王春梅，沈 珊，王 紅，李景軍，張秋明，曹尚銀

(1 岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南岳陽(yáng)，414000；2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙，410128；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，鄭州，450009)

核桃(Juglansregia)為胡桃科核桃屬植物，是世界四大干果之首[1]，具有極高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，是重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。全世界核桃分布和栽培遍及北美洲、亞洲、歐洲、大洋洲、南美洲等50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，核桃已是許多國(guó)家的重要經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[2]。從2003年起，我國(guó)每年核桃產(chǎn)量增長(zhǎng)量近15%，成為第二大油料作物[3]。目前，中國(guó)已成為世界上最大核桃生產(chǎn)國(guó)，產(chǎn)量占世界50%以上[4]。

嫁接是核桃良種化栽培的重要途徑[2]。其中核桃砧木對(duì)嫁接品種的適應(yīng)性、抗逆性及品質(zhì)、產(chǎn)量等具有重要影響[5]。目前，核桃主產(chǎn)國(guó)核桃產(chǎn)業(yè)也均因砧木相關(guān)病害受到制約[6-7]，如美國(guó)加州的核桃種植者面臨著與砧木相關(guān)的一系列嚴(yán)重病蟲害問(wèn)題，包括穿刺短體線蟲、冠癭病、疫病等[8]，許多國(guó)家正大力進(jìn)行核桃砧木良種的選育研究[9-11]。美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校已培育出能抗一種或多種此類疾病的無(wú)性系核桃砧木[8]。目前世界常用核桃砧木主要有核桃屬的奇異核桃(J.paradox)、黑核桃(J.hindsii)、普通核桃(J.regia)和鐵核桃(J.sigillata)等[2]。我國(guó)也開(kāi)始進(jìn)行核桃砧木選育，并選取出一些品種。山西省林業(yè)科學(xué)院從山西省屯留縣核桃實(shí)驗(yàn)站選育出晉RS系核桃砧木優(yōu)系，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院采用核桃(J.regia)與美國(guó)加州魁核桃(J.major)進(jìn)行雜交，選育出“中寧強(qiáng)”和“中寧奇”核桃砧木新品種[12-14]。近年，國(guó)內(nèi)外嘗試采用楓楊(Pterocaryastenoptera)作為核桃砧木。楓楊是胡桃科楓楊屬植物，其根系特別發(fā)達(dá)，且具有較強(qiáng)的耐熱性、耐澇性，有一定的抗旱性，對(duì)疫霉屬致病菌和根際線蟲造成的病害具有抗性[2]。美國(guó)的Browne等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與奇異核桃雜種(J.hindsii×J.regia)和北加州黑核桃(J.hindsii)相比較，7個(gè)無(wú)性系楓楊對(duì)疫霉菌(Phytophthoracinnamomi和P.citricola)具有相對(duì)抗性，在被P.cinnamomi和P.citricola污染的土壤上楓楊可能是有用的核桃砧木，但楓楊做砧木與部分核桃品種嫁接存在不親和的現(xiàn)象。

嫁接成活過(guò)程的關(guān)鍵是砧穗愈合過(guò)程，其實(shí)質(zhì)是砧木和接穗的相互作用，通過(guò)愈傷組織的形成、連接，維管束分化、連通，組合成有機(jī)整體，期間組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行著系列變化。因此，其細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)變化是觀察嫁接愈合過(guò)程的關(guān)鍵，也是研究其嫁接親和力的重要內(nèi)容[16-19]。黃堅(jiān)欽等[20]對(duì)以胡桃科的山核桃Caryacathayensis、化香樹(shù)Platycaryastrobilacea為砧木的山核桃嫁接愈合過(guò)程進(jìn)行了解剖學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)山核桃嫁接經(jīng)過(guò)了愈傷組織形成、對(duì)接、維管束橋的形成及維管分化等過(guò)程，搞清了每個(gè)過(guò)程形成的關(guān)鍵時(shí)期。周乃富等[21]對(duì)核桃J.regia種內(nèi)芽接愈合過(guò)程的組織學(xué)進(jìn)行觀察，研究了不同嫁接時(shí)期砧穗在愈傷組織形成、增殖和輸導(dǎo)組織連接過(guò)程中的組織學(xué)變化機(jī)制。陳崗等[22]通過(guò)熒光參數(shù)等生理指標(biāo)的測(cè)定和分析對(duì)美國(guó)山核桃C.illinoensis種內(nèi)嫁接親和性進(jìn)行了研究。范平樺等[23]根據(jù)美國(guó)山核桃C.illinoensis的Aux/IAAs基因家族在嫁接愈合中的表達(dá)模式，挖掘出4個(gè)高表達(dá)基因，它們可能在嫁接愈合過(guò)程中起重要作用。兗攀等[24]以美國(guó)山核桃C.illinoensis品種“馬罕”的2年生實(shí)生苗為砧木，采用切接法嫁接“波尼”品種1年生枝，對(duì)嫁接愈合過(guò)程進(jìn)行了組織細(xì)胞學(xué)觀察。目前，以楓楊為砧木的核桃嫁接愈合過(guò)程的組織解剖學(xué)觀察研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次運(yùn)用解剖學(xué)方法，通過(guò)光學(xué)顯微鏡與透射電鏡觀察核桃/楓楊嫁接組合的愈合過(guò)程，了解其愈傷組織形成、對(duì)接、維管束橋形成及維管分化等過(guò)程，以及愈合過(guò)程中組織細(xì)胞的變化特點(diǎn)，以期為改進(jìn)核桃/楓楊組合嫁接技術(shù)，提高嫁接成活率，揭示其嫁接愈合機(jī)理，提供組織細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗(yàn)地點(diǎn)為湖南省岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院苗圃。核桃J.regia接穗取自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所核桃良種繁育基地，為6～8年生的“中核短枝”核桃品種的1年生枝。砧木為2年生湖南野生楓楊Pterocaryastenoptera實(shí)生苗，高100～150 cm，地徑1.5 cm左右。

采用改進(jìn)的方塊芽接法嫁接，嫁接時(shí)間為2020年6月20日。分別于嫁接后3、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、45 d采樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集4個(gè)嫁接莖段，在嫁接切面縱向切取包含木質(zhì)部、韌皮部和愈傷組織的長(zhǎng)方形樣，長(zhǎng)5～6 mm。樣品用甲醛-乙酸-乙醇(FAA)固定液[配方：38%甲醛(福爾馬林)5 mL，冰醋酸5 mL，70%酒精90 mL，甘油(丙三醇)5 mL]固定，4 ℃低溫保存，以備制作切片。

1.2 切片制作及觀察

切片前處理：樣品用2.5%戊二醛固定2～4 h→磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH值7.0。配制方法：取0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液61 mL、0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液39 mL混合配成母液，加1倍雙蒸水即可)清洗3次→1%鋨酸浸泡4～6 h→磷酸緩沖液清洗3次(每次清洗20 min)→在室溫下用30%、50%、70%、80%、95%丙酮和純丙酮逐級(jí)脫水(每級(jí)30 min，每級(jí)丙酮液換3次)→用Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋。

切片：用Lecia RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)制作10 μm厚石蠟切片，用超薄切片機(jī)制作厚度50～70 nm超薄切片。

觀察：石蠟切片用2.5%過(guò)碘酸脫掉樹(shù)脂和鋨酸，甲苯胺藍(lán)染色，Leica DM5000光鏡觀察并拍照；超薄切片用醋酸鈾及檸檬酸鉛染色，日本日立公司H-7800透射電鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 楓楊砧木與核桃接穗的解剖結(jié)構(gòu)

從圖1-1、圖1-2、圖1-3可看出，接穗核桃與砧木楓楊解剖結(jié)構(gòu)相同，從外到內(nèi)依次均為周皮、皮層、韌皮部、形成層和木質(zhì)部。兩者都有發(fā)達(dá)的韌皮部，有大量的韌皮纖維，其中，砧木的韌皮部纖維有單列和二列，接穗多為單列。兩者木質(zhì)部的木纖維也都非常發(fā)達(dá)，均有豐富的導(dǎo)管。接穗的木射線多為單列，砧木木射線有單列與二列。生長(zhǎng)期，兩者的形成層均較厚，有6～8層，也均呈扁平狀緊密排列?？梢?jiàn)，雖然楓楊與核桃為胡桃科的不同屬，但組織結(jié)構(gòu)相似程度較高。

圖1 楓楊與核桃嫁接愈合過(guò)程的顯微結(jié)構(gòu)觀察

2.2 嫁接口愈合過(guò)程的顯微結(jié)構(gòu)

2.2.1 隔離層的形成期 核桃/楓楊嫁接后3 d，在砧木與接穗的切削面上分別可以觀察到由受傷死細(xì)胞堆積的一顏色較深的薄層(見(jiàn)圖1-4)，砧木與接穗的隔離層同時(shí)形成。

2.2.2 愈傷組織形成期 核桃/楓楊嫁接后6 d，砧木與接穗隔離層兩側(cè)的形成層細(xì)胞被激活，進(jìn)行旺盛的細(xì)胞分裂，產(chǎn)生柔軟的愈傷組織薄壁細(xì)胞，其與形成層較規(guī)則的“磚塊”形狀不一樣，細(xì)胞普遍變大，且大小不一，呈現(xiàn)為不規(guī)則多邊形，液泡化程度高，排列雜亂無(wú)序(見(jiàn)圖1-5)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隔離層增厚，且核桃接穗產(chǎn)生的愈傷組織薄壁細(xì)胞比楓楊砧木多(見(jiàn)圖1-5)。

嫁接后8 d，砧木與接穗持續(xù)產(chǎn)生大量愈傷組織，徑向薄壁細(xì)胞層數(shù)增加了十幾層，并且接穗與砧木各自產(chǎn)生的愈傷組織薄壁細(xì)胞部分相互抱合，出現(xiàn)細(xì)胞融合現(xiàn)象(見(jiàn)圖1-6)。

2.2.3 形成層環(huán)形成期 嫁接后10 d，愈傷組織薄壁細(xì)胞開(kāi)始慢慢變成圓形或長(zhǎng)圓形，且排列緊密，部分突破了隔離層，形成了連接砧穗的愈傷組織橋(見(jiàn)圖1-7)。愈傷組織橋的出現(xiàn)，可盡早實(shí)現(xiàn)砧木為接穗提供營(yíng)養(yǎng)和水分，對(duì)嫁接成活起著關(guān)鍵性的作用。愈傷組織突破隔離層形成愈傷組織橋被認(rèn)為是砧穗親和性的重要標(biāo)志之一[10-11]。

嫁接后12～18 d，接穗與砧木形成層旁的薄壁細(xì)胞持續(xù)分化出新形成層，同時(shí)愈傷組織也分化出原形成層，砧、穗薄壁細(xì)胞分化的新形成層逐漸與愈傷組織分化的原形成層連接，最后形成完整的形成層環(huán)(見(jiàn)圖1-8)。同時(shí)，皮層的薄壁細(xì)胞形成大量愈傷組織(見(jiàn)圖1-9)。

2.2.4 維管組織分化形成期 嫁接后20 d，隨著愈傷組織的不斷增生，在愈傷組織某些區(qū)域分化出管狀分子和篩分子，互相連接并貫穿，進(jìn)而形成連接砧穗的維管束橋(見(jiàn)圖1-10)。隨著維管束橋的出現(xiàn)，砧木增強(qiáng)了對(duì)接穗營(yíng)養(yǎng)和水分物質(zhì)的輸送，加快了組織的分化，維管束橋中的形成層促進(jìn)產(chǎn)生更多連接接穗的維管組織。嫁接30 d后，新的維管形成層向外形成次生韌皮部，含有新生的篩管，向內(nèi)形成木質(zhì)部和次生木質(zhì)部，有新生導(dǎo)管產(chǎn)生，砧穗連為一體(見(jiàn)圖1-11)。

2.3 嫁接口愈合過(guò)程的超微結(jié)構(gòu)

嫁接3～14 d，嫁接切口面的細(xì)胞因切傷破損，形成層細(xì)胞受到創(chuàng)傷的刺激，細(xì)胞原生質(zhì)體緩慢降解或消失，部分細(xì)胞壁破裂，其細(xì)胞質(zhì)被擠壓形成隔離層(見(jiàn)圖2-1、圖2-2)。相鄰薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂后，解體的絮狀原生質(zhì)體相互融合在一起(圖2-3)。受傷嚴(yán)重的細(xì)胞內(nèi)，中央的大液泡消失，出現(xiàn)多個(gè)的小液泡，細(xì)胞質(zhì)呈棉絮狀，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)油滴現(xiàn)象，呈現(xiàn)明顯的愈傷反應(yīng)現(xiàn)象(圖2-4、圖2-5)。韌皮部、木質(zhì)部的薄壁細(xì)胞間的胞間連絲明顯，胞間連絲經(jīng)常成群形成于細(xì)胞壁較薄的位置(圖2-6)。此期的愈傷組織呈不規(guī)則排列，薄壁細(xì)胞之間有較大間隙(圖2-7)。在愈傷組織細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間出現(xiàn)囊泡狀的壁旁體、多泡體(圖2-8、圖2-9)。在嫁接切口面附近2～3層細(xì)胞內(nèi)含有大量線粒體、淀粉粒(圖2-10、圖2-11、圖2-12)。

圖2 愈合過(guò)程中愈傷組織細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)

續(xù)圖2

與隔離層相鄰的細(xì)胞，原生質(zhì)減少，中央大液泡將原生質(zhì)推向細(xì)胞壁周邊(圖2-13)。有些薄壁細(xì)胞顯著膨大，周邊細(xì)胞被擠毀(圖2-14)。

在形成層兩邊的愈傷組織薄壁細(xì)胞分泌出果膠質(zhì)到細(xì)胞壁外，呈圓珠狀，夾在相鄰細(xì)胞壁中間，相當(dāng)于中層，隨著果膠積累，愈傷組織薄壁細(xì)胞顯著增厚(圖2-15和圖2-16)。

嫁接后30～45 d，果膠質(zhì)在細(xì)胞壁復(fù)合體中逐步分散、消失，并產(chǎn)生胞間連絲(圖2-17，圖2-18)；形成層帶細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)小液泡，且有豐富的蛋白質(zhì)、線粒體等，細(xì)胞質(zhì)呈絮狀，仍呈現(xiàn)明顯的愈傷組織反應(yīng)(見(jiàn)圖2-19)。

3 討論

一般而言，若砧木和接穗組織結(jié)構(gòu)相似，則嫁接后的親和性較好[25]。通過(guò)楓楊砧木與核桃接穗解剖的光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)二者組織結(jié)構(gòu)相似度高，這可能是胡桃科不同屬的楓楊和核桃具有嫁接親和性的原因之一。

通過(guò)嫁接口愈合過(guò)程的顯微結(jié)構(gòu)解剖學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，核桃/楓楊嫁接組合的愈合過(guò)程也可大致分為4個(gè)階段：隔離層形成期、愈傷組織形成期、形成層環(huán)形成期和維管組織分化形成期[17-18，24，26-31]。且嫁接后20 d左右形成愈傷組織橋、形成層環(huán)、維管束橋，是嫁接成活的關(guān)鍵時(shí)期，因此，這段時(shí)期要?jiǎng)?chuàng)造有利的嫁接環(huán)境。同時(shí)還觀察到以下現(xiàn)象：砧木與接穗隔離層同時(shí)形成，但核桃接穗的愈傷組織薄壁細(xì)胞大量產(chǎn)生的時(shí)期比楓楊砧木早。皮層薄壁細(xì)胞也可形成大量愈傷組織，說(shuō)明了形成層不一定是愈傷組織形成的唯一來(lái)源；但形成層的愈傷組織的形成一定先于皮層愈傷組織產(chǎn)生，是愈傷組織形成的主要來(lái)源。接穗與砧木各自產(chǎn)生的愈傷組織薄壁細(xì)胞相互融合的形態(tài)、愈傷組織橋的形態(tài)、形成層環(huán)的形態(tài)、維管束橋的形態(tài)以及新生維管組織的形態(tài)等，這些顯微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)將為改進(jìn)楓楊與核桃嫁接技術(shù)，提高嫁接成活率，揭示嫁接親和性機(jī)理提供組織細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

嫁接初期受傷的細(xì)胞形成隔離層，隔離層兩邊的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞器變化，內(nèi)膜系統(tǒng)重組，物質(zhì)轉(zhuǎn)移等系列愈傷反應(yīng)[32-33]。本研究通過(guò)嫁接后超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，核桃/楓楊嫁接初期接口面相鄰細(xì)胞間細(xì)胞壁破裂后，出現(xiàn)了細(xì)胞融合現(xiàn)象，這與顯微結(jié)構(gòu)觀察的現(xiàn)象一致。同時(shí)，隔離層兩邊細(xì)胞的線粒體和淀粉粒增加，出現(xiàn)用以轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的壁旁體和多泡體等，還觀察到了細(xì)胞質(zhì)的油滴現(xiàn)象，這些現(xiàn)象均屬于愈傷反應(yīng)[17-21]。嫁接初期愈傷組織會(huì)分泌果膠質(zhì)，且使細(xì)胞壁增厚約三倍，果膠質(zhì)滲入隔離層起到“黏合劑”作用[17-18]。本研究超顯微結(jié)構(gòu)觀察也發(fā)現(xiàn)，核桃/楓楊嫁接前期，形成層兩邊的薄壁細(xì)胞產(chǎn)生了果膠質(zhì)，使細(xì)胞壁明顯增厚，在嫁接成功后果膠質(zhì)逐漸消失，并在較薄的地方出現(xiàn)胞間連絲；但有些果膠質(zhì)并沒(méi)有滲透入隔離層，一直到嫁接成功后慢慢消失。

4 結(jié)論

楓楊砧木與核桃嫁接后的前20 d左右形成愈傷組織橋、形成層環(huán)和維管束橋，是嫁接成活關(guān)鍵時(shí)期。形成層不是產(chǎn)生愈傷組織的唯一來(lái)源，皮層也可形成愈傷組織。嫁接初期隔離層兩邊的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞器變化，內(nèi)膜系統(tǒng)重組，物質(zhì)轉(zhuǎn)移等系列愈傷反應(yīng)。