羅祥英 ，李夢(mèng)杰 ，曹 瑤 ，楊林雷 ，沈真輝 ，李 健 ，李文芝 ，陸青青 ，楊曉君 ，李榮春 **

（1.云南菌視界生物科技有限公司，云南 昆明 651708；2.昆明市[食用菌]企業(yè)工程技術(shù)中心，云南 昆明 651708）

羊肚菌（Morchella spp.）隸屬于子囊菌門(mén)（Ascomycota）盤(pán)菌綱（Discomycetes）盤(pán)菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌屬（Morchella）[1]。目前，羊肚菌屬共有78個(gè)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)物種，分別由黃色羊肚菌支系、黑色羊肚菌支系和變紅羊肚菌支系3個(gè)類(lèi)群構(gòu)成；其中，黑色羊肚菌支系中的9個(gè)物種以及1個(gè)變紅羊肚菌物種已實(shí)現(xiàn)了人工栽培[2-3]。

1982年Ower[4]在人工控制條件下成功栽培出羊肚菌，這是羊肚菌人工栽培歷史上的一項(xiàng)重大成果，對(duì)羊肚菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。此后，國(guó)內(nèi)許多學(xué)者也紛紛展開(kāi)了羊肚菌的研究，自此羊肚菌栽培研究進(jìn)入了快速發(fā)展期。2005年美國(guó)DNP（Diversified Natural Products）公司進(jìn)行羊肚菌商業(yè)化室內(nèi)栽培，但于2008年停產(chǎn)[5]。2000年～2003年，四川省林業(yè)科學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)將外源營(yíng)養(yǎng)袋添加技術(shù)應(yīng)用到羊肚菌的大田栽培，并取得成功，有效推動(dòng)了我國(guó)羊肚菌商業(yè)化栽培的發(fā)展[6]。2012年開(kāi)始，我國(guó)步入羊肚菌大田商業(yè)化栽培時(shí)代，到2020年，栽培面積從200 hm2增至1.4萬(wàn)公頃～1.5萬(wàn)公頃，我國(guó)成為了羊肚菌生產(chǎn)和出口第一大國(guó)[7-8]。隨著營(yíng)養(yǎng)袋應(yīng)用技術(shù)越來(lái)越成熟，羊肚菌大田栽培技術(shù)越來(lái)越完善，羊肚菌的產(chǎn)量和穩(wěn)定性較之前大幅度提高。

然而，在目前的規(guī)?；耘噙^(guò)程中仍然存在很多問(wèn)題，如大面積絕收、低產(chǎn)、產(chǎn)量不穩(wěn)定等。造成這些問(wèn)題的原因主要是基礎(chǔ)科學(xué)研究滯后，栽培品種、栽培技術(shù)單一，對(duì)羊肚菌的營(yíng)養(yǎng)特性、生活史、生態(tài)適應(yīng)性方面沒(méi)有完全掌握，對(duì)外源營(yíng)養(yǎng)袋的作用機(jī)理不清楚等[5，9-10]。因此，目前除了不斷加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，選育高產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的品種以外，還應(yīng)通過(guò)探索新的栽培技術(shù)來(lái)推動(dòng)羊肚菌產(chǎn)業(yè)穩(wěn)健、快速發(fā)展。外源營(yíng)養(yǎng)袋的應(yīng)用是羊肚菌栽培技術(shù)中最重要的組成部分，也是羊肚菌大田商業(yè)化栽培成功的關(guān)鍵技術(shù)，但目前對(duì)其作用機(jī)理尚不清楚，栽培技術(shù)難以提升。

盡管已經(jīng)有一些學(xué)者探索了新的栽培技術(shù)，但著重論證技術(shù)的可行性，并沒(méi)有深入研究新技術(shù)對(duì)產(chǎn)量的影響[11-12]。前期通過(guò)15N同位素示蹤技術(shù)，研究了羊肚菌人工栽培過(guò)程中外源氮素營(yíng)養(yǎng)的運(yùn)輸機(jī)制，證明了外源營(yíng)養(yǎng)中的氮素營(yíng)養(yǎng)能夠通過(guò)土壤中的菌絲網(wǎng)絡(luò)，有效運(yùn)輸?shù)窖蚨蔷訉?shí)體中供其生長(zhǎng)發(fā)育；同時(shí)，闡明了營(yíng)養(yǎng)袋的時(shí)（擺放時(shí)間）空（有效距離）有效性問(wèn)題[13]。在此基礎(chǔ)上，此次試驗(yàn)通過(guò)同位素示蹤技術(shù)跟蹤第2次外源營(yíng)養(yǎng)的運(yùn)輸，探明補(bǔ)充第2次外源營(yíng)養(yǎng)對(duì)產(chǎn)量的影響，深入探索羊肚菌補(bǔ)充2次外源營(yíng)養(yǎng)的栽培技術(shù)，為羊肚菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和同位素

梯棱羊肚菌（Morchella importuna）菌株JSJM15，由云南菌視界生物科技有限公司提供。15N-銨態(tài)硝酸銨，購(gòu)自上?；ぱ芯吭?。

1.2 培養(yǎng)基配方

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B110 mg、瓊脂粉18 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH為6.0。

原種培養(yǎng)料：小麥70%、谷殼15%、麥麩5%、土壤8%、輕質(zhì)碳酸鈣1%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸鎂0.5%，含水量為45%。

栽培種培養(yǎng)料：麥粒56%、木屑12%、谷殼14%、土壤15%、蔗糖1%、輕質(zhì)碳酸鈣1%、磷酸二氫鉀1%，含水量為45%。

營(yíng)養(yǎng)袋：麥粒46%、木屑17%、谷殼18%、土壤18%、輕質(zhì)碳酸鈣1%，含水量為45%。

1.3 羊肚菌栽培管理

試驗(yàn)在云南菌視界生物科技有限公司基地進(jìn)行，播種時(shí)間為2020年11月10日，從播種到采收周期為90 d。

原種和栽培種的制作參照參考文獻(xiàn)[14]的方法。

清除土壤上的雜物，用石灰調(diào)土壤pH至6～7[15]。播種前先挖出寬10 cm、深5 cm的播種溝，再進(jìn)行土壤預(yù)濕。將準(zhǔn)備好的栽培種揉碎，以每平方米500 g的播種量，將菌種均勻撒在播種溝內(nèi)，立即覆蓋土壤，覆土厚度為3 cm～5 cm。播種10天后擺放營(yíng)養(yǎng)袋。

菌絲培養(yǎng)階段，保持土壤含水量為25%～30%，空氣濕度為60%～75%；原基誘導(dǎo)階段將土壤含水量增加至30%～40%；幼菇生長(zhǎng)發(fā)育階段將土壤含水量降低至25%～30%，空氣濕度為80%～95%。

1.4 同位素示蹤技術(shù)

氮素營(yíng)養(yǎng)是羊肚菌生長(zhǎng)發(fā)育的主要營(yíng)養(yǎng)元素之一，研究證明，以硝酸銨為氮源時(shí)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)較好[16-18]。因此，試驗(yàn)采用15N-銨態(tài)硝酸銨同位素示蹤技術(shù)，研究外源營(yíng)養(yǎng)的運(yùn)輸。羊肚菌栽培管理方法同1.3所述。試驗(yàn)中外源營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充及15N同位素標(biāo)記情況詳見(jiàn)圖1。

圖1 外源營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充及15N同位素標(biāo)記示意圖Fig.1 Schematic diagram of the supplement exogenous nutrition and15N isotope labeling

如圖1所示，以只補(bǔ)充1次外源營(yíng)養(yǎng)作為對(duì)照組（編號(hào)：EGCK），在播種后第10天開(kāi)始補(bǔ)充1次外源營(yíng)養(yǎng)，在外源營(yíng)養(yǎng)中添加0.2 g·mL-1的15N-銨態(tài)硝酸銨溶液500 μL，并做好標(biāo)記；以添加等量無(wú)菌水為對(duì)照組的空白對(duì)照（編號(hào)：CK1）。試驗(yàn)組處理為：在播種后第10天開(kāi)始補(bǔ)充第1次外源營(yíng)養(yǎng)，第1次外源營(yíng)養(yǎng)袋內(nèi)不添加15N-銨態(tài)硝酸銨溶液，營(yíng)養(yǎng)袋擺放30 d后撤去第1次外源營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)分別在撤去第1次外源營(yíng)養(yǎng)的當(dāng)天（即播種后第40天，圖1中時(shí)間記為0，編號(hào)EG1）、第10天（即播種后第50天，編號(hào)EG2）、第20天（即播種后第60天，編號(hào)EG3）補(bǔ)充新的外源營(yíng)養(yǎng)（第2次外源營(yíng)養(yǎng)），分別在第2次外源營(yíng)養(yǎng)中添加0.2 g·mL-1的15N-銨態(tài)硝酸銨溶液500 μL，并做好標(biāo)記；以添加等量無(wú)菌水為試驗(yàn)組的空白對(duì)照（編號(hào)：CK2）。每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

待羊肚菌菌蓋表面蜂窩狀凹陷充分伸展時(shí)即可開(kāi)始采收，分別取距離營(yíng)養(yǎng)袋邊緣0～10 cm的新鮮子實(shí)體為樣品，每個(gè)樣品1.5 g（含菌蓋和菌柄各0.75 g），重復(fù)取樣10次。將樣品混合、烘干、粉碎后送上?；ぱ芯吭簷z測(cè)15N豐度，具體方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《穩(wěn)定性同位素15N無(wú)機(jī)標(biāo)記化合物》（GB/T 20622-2006）[19]。

1.5 補(bǔ)充2次外源營(yíng)養(yǎng)對(duì)羊肚菌產(chǎn)量的影響

對(duì)照組（編號(hào)：EGCK）：在播種后第10天開(kāi)始補(bǔ)充1次外源營(yíng)養(yǎng)，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)袋濕質(zhì)量為430 g，每平方米補(bǔ)充6袋，擺放至第30天時(shí)撤去外源營(yíng)養(yǎng)。試驗(yàn)組：播種后第10天開(kāi)始補(bǔ)充第1次外源營(yíng)養(yǎng)，擺放至第30天撤去第1次外源營(yíng)養(yǎng)；同時(shí)分別在撤去第1次外源營(yíng)養(yǎng)的當(dāng)天（即播種后第40天，編號(hào)EG1）、第10天（即播種后第50天，編號(hào)EG2）、第20天（即播種后第60天，編號(hào)EG3）補(bǔ)充新的外源營(yíng)養(yǎng)。第2次外源營(yíng)養(yǎng)采用350 mL廣口瓶為容器，營(yíng)養(yǎng)料濕質(zhì)量為200 g/瓶，每平方米補(bǔ)充6瓶。每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。羊肚菌栽培管理方法同1.3所述。以各個(gè)處理的原基發(fā)生時(shí)間、原基數(shù)量、幼菇成活率（2 cm以上幼菇生長(zhǎng)發(fā)育為成熟菇的比例）、產(chǎn)量等為指標(biāo)進(jìn)行觀測(cè)和統(tǒng)計(jì)，綜合評(píng)價(jià)羊肚菌補(bǔ)充2次外源營(yíng)養(yǎng)的栽培技術(shù)。

測(cè)量統(tǒng)計(jì)方法：播種后每天觀察羊肚菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，以第1次發(fā)現(xiàn)原基為其原基發(fā)生時(shí)間；在原基發(fā)生后第5天統(tǒng)計(jì)原基數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源營(yíng)養(yǎng)的物質(zhì)運(yùn)輸

待羊肚菌子實(shí)體成熟后，分別取距離營(yíng)養(yǎng)袋邊緣0～10 cm的子實(shí)體為樣品，測(cè)定其15N豐度。不同處理下子實(shí)體中15N的豐度值詳見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理下成熟子實(shí)體中15N的豐度Fig.2 The15N abundance in mature fruit bodies under different treatments

如圖2所示，對(duì)照組EGCK（0.815%）羊肚菌成熟子實(shí)體中15N的豐度值顯著高于空白對(duì)照CKI（0.369%）。試驗(yàn)組EG1、EG2、EG3成熟子實(shí)體中15N的豐度值依次為1.330%、0.865%、0.386%，均高于空白對(duì)照CK2（0.373%）；其中，EG1子實(shí)體中15N的豐度極顯著高于空白對(duì)照CK2，EG2子實(shí)體中15N的豐度顯著高于空白對(duì)照CK2。結(jié)果表明，2次補(bǔ)充的外源營(yíng)養(yǎng)中的氮素營(yíng)養(yǎng)均通過(guò)土壤中的菌絲網(wǎng)絡(luò)吸收、運(yùn)輸?shù)窖蚨蔷訉?shí)體中；在本試驗(yàn)條件下，在撤去第1次外源營(yíng)養(yǎng)后10天內(nèi)（此時(shí)處于菌絲階段和原基階段）補(bǔ)充第2次外源營(yíng)養(yǎng)較佳。

2.2 補(bǔ)充第2次外源營(yíng)養(yǎng)對(duì)羊肚菌產(chǎn)量的影響

分別在第1次營(yíng)養(yǎng)袋撤離后的當(dāng)天（EG1，菌絲階段）、第10天（EG2，原基階段）以及第20天（EG3，幼菇階段）補(bǔ)充第2次外源營(yíng)養(yǎng)。不同處理原基發(fā)生時(shí)間、數(shù)量、幼菇成活率及產(chǎn)量情況詳見(jiàn)表1、圖3和圖4。

表1 不同處理中梯棱羊肚菌的生長(zhǎng)情況Tab.1 The growth of Morchella importuna in different treatments

如表1、圖3和圖4所示，不同處理下原基發(fā)生時(shí)間均為40 d～50 d，與對(duì)照組EGCK相比差異不顯著；原基數(shù)量與對(duì)照組EGCK之間差異不顯著。試驗(yàn)組EG1、EG2、EG3幼菇成活率依次為33.33%、21.11%、18.89%，均高于對(duì)照組EGCK（17.78%）；平均產(chǎn)量依次為 835 g·m-2、530 g·m-2、474 g·m-2，均高于對(duì)照組EGCK（446 g·m-2）。其中處理EG1的平均產(chǎn)量極顯著高于對(duì)照EGCK；處理EG2的平均產(chǎn)量顯著高于對(duì)照EGCK；處理EG3的產(chǎn)量與對(duì)照差異不顯著。在出菇階段，處理EG1及EG2羊肚菌成熟子實(shí)體的密度顯著大于對(duì)照組EGCK。

圖3 不同處理下梯棱羊肚菌的平均產(chǎn)量Fig.3 Average yield of Morchella importuna under different treatments

圖4 不同處理下梯棱羊肚菌的出菇情況圖Fig.4 The figure of Morchella importuna.fruiting under different treatments

綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，梯棱羊肚菌播種后第40天～第50天（此時(shí)處于菌絲階段和原基發(fā)生階段）補(bǔ)充第2次外源營(yíng)養(yǎng)效果最佳，其外源營(yíng)養(yǎng)中的氮素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠有效運(yùn)輸?shù)阶訉?shí)體中，并顯著提高產(chǎn)量。

3 結(jié)論與討論

羊肚菌是目前人工栽培食用菌中較特殊的一類(lèi)大型真菌，也是為數(shù)不多的成功實(shí)現(xiàn)商業(yè)化栽培的子囊菌之一。羊肚菌為兼性（腐生和菌根）真菌，各品種在不同生境下經(jīng)歷著不同的演化過(guò)程，一些種類(lèi)具有確定的菌根型生態(tài)類(lèi)型，而另一些種類(lèi)又具有完整的腐生型生態(tài)類(lèi)型[20-22]。隨著羊肚菌產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，理論基礎(chǔ)研究的進(jìn)一步深入，對(duì)羊肚菌的生活史逐漸明晰。杜習(xí)慧等[23]認(rèn)為羊肚菌有性生殖模式以異宗配合為主，還包括了假同宗配合和同宗配合；劉偉等[24-25]認(rèn)為梯棱羊肚菌有“同宗結(jié)合”現(xiàn)象，又通過(guò)出菇試驗(yàn)和交配型基因分析證明梯棱羊肚菌為異宗結(jié)合真菌；賀新生等[26]指出羊肚菌完全能夠單孢出菇；柴紅梅等[27]推測(cè)梯棱羊肚菌是一種特殊的假同宗子囊菌。

在羊肚菌栽培技術(shù)研究方面，目前大規(guī)模商業(yè)化栽培仍然以依托外源營(yíng)養(yǎng)袋進(jìn)行室外大田、大棚栽培為主，栽培技術(shù)上基本沒(méi)有很大的創(chuàng)新，且實(shí)踐中仍然存在大面積栽培區(qū)域不出菇或產(chǎn)量低的情況，栽培風(fēng)險(xiǎn)高，雖然也探索了一些新的栽培模式，但尚未進(jìn)行大規(guī)模商業(yè)化栽培推廣及驗(yàn)證[2，6，11-12]。

不斷完善羊肚菌外源營(yíng)養(yǎng)栽培技術(shù)，解析外源營(yíng)養(yǎng)的作用機(jī)制可有效保證羊肚菌實(shí)現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)。但目前對(duì)羊肚菌外源營(yíng)養(yǎng)的作用機(jī)制研究較少。唐昊等[28]對(duì)梯棱羊肚菌分解利用外源營(yíng)養(yǎng)袋的過(guò)程進(jìn)行多組學(xué)結(jié)合生理生化分析，認(rèn)為營(yíng)養(yǎng)袋的主要作用是向土壤中的羊肚菌菌絲提供碳源，卻幾乎不向土壤產(chǎn)生氮的凈輸出。試驗(yàn)前期通過(guò)15N同位素示蹤技術(shù)研究了羊肚菌人工栽培過(guò)程中外源氮素營(yíng)養(yǎng)的運(yùn)輸機(jī)制，證明了外源氮素營(yíng)養(yǎng)能夠有效運(yùn)輸?shù)阶訉?shí)體中供其生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)，闡明了營(yíng)養(yǎng)袋的時(shí)（擺放時(shí)間）空（有效距離）有效性問(wèn)題。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了梯棱羊肚菌補(bǔ)充2次外源營(yíng)養(yǎng)的栽培技術(shù)。結(jié)果表明，第1次及第2次補(bǔ)充的外源營(yíng)養(yǎng)中的氮素營(yíng)養(yǎng)都能夠被土壤中的菌絲網(wǎng)絡(luò)吸收，并運(yùn)輸?shù)窖蚨蔷訉?shí)體中；試驗(yàn)條件下，在梯棱羊肚菌播種后的第40天～第50天（此時(shí)處于菌絲階段和原基發(fā)生階段）補(bǔ)充第2次外源營(yíng)養(yǎng)，其外源氮素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠有效運(yùn)輸?shù)窖蚨蔷訉?shí)體中，并顯著提高產(chǎn)量。這一結(jié)論將為羊肚菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供更多的參考，為羊肚菌栽培技術(shù)創(chuàng)新、有效實(shí)現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)方面提供一定的理論依據(jù)。

羊肚菌栽培技術(shù)的研究，特別是在外源營(yíng)養(yǎng)的作用機(jī)制、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的因素、羊肚菌與土壤和環(huán)境的適應(yīng)性等方面的研究還比較薄弱，在今后的研究中需進(jìn)一步加強(qiáng)。試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)羊肚菌在完成采收后，土壤自然恢復(fù)1個(gè)星期，再重新補(bǔ)充外源營(yíng)養(yǎng)能夠促進(jìn)土壤中的菌絲再次萌發(fā)和聚集，在環(huán)境條件適宜時(shí)能夠形成原基并分化成幼菇。這些現(xiàn)象同樣表明在環(huán)境適宜時(shí)連續(xù)補(bǔ)充外源營(yíng)養(yǎng)能夠連續(xù)收獲子實(shí)體，但補(bǔ)充外源營(yíng)養(yǎng)的次數(shù)、時(shí)間、數(shù)量、方式等還有待進(jìn)一步深入研究。