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        血清miR-21、miR-150的表達(dá)與心房顫動患者NT-proBNP水平的關(guān)系及治療前后變化分析*

        2022-02-06 11:48:56范燕賓李雪博程帥孫運(yùn)趙育潔陳豐毅
        廣東醫(yī)學(xué) 2022年12期
        關(guān)鍵詞:血清水平

        范燕賓, 李雪博, 程帥, 孫運(yùn), 趙育潔, 陳豐毅

        鄭州市心血管病醫(yī)院(鄭州市第七人民醫(yī)院)心血管內(nèi)科(河南鄭州 450000)

        心房顫動(房顫)屬于臨床常見的心率紊亂疾病,近年來發(fā)病率呈現(xiàn)升高趨勢,患者以快速、無序心房電活動為主要特征,病死率較高,對患者生存質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。射頻消融術(shù)是目前臨床治療房顫的主要方法,通過點(diǎn)對點(diǎn)模式加熱組織造成細(xì)胞壞死,但是患者術(shù)后可能發(fā)生相關(guān)并發(fā)癥,同時也會出現(xiàn)復(fù)發(fā)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)房顫的發(fā)生同非正常調(diào)控離子通道蛋白引發(fā)電重構(gòu)相關(guān)[2]。微小RNA屬于內(nèi)源性非編碼小分子RNA,主要通過與相對性mRNA部分堿基發(fā)生配對阻止翻譯,繼而對基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-150在心室重塑過程中具有調(diào)控作用,可以對心肌纖維化、細(xì)胞肥大、細(xì)胞凋亡中的信號通路進(jìn)行靶向調(diào)控,但是目前臨床對于射頻消融術(shù)治療后患者血清微小RNA變化報道臨床較為少見。本研究分析射頻消融術(shù)治療房顫患者體內(nèi)血清微小RNA(miR-21、miR-150)變化情況,目的是了解微小RNA在房顫發(fā)生維持的分子機(jī)制。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 選取2019年4月至2021年2月我院心內(nèi)科確診的103例房顫患者設(shè)為房顫組,選取同期來我院體檢的健康人士作為對照組。研究經(jīng)我院倫理委員會審批通過(2019-03-01),受試者及家屬知情同意。兩組基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

        表1 兩組的基線資料比較

        房顫患者入選標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《心房顫動:目前的認(rèn)識和治療建議(2021)》[3]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)24 h動態(tài)心電圖結(jié)果確診,P波消失,代之以小而不規(guī)則的基線波動,形態(tài)與振幅均變化不定,頻率約350~600次/min。心室率不規(guī)則。當(dāng)心室率過快, QRS 波增寬變形。且記錄到的房顫心電圖持續(xù)時間≥30 s。(2)均在我院接受了射頻消融術(shù)治療,且手術(shù)成功。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)急性心肌梗死病史;(2)血液系統(tǒng)疾??;(3)精神疾病或癡呆患者;(4)癌癥患者;(5)甲狀腺功能異常;(6)近2周內(nèi)使用影響本研究結(jié)果相關(guān)藥物(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β受體阻滯劑等)。

        1.2 實(shí)時熒光PCR技術(shù) 抽取兩組受試者全血標(biāo)本,3 000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移至離心管后12 000 r/min離心10 min,獲取200 μL血漿,采用美國MRC Gene公司提供的試劑盒獲取總RNA,準(zhǔn)備溶解好血清血漿樣本,加入5倍體積的QIAzol Lysis Reagent吸打混勻,將裝有裂解液的管子在室溫靜置5 min,加入3.5 μL mi RNeasy Serum/Plasma Spike-In Control 充分混勻,加入與起始樣本等量的氯仿,振蕩15 s,4℃下12 000 r/min離心15 min,將水相轉(zhuǎn)入一個新的收集管加入1.5倍體積無水乙醇,反復(fù)吸打幾次充分混勻,吸取700 μL樣本,加在收集管,室溫下12 000 r/min離心15 s加入700 μL Buffer RWT室溫下12 000 r/min離心15 s,加入14 μL RNase-freewater在膜中心,1 min下全速離心洗提RNA,將提取出的RNA在微量核酸測定儀 Nano Drop 2000 上測定其濃度和純度,挑選260/280比值在1.8~2.0的樣品。取含100 ng總RNA按iScript TM cDNASynthesis Kit 操作說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA。按TaqMan MicroRNA Assays 說明檢測成熟miRNA,以江蘇斯卡來特然生物技術(shù)制造廠提供的miR-21mimic、miR-150mimic和陰性對照為模板,miR-21mimic、miR-150mimic熒光探針作引物擴(kuò)增,加入10 μL SYBR Green Enzyme、0.8 μL miR/U6 speaific primer set、2 μL cDNA,再加入ddH2O直至20 μL,在ABI StepOneTMReal-Time PCR System中進(jìn)行反應(yīng)(預(yù)變形1個循環(huán),溫度95℃,時間3 min;PCR反應(yīng)40個循環(huán),溫度95℃,時間12 s)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,相對定量用2-ΔΔCt法來分析real-time PCR的結(jié)果。

        1.3 NT-proBNP水平的檢測 抽取兩組受試者空腹靜脈血3 mL,2 000 r/min離心30 min,采用萊恩德公司提供的LD-96A酶聯(lián)免疫測試儀測定血漿NT-proBNP濃度變化,方法為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),ELISA試劑盒由南京建成生物制品有限公司提供,試劑盒名稱為N末端腦鈉肽前體/N末端前腦鈉肽試劑盒。

        1.4 射頻消融治療 患者麻醉滿意后穿刺股靜脈,置入10極和4極標(biāo)測導(dǎo)管到冠狀靜脈竇與右心室心尖,穿刺房間隔后顯示肺靜脈形態(tài)與走形,定位肺靜脈口,按照患者電生理檢查結(jié)果采取環(huán)肺靜脈電隔離或環(huán)肺靜脈電隔離聯(lián)合多線性消融方法,消融過程中最高溫度不得超過50℃,最大射頻能力不超過50 W,單點(diǎn)消融時間低于60 s,局部電壓低于0.1 mV可以終止消融治療。消融成功標(biāo)準(zhǔn)為竇性心律或者冠狀靜脈竇起搏可記錄到傳導(dǎo)阻滯?;颊咝g(shù)前服用華法林(1片/d,根據(jù)INR值調(diào)整劑量,國藥準(zhǔn)字H31022123,上海上藥信誼藥廠有限公司)抗凝治療3個月,維持國際標(biāo)準(zhǔn)化率在2.0~3.0,術(shù)前3 d改為低分子肝素[1支/次,2次/d,國藥準(zhǔn)字J20180036,賽諾菲(北京)制藥有限公司]皮下注射,術(shù)中采取普通肝素(100 IU/kg,術(shù)中維持ACT在250~350,國藥準(zhǔn)字H51021209,成都市海通藥業(yè)有限公司)靜脈維持,消融治療后給予鹽酸貝那普利片(國藥準(zhǔn)字H20030514,北京諾華制藥有限公司),1片/d;琥珀酸美托洛爾緩釋片(國藥準(zhǔn)字H32025391,阿斯利康制藥有限公司),1片/d;螺內(nèi)酯片(國藥準(zhǔn)字H31021273,上海醫(yī)藥信誼制藥總廠),1片/d。長期服用。定期復(fù)查血常規(guī)、肝腎功能電解質(zhì)、凝血、心電圖及心臟彩超;根據(jù)患者復(fù)查結(jié)果調(diào)整患者術(shù)后用藥情況。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組血清miR指標(biāo)、NT-proBNP水平比較 房顫組患者miR-21、NT-proBNP水平均高于對照組,miR-150水平均低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

        表2 兩組血清miR指標(biāo)、NT-proBNP水平比較

        2.2 不同類型房顫患者血清miR指標(biāo)、NT-proBNP水平比較 103例房顫患者中,確診為陣發(fā)性房顫組患者80例、持續(xù)性房顫患者23例,持續(xù)性房顫患者的miR-21、NT-proBNP水平均高于陣發(fā)性房顫患者,miR-150水平均低于陣發(fā)性房顫患者。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

        表3 不同類型房顫患者血清miR指標(biāo)、NT-proBNP水平比較

        2.3 血清miR指標(biāo)與NT-proBNP水平相關(guān)性 房顫患者miR-21與NT-proBNP呈正相關(guān)性(r=0.604,P<0.001)。miR-150與NT-proBNP呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.627,P<0.001)。

        2.4 射頻消融前后患者血清miR指標(biāo)、NT-proBNP水平比較 103例房顫患者均接受射頻消融術(shù)治療。治療后3個月患者的miR-21、NT-proBNP水平顯著低于治療前,miR-150水平顯著高于治療前。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

        表4 射頻消融前后患者血清miR指標(biāo)、NT-proBNP水平比較

        2.5 治療后12個月內(nèi)復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者miR指標(biāo)比較 隨訪12個月,復(fù)發(fā)20例,復(fù)發(fā)患者治療前的miR-21高于未復(fù)發(fā)患者,miR-150低于未復(fù)發(fā)患者(P<0.05)。見表5。

        表5 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者miR指標(biāo)比較

        2.6 血清miR指標(biāo)預(yù)測患者射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的價值 miR-21預(yù)測房顫射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC值為0.737(95%CI:0.625~0.850);miR-150預(yù)測房顫射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC值為0.696(95%CI:0.550~0.842)。

        3 討論

        房顫是臨床常見的心律失常類型,國人中80歲以上的老年人群房顫發(fā)生率高達(dá)10%,隨著病情進(jìn)展在左心耳形成血栓,一旦栓子發(fā)生脫落會導(dǎo)致體循環(huán)栓塞,因此致殘率和病死率較高,對患者生命安全產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[4]。目前認(rèn)為房顫發(fā)生是多因素造成,一方面心房內(nèi)存在折返是房顫發(fā)生和維持的必要條件,主要同心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)有關(guān),心房肌細(xì)胞跨膜離子流的改變是電重構(gòu)的病理基礎(chǔ),隨著房顫持續(xù)時間的延長,心房心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生改變,導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)[5]。近年來臨床分析與房顫相關(guān)的微小RNA研究較多,微小RNA屬于內(nèi)源性非編碼的小分子RNA,通過和mRNA部分堿基發(fā)生配對引發(fā)降解或者組織其翻譯過程,進(jìn)而對基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[6]。有報道指出微小RNA在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中參與重要病理生理進(jìn)程與疾病密切相關(guān),尤其是可以參與房顫鉀離子通道的重構(gòu)改變[7]。

        本研究在房顫患者中miR-21表達(dá)升高。有研究發(fā)現(xiàn)miR-21與心肌細(xì)胞肥厚、血管平滑肌增殖相關(guān),有學(xué)者分析了心肌缺血再灌注患者中發(fā)現(xiàn)miR-21靶基因?yàn)槿说?0號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN),miR-21可以在心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)通過轉(zhuǎn)錄后對PTEN水平下調(diào),通過介導(dǎo)體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá)上調(diào)參與到心肌梗死患者梗死區(qū)域膠原代謝和心室重構(gòu)過程[8]。還有研究發(fā)現(xiàn)在房顫患者心房組織中miR-21表達(dá)異常及對相應(yīng)的介導(dǎo)離子通道蛋白及心肌膠原代謝蛋白的調(diào)控分別參與電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)過程,促成常心房組織向房顫發(fā)生及維持的易感基質(zhì)轉(zhuǎn)變,是房顫患者發(fā)生電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要機(jī)制之一[9]。

        本研究還發(fā)現(xiàn)miR-150表達(dá)降低,miR-150在人體19號染色體定位,一般在淋巴結(jié)和脾臟等免疫系統(tǒng)中表達(dá)升高,研究發(fā)現(xiàn)miR-150低表達(dá)同炎癥反應(yīng)和心肌纖維與電重構(gòu)之間相關(guān),miR-150參與了人體組織纖維化過程,可以對膠原分泌產(chǎn)生影響,而纖維化發(fā)生會造成心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu),引發(fā)房顫發(fā)生[10]。我們對房顫患者分型發(fā)現(xiàn),持續(xù)性房顫患者的miR-21、NT-proBNP值高于陣發(fā)性房顫患者,而miR-150值低于陣發(fā)性房顫患者。我們認(rèn)為陣發(fā)性房顫患者病情相對輕,炎癥恢復(fù)較快,心肌纖維化導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)方面能在某種程度上得到緩解,導(dǎo)致miR-21、miR-150、變化不一致,持續(xù)性房顫由于結(jié)構(gòu)重構(gòu)情況較重,且纖維化程度嚴(yán)重,因此表現(xiàn)出miR-21表達(dá)更高,miR-150表達(dá)下降程度更大[11]。

        NT-proBNP是世界公認(rèn)的心肌損傷標(biāo)志物,能夠有效反映患者心功能。相關(guān)性分析可知miR-21、miR-150同患者NT-proBNP水平具有一定的關(guān)聯(lián)性。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-150參與房顫期間心肌組織的電重構(gòu)、離子重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)調(diào)控,主要針對細(xì)胞內(nèi)鈣超載、心房中局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活以及心房肌組織纖維化、通道和受體蛋白質(zhì)變化,因此可以通過多途徑參與上述因素的調(diào)節(jié),最后表現(xiàn)為促房顫或抗房顫、促凋亡或抗凋亡等,同本研究結(jié)果基本一致[12]。

        本研究采用射頻消融治療房顫患者,通過電隔離肺靜脈,使肺靜脈與心房組織產(chǎn)生隔離環(huán),肺靜脈內(nèi)的放電無法到達(dá)心房組織,從而不會引起心房組織放電[13-16]。本研究還發(fā)現(xiàn)射頻治療后miR-21表達(dá)降低,miR-150表達(dá)升高,說明微小RNA變化情況也可以對患者射頻治療后NT-proBNP水平變化進(jìn)行評價,進(jìn)而可以反映患者心功能變化情況。而且繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn),miR-21、miR-150預(yù)測房顫射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)均有一定的診斷價值。有研究發(fā)現(xiàn),射頻消融房顫前后外周血中miR-150的表達(dá)水平存在顯著差異,術(shù)后明顯增加,術(shù)前明顯減少,可能是miR-150的調(diào)節(jié)導(dǎo)致術(shù)前房顫易感性增加,心房纖維化增加,術(shù)后心房重構(gòu)發(fā)生逆轉(zhuǎn),與本研究結(jié)果基本一致[17-18]。

        綜上所述,miR-21高表達(dá)、miR-150低表達(dá)與房顫患者NT-proBNP水平升高有關(guān),射頻消融術(shù)治療后患者的miR-21降低、miR-150升高,并且與房顫患者治療后復(fù)發(fā)有關(guān)。

        利益相關(guān)聲明:本文所有作者共同認(rèn)可論文無相關(guān)利益沖突。

        作者貢獻(xiàn)說明:范燕賓進(jìn)行了論文起草,李雪博、程帥、孫運(yùn)、趙育潔進(jìn)行了論文修改與指導(dǎo),范燕賓進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析,范燕賓和陳豐毅進(jìn)行了數(shù)據(jù)提取、刪失及標(biāo)化處理,范燕賓進(jìn)行了文獻(xiàn)查閱。

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