黃銹賢，黃 瓊，謝偉東，葉日輝，李在留

(廣西大學(xué)林學(xué)院，南寧，530000)

薄殼山核桃Caryaillinoensis屬胡桃科山核桃屬，具有食用、藥用、觀賞等多種用途。其在我國(guó)引種歷史雖已有100多年，但引種并栽培的優(yōu)良品種不多?！癝haoxing”和“Pawnee”品種于1974年引入云南種植，2012年引入廣西，作為巖溶石山區(qū)生態(tài)治理與經(jīng)濟(jì)林樹種廣泛引種種植[1]，目前已進(jìn)入開花結(jié)實(shí)期，但卻存在花而不實(shí)、落花落果、結(jié)實(shí)率低等問(wèn)題，嚴(yán)重制約著廣西核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)薄殼山核桃已經(jīng)開展了大量的研究，主要集中在果實(shí)性狀、生理生化和栽培引種等方面。在果實(shí)性狀方面，許夢(mèng)洋等對(duì)6個(gè)薄殼山核桃品種的果實(shí)發(fā)育過(guò)程及果實(shí)結(jié)構(gòu)和性狀變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)“Pawnee”和“Mahan”可作為南京地區(qū)主栽品種的優(yōu)選對(duì)象[2]。呂運(yùn)舟等研究發(fā)現(xiàn)，5 個(gè)薄殼山核桃品種中“碧根源 3 號(hào)”“波尼”和“馬罕”這3個(gè)品種比較適合在江蘇標(biāo)準(zhǔn)化果園種植[3]。在傳粉生物學(xué)方面，有學(xué)者對(duì)“新新2號(hào)”[4]、“溫185”[5]、“Mahan”和“Western”[6]等進(jìn)行了開花、傳粉過(guò)程研究，表明傳媒媒介、授粉方式、花粉來(lái)源等傳粉生物學(xué)環(huán)節(jié)對(duì)薄殼山核桃的果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)有著重要的影響。廣西環(huán)江縣巖溶山區(qū)引種薄殼山核桃“Shaoxing”存在花而不實(shí)、落花落果、結(jié)實(shí)率低等問(wèn)題。目前薄殼山核桃“Shaoxing”主要在生理生化、病蟲害防治、果實(shí)形狀及品質(zhì)等方面有過(guò)報(bào)道[7-9]，其傳粉、授粉對(duì)結(jié)實(shí)的影響研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以廣西環(huán)江縣思恩鎮(zhèn)核桃示范園中“Shaoxing”品種為研究對(duì)象，進(jìn)行不同傳粉媒介、不同授粉處理下花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)對(duì)著果率和結(jié)實(shí)率的影響研究，以期為廣西薄殼山核桃產(chǎn)量低的原因及生物學(xué)特性研究與實(shí)踐提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為薄殼山核桃品種“Shaoxing”，試驗(yàn)地位于廣西壯族自治區(qū)河池市環(huán)江縣思恩鎮(zhèn)核桃示范片高產(chǎn)栽培示范點(diǎn)(108°56′E，24°51′N)。試驗(yàn)時(shí)間為2019年3月中下旬至10月上旬，在試驗(yàn)地的東南坡(上坡、中坡、下坡各設(shè)置一個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)3株)選取9株生長(zhǎng)良好、管理水平一致、無(wú)病蟲害的植株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 傳粉媒介試驗(yàn)方法 風(fēng)媒傳粉試驗(yàn)：于“Shaoxing”雄花盛花期，在試驗(yàn)樣地中所選樣株樹冠外圍中部的東、南、西、北4個(gè)方位放置涂抹有凡士林的載玻片，下午18：00取下載玻片進(jìn)行顯微觀察，每個(gè)載玻片隨機(jī)挑選5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野花粉粒的數(shù)量，重復(fù)9次后取平均值，代表試驗(yàn)樣地該方位的花粉粒的濃度。同時(shí)在試驗(yàn)期內(nèi)記錄每天整點(diǎn)溫度。

蟲媒傳粉試驗(yàn)：每株樣樹隨機(jī)選取3個(gè)觀察點(diǎn)，連續(xù)3 d每天8：00—18：00對(duì)昆蟲種類、數(shù)量、訪花部位、訪花行為和訪花頻率等進(jìn)行觀察，記錄每天的天氣變化情況，每個(gè)觀測(cè)點(diǎn)不少于20個(gè)雌雄花序。

1.2.2 不同授粉處理方法 在各小區(qū)樣樹上隨機(jī)選擇不同方位生長(zhǎng)一致、無(wú)病蟲害的“Shaoxing”枝條上的雌花進(jìn)行5個(gè)不同的授粉處理。具體方法為：(1)自然授粉組自然狀態(tài)下不做處理；(2)套袋處理組在雌花還未顯蕾時(shí)用硫酸紙進(jìn)行套袋，并摘除套袋內(nèi)的雄花；(3)套網(wǎng)處理組用專業(yè)防蟲網(wǎng)袋進(jìn)行套網(wǎng)，同時(shí)去除網(wǎng)袋內(nèi)的雄花；(4)自花(“Shaoxing”דShaoxing”)與異花(“Shaoxing”דPawnee”)人工授粉處理組以長(zhǎng)勢(shì)良好一致的“Shaoxing”植株為母樹，分別進(jìn)行自花和異花授粉。各處理組雌花授粉數(shù)量不少于350朵，分別進(jìn)行掛牌標(biāo)記，其中一部分用于花粉原位萌發(fā)與花粉管生長(zhǎng)檢測(cè)試驗(yàn)，其余用作觀察統(tǒng)計(jì)“Shaoxing”著果率、結(jié)實(shí)率和落果率。

1.2.3 花粉原位萌發(fā)與花粉管生長(zhǎng)檢測(cè) 在試驗(yàn)樣地于授粉后4、12、24、72、96 h進(jìn)行取樣，每個(gè)授粉處理組每次采集15朵雌花，裝入有FAA固定液的玻璃瓶中固定至少24 h，通過(guò)苯胺藍(lán)溶液染色，熒光顯微鏡觀察、拍照，檢測(cè)花粉在柱頭上的萌發(fā)與花粉管生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率和單朵花花柱的花粉萌發(fā)水平，并統(tǒng)計(jì)花粉管進(jìn)入胚囊的單花量。

計(jì)算公式為：

萌發(fā)率(%)=有花粉萌發(fā)的花柱數(shù)目/觀察數(shù)×100

花粉管進(jìn)入胚囊比(%)=有花粉管進(jìn)入胚囊的雌花數(shù)/觀察數(shù)×100

1.2.4 不同授粉處理著果率與結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì) 不同授粉處理雌花柱頭變黑、干枯時(shí)拆除紙袋或網(wǎng)袋，半個(gè)月、兩個(gè)月后輕輕搖動(dòng)果枝，分別統(tǒng)計(jì)不同階段的著果率，果實(shí)成熟時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率。計(jì)算公式為：著果率(%)=子房膨大的數(shù)目/處理花朵的數(shù)目×100；結(jié)實(shí)率(%)=果實(shí)數(shù)/授粉花數(shù)×100；著果后落果率(%)=(著果率-結(jié)實(shí)率)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳粉媒介試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 風(fēng)媒傳粉試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果看出，“Shaoxing”植株?yáng)|(E)、南(S)、西(W)、北(N)不同方位的花粉日散粉量均隨散粉時(shí)期延長(zhǎng)及氣溫的變化呈先上升后下降的趨勢(shì)。4月26—27日氣溫不高，載玻片上的花粉粒濃度較低，日散粉量較少；4月28—29日天氣晴朗，氣溫升高，花粉粒濃度達(dá)到最高，是散粉高峰期，表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和氣溫的升高，雄花花粉日漸成熟，形成暴發(fā)性散粉期；到了4月30日，平均氣溫下降到22 ℃，花粉粒濃度迅速下降，進(jìn)入散粉末期。另外，在散粉高峰期植株西面的散粉量最高，東面和北面次之，且兩者散粉量相近，南面散粉量最低，表明散粉高峰期受主風(fēng)向的影響較大(見(jiàn)圖1)。綜上所述，風(fēng)媒傳粉是“Shaoxing”的有效傳播媒介之一，且風(fēng)媒傳播效率受散粉時(shí)期、溫度、風(fēng)向和風(fēng)力的影響較大。

圖1 不同方位的日散粉量及溫度變化

2.1.2 蟲媒傳粉觀察結(jié)果 連續(xù)觀察結(jié)果表明，“Shaoxing”盛花期有少量昆蟲訪花，包括黑帶食蚜蠅Episyrphusbalteatusde Geer、中華蜜蜂Apiscerana、黃守瓜Aulacophoraindica和黑胸兼食瓢蟲Micraspissatoi等。訪花期間大多數(shù)昆蟲主要停留在雄花或葉子上，其中中華蜜蜂停留時(shí)間最長(zhǎng)，達(dá)180～420 s。中華蜜蜂的訪花頻率最高，中華蜜蜂有一對(duì)“花粉足”，訪花時(shí)會(huì)將花粉轉(zhuǎn)移到花粉足上，其腿部可以清晰看到由花粉粒組成的球狀物；黑帶食蚜蠅訪花頻率次之，主要訪雄花，但訪花時(shí)間較短，采食花粉時(shí)通常逗留13～18 s；黃守瓜在雄花之間爬動(dòng)，并且會(huì)訪問(wèn)葉子，采食花粉時(shí)全身沾滿花粉，停留時(shí)間為60～120 s，但訪花頻率較低；黑胸兼食瓢蟲是唯一在雌花上停留的昆蟲，停留時(shí)間為5～15 s，訪花頻率最低(見(jiàn)圖2)。昆蟲訪花高峰期在每天11：00—14：00和16：00—18：00，對(duì)“Shaoxing”傳粉具有一定的輔助作用。

圖2 訪花昆蟲訪花頻率

2.2 不同授粉處理花粉原位萌發(fā)與花粉管生長(zhǎng)

試驗(yàn)結(jié)果看出，授粉4 h后，自花授粉處理的柱頭上可以看到有較多的花粉開始萌發(fā)(圖3 A4)，自然授粉和套網(wǎng)處理的柱頭上花粉萌發(fā)量次之(圖3 A2、A3)，異花授粉處理的柱頭上的花粉萌發(fā)量較少(圖3 A5)，套袋處理未見(jiàn)有花粉粒黏附在柱頭上(圖3 A1)；授粉12 h后，花粉大量萌發(fā)，并開始穿過(guò)乳突細(xì)胞沿花粉管向下生長(zhǎng)，但出現(xiàn)不同程度的彎曲現(xiàn)象(圖3 B2至B5)。授粉24 h后，花粉管進(jìn)入花柱并沿花柱繼續(xù)向下生長(zhǎng)(圖3 C2至C5)，熒光顯微鏡下可觀察到有強(qiáng)烈的熒光斑，這是因?yàn)榛ǚ酃苤杏写罅侩蓦召|(zhì)沉淀，使花粉管生長(zhǎng)受到抑制(圖3 C3、C4)；授粉72 h后，束狀的花粉管穿過(guò)引導(dǎo)組織向下生長(zhǎng)(圖3 D2至D5)；授粉96 h后，少量花粉管已經(jīng)通過(guò)花柱，進(jìn)入胚囊(圖3 E2至E5)。其中套袋處理組柱頭上沒(méi)有花粉粒萌發(fā)，也沒(méi)有花粉管通過(guò)花柱進(jìn)入胚囊(見(jiàn)圖3)。

注：A1—A5：套袋、套網(wǎng)、自然授粉、自花和異花授粉4 h后，花粉萌發(fā)情況; B1—B5：套袋、套網(wǎng)、自然授粉、自花和異花授粉12 h后，花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)情況; C1—C5：套袋、套網(wǎng)、自然授粉、自花和異花授粉24 h后，花粉管生長(zhǎng)情況; D1—D5：套袋、套網(wǎng)、自然授粉、自花和異花授粉72 h后，花粉管生長(zhǎng)情況; E1—E5：套袋、套網(wǎng)、自然授粉、自花和異花授粉96 h后，花粉管生長(zhǎng)情況。

比較“Shaoxing”不同授粉處理的花粉萌發(fā)量可知，人工授粉的花粉萌發(fā)量高于其他處理組，花粉萌發(fā)量為人工授粉>自然授粉>套網(wǎng)>套袋。但是在花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中，不同授粉處理的花柱組織均有部分的花粉管不能到達(dá)胚囊完成受精，這可能是花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中形態(tài)發(fā)生了變化，生長(zhǎng)受了抑制，使其無(wú)法通過(guò)花柱組織到達(dá)胚囊。其中，除套袋處理組外，自花授粉處理組花粉管進(jìn)入胚囊的占比最高，為46.67%，其次為自然授粉處理，占40%，套網(wǎng)和異花授粉處理組花粉管進(jìn)入胚囊的數(shù)量最少，均占比33.34%(見(jiàn)表1)。

表1 薄殼山核桃“Shaoxing”不同授粉處理后花粉在柱頭上的萌發(fā)和生長(zhǎng)情況

2.3 不同授粉處理著果和結(jié)實(shí)情況

試驗(yàn)結(jié)果看出，不同授粉方式對(duì)“Shaoxing”的著果率和結(jié)實(shí)率的影響不一樣，自然授粉的著果率和結(jié)實(shí)率均為最高，套袋處理最后有2.06%的結(jié)實(shí)率，說(shuō)明“Shaoxing”的胚珠即使不通過(guò)受精作用也可以發(fā)育成胚，其可能存在無(wú)融合生殖現(xiàn)象。各授粉處理下花粉管最終進(jìn)入胚囊受精的數(shù)量較低，除套袋處理外，各授粉處理花粉管進(jìn)入胚囊受精的雌花數(shù)量在33.34%～46.67%之間，說(shuō)明在受精過(guò)程中存在53.33%～66.66%的受精障礙率，結(jié)合花粉原位萌發(fā)與花粉管生長(zhǎng)結(jié)果可看出，受精障礙的雌花授粉96 h后，花粉管向柱頭中部伸長(zhǎng)的過(guò)程中，出現(xiàn)胼胝質(zhì)沉淀、花粉管彎曲纏繞的現(xiàn)象，導(dǎo)致花粉管未能進(jìn)入胚囊進(jìn)行受精。不同授粉處理組花后的著果率只有32.99%～62.50%，也可看出受精不良對(duì)著果的影響。另外，各處理組著果后仍存在較高的落果率，其中人工自花授粉處理組著果后落果率最高，達(dá)53.61%；自然授粉處理組著果后落果率最低，為27.5%。著果后較高的落果現(xiàn)象影響最終的結(jié)實(shí)率，著果后的落果原因可能與受精不良相關(guān)，也可能與樹體營(yíng)養(yǎng)及環(huán)境因子相關(guān)(見(jiàn)表2)。

表2 薄殼山核桃“Shaoxing”不同授粉處理對(duì)著果率及結(jié)實(shí)率的影響

3 討論與結(jié)論

傳粉媒介作為植物傳粉系統(tǒng)三大組成之一，在傳粉中扮演著重要角色[10]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為薄殼山核桃雌雄花不分泌花蜜，不散發(fā)香氣，不具備吸引昆蟲的花部構(gòu)造，導(dǎo)致昆蟲訪花率低[11]。但通過(guò)連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)“Shaoxing”在盛花期有少量昆蟲訪花，且套網(wǎng)后著果率和結(jié)實(shí)率分別降低了13.35%和20.88%，說(shuō)明主要訪花昆蟲對(duì)“Shaoxing”傳粉也起到了輔助作用。另外，本研究在試驗(yàn)地內(nèi)不同高度都捕獲到花粉粒，且不同方向的花粉粒濃度不同，表明風(fēng)媒的傳播效率與風(fēng)力、地形地勢(shì)、溫度和空氣濕度有關(guān)，這與范曉明等[12]的研究結(jié)果相似。

薄殼山核桃“Shaoxing”熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)套袋處理未見(jiàn)有花粉萌發(fā)，其余各處理組的花粉原位萌發(fā)情況大致相同，但不同授粉處理均有部分花柱組織內(nèi)的花粉管出現(xiàn)彎曲纏繞、胼胝質(zhì)沉淀現(xiàn)象，導(dǎo)致花粉管生長(zhǎng)受到抑制，不能到達(dá)胚囊完成受精。套袋處理組未見(jiàn)花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)，這與楊先裕等[6]對(duì)薄殼山核桃“Mahan”的研究基本相同，與Retha等[13]對(duì)大花垂鈴兒UvulariagrandifloraSm.套袋未授粉的研究結(jié)果也一致?？琢钔╗11]對(duì)薄殼山核桃“Western”“莫愁”的授粉觀察發(fā)現(xiàn)，授粉2 h后柱頭上的花粉就會(huì)大量萌發(fā)，4 h花粉管進(jìn)入中央花柱道，10～12 h 進(jìn)入子房；趙明明等[14]發(fā)現(xiàn)“新新2號(hào)”核桃的花粉粒在柱頭上8 h時(shí)開始萌發(fā)，形成受精卵在10 d以上，且不同授粉處理花粉萌發(fā)率及花粉管生長(zhǎng)的時(shí)空格局很不一樣，這與本研究的研究結(jié)果有差異，可能與環(huán)境、授粉時(shí)間和品種等因素有關(guān)。

在本次試驗(yàn)中，“Shaoxing”套袋處理的著果率為32.99%，最終結(jié)實(shí)率為2.06%，表明其可能存在無(wú)融合生殖現(xiàn)象。寧萬(wàn)軍等[5]認(rèn)為花期如遇不良天氣會(huì)影響核桃的授粉受精進(jìn)程，核桃則多傾向于無(wú)融合生殖；張強(qiáng)等[15]對(duì)新疆兩個(gè)核桃品種進(jìn)行無(wú)融合生殖后發(fā)現(xiàn)其結(jié)實(shí)率為17.8%～58.8%；熊利權(quán)等[16]對(duì)云南漾濞泡核桃和娘青核桃的無(wú)融合生殖試驗(yàn)的結(jié)實(shí)率為3.79%～10.04%。趙明明等[14]對(duì)新疆南疆盆地主栽核桃品種“新新2號(hào)”進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)“新新2號(hào)”核桃果實(shí)中存在的著果率低、空殼率高可能與自花授粉和孤雌生殖有一定關(guān)系。本研究不同授粉處理中自然授粉著果率和結(jié)實(shí)率最高，表明人工輔助授粉對(duì)“Shaoxing”著果和結(jié)實(shí)無(wú)促進(jìn)作用；各授粉處理著果率較低，這可能與花粉管無(wú)法通過(guò)花柱組織到達(dá)胚囊而受精不良有關(guān)；而著果后到果實(shí)成熟期間仍有較高的落果率，可能是幼果胚胎發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)不良引起胚胎敗育造成的。因此，在后續(xù)研究中，有必要深入探討“Shaoxing”花粉管不能抵達(dá)胚囊和著果后胚胎敗育的原因，合理配置授粉樹，以便提高果實(shí)的產(chǎn)量和質(zhì)量。