?shì)，當(dāng)初始含糖量＜360g/L時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)禽^少且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB15037—2006《葡萄酒》（殘?zhí)牵?25.0 g/L），口感發(fā)酸，感官評(píng)分偏低；在初始糖度為360 g/L時(shí)，酒體的感官評(píng)分最高為89分，酒精度為12.3%vol，總酸為11.81 g/L，殘?zhí)菫?28 g/L，此時(shí)冰酒酸甜適中，品質(zhì)最佳。當(dāng)初始糖度＞360 g/L時(shí)，殘?zhí)沁^(guò)多，反而不利于酵母菌的繁殖，所以冰酒的酒精度下降，由于口感過(guò)甜也導(dǎo)致感官評(píng)分不高。綜上，選擇最佳初始糖度為360 g/L。

圖2 不同初始糖度對(duì)冰葡萄酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of different initial sugar contents on ice wine quality

2.1.2 不同接種量對(duì)冰酒發(fā)酵性能及品質(zhì)的影響

酵母接種量直接影響著發(fā)酵時(shí)間，適當(dāng)?shù)慕湍附臃N量有助于啟動(dòng)發(fā)酵和減少發(fā)酵時(shí)間，同時(shí)也避免了因?yàn)閱?dòng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而造成雜菌污染[23]。由圖3可知，隨著接種量的增大，降糖速率也隨之增大。在接種量為2%時(shí)，前4 d的降糖速率為2.75 g/L，是因?yàn)榻湍柑砑恿窟^(guò)少，利用的糖有限；在接種量為10%時(shí)，酵母發(fā)酵速率很快，約為31.5 g/L，是2%接種量降糖速率的11倍。

圖3 在不同酵母接種量下冰葡萄酒殘?zhí)堑淖兓疐ig.3 Changes of residual sugar contents of ice wine with different yeast inoculum

由圖4可知，酵母菌接種量在2%～10%范圍內(nèi)，隨著酵母菌接種量逐漸增加，北冰紅冰葡萄酒的酒精度、總酸、感官評(píng)分呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)接種量2%～6%時(shí)，接種量與酒精度呈正相關(guān)；當(dāng)接種量為6%時(shí)，冰酒的酒精度、總酸、感官評(píng)分均達(dá)到最大值；但當(dāng)接種量＞6%之后，由于接種量過(guò)大會(huì)造成發(fā)酵前期細(xì)胞大量消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)很快缺乏，導(dǎo)致酵母細(xì)胞快速老化，從而代謝酒精減少，影響了冰酒果香味，使得感官評(píng)分下降。綜上，選擇最佳酵母接種量為6%。

圖4 不同酵母接種量對(duì)冰葡萄酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different yeast inoculum on ice wine quality

2.1.3 不同發(fā)酵溫度對(duì)冰酒性能及品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對(duì)冰酒的釀造十分重要，溫度過(guò)低時(shí)，酵母菌生長(zhǎng)與繁殖速度很慢，無(wú)法利用更多的糖分轉(zhuǎn)化為酒精，造成冰酒酒精度過(guò)低，殘?zhí)呛扛?，口味甜膩的現(xiàn)象；溫度過(guò)高又會(huì)使雜菌生長(zhǎng)旺盛，酒體氧化褐變，發(fā)生酸敗現(xiàn)象[24]。由圖5可知，發(fā)酵溫度為10 ℃時(shí)，酵母的代謝速率很慢，發(fā)酵前4 d的降糖速率僅為18.5 g/L，而發(fā)酵溫度為20 ℃時(shí)，發(fā)酵前4 d的降糖速率為52.5 g/L。

圖5 在不同發(fā)酵溫度下冰葡萄酒殘?zhí)呛康淖兓疐ig.5 Changes of residual sugar contents of ice wine with different fermentation temperature

由圖6可知，在發(fā)酵溫度為10～16 ℃時(shí)，北冰紅冰葡萄酒的酒精度、總酸、感官評(píng)分呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到16 ℃時(shí)，冰酒的感官評(píng)分最高，為89分，當(dāng)發(fā)酵溫度＞16 ℃之后，感官評(píng)分呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)檫^(guò)高的溫度，酵母生長(zhǎng)繁殖過(guò)快，細(xì)胞更容易衰老，揮發(fā)酸增加，產(chǎn)酒精能力降低，對(duì)冰酒的口味、香氣的形成都有不良影響[24]。綜上，選擇最佳發(fā)酵溫度為16 ℃。

圖6 不同發(fā)酵溫度對(duì)冰葡萄酒品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of different fermentation temperature on ice wine quality

2.1.4 不同初始pH對(duì)冰酒性能及品質(zhì)的影響

在釀造冰酒的過(guò)程中，適當(dāng)?shù)乃岫葧?huì)增加葡萄酒的陳釀時(shí)間，而且冰葡萄酒的顏色也受酸度的影響，所以在冰酒開始發(fā)酵前控制好初始酸度十分重要[26-27]。由圖7可知，在初始pH值為2.9時(shí)，降糖最慢，為11.5 g/L，是因?yàn)榻湍妇诟咚岬沫h(huán)境下，生長(zhǎng)緩慢；在初始pH值為3.7時(shí)，降糖速率最快，為35 g/L，是初始pH值為2.9時(shí)降糖速率的3.04倍。

圖7 在不同初始pH下冰葡萄酒殘?zhí)呛康淖兓疐ig.7 Changes of residual sugar contents of ice wine with different initial pH

由圖8可知，隨著冰葡萄汁初始pH值在2.9～4.5范圍內(nèi)的升高，冰酒的酒精度和感官分值呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH值在2.9～3.7時(shí)，由于冰葡萄汁過(guò)酸，不利于酵母的生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致冰酒酒精度偏小，口感發(fā)酸，感官評(píng)分不高；在初始pH值為3.7時(shí)，酒體的酒精度達(dá)到最高，為12.6%vol，感官評(píng)分也達(dá)到了峰值，為87分，總酸為9.2 g/L，此時(shí)冰酒口味柔和，果香濃郁。當(dāng)初始pH值＞3.7之后，冰酒的酒精度和感官評(píng)分開始下降。綜上，選擇最佳初始pH值為3.7。

圖8 不同初始pH對(duì)冰葡萄酒品質(zhì)的影響Fig.8 Effect of different initial pH on ice wine quality

2.2 北冰紅冰葡萄酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始糖度（C）和初始pH值（D）為影響因素，以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3因素正交試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation process optimization

由表3可知，影響冰酒感官評(píng)分的主次因素順序?yàn)锽＞A＞D＞C，即發(fā)酵溫度＞接種量＞初始pH值＞初始糖度。最佳發(fā)酵工藝組合為A1B2C2D2，即接種量為4%，發(fā)酵溫度為16 ℃，初始糖度360 g/L，初始pH值為3.7。由表4可知，發(fā)酵溫度對(duì)冰酒的感官評(píng)分影響最大，且影響顯著（P＜0.05）。在最優(yōu)發(fā)酵工藝組合A1B2C2D2條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，感官評(píng)分為88.3分，酒精度為11.6%vol，得到的北冰紅冰葡萄酒酒體紅潤(rùn)，果香濃郁。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test results

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)對(duì)釀造條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化得到最佳的發(fā)酵工藝條件為：酵母接種量4%，發(fā)酵溫度16 ℃，初始含糖量360 g/L，初始pH值3.7。在此優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下，北冰紅冰葡萄酒的感官評(píng)分為88.3分，酒精度達(dá)到11.6%vol，經(jīng)上述釀造工藝釀造的北冰紅冰葡萄酒澄清透明，果香濃郁，口感酸甜協(xié)調(diào)，具有冰葡萄酒的典型特征。