黃文靜，楊光柱，劉丹丹，李 帆，鄭麗萍，馬 鈞

(1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/云貴高原果樹科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，昆明，650205；2 云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，昆明，650205)

植物愈傷組織是培養(yǎng)懸浮細(xì)胞和獲得原生質(zhì)體的優(yōu)良材料，可用于研究植物生長(zhǎng)發(fā)育及分化的機(jī)制、遺傳變異規(guī)律，或用于細(xì)胞培養(yǎng)篩選、細(xì)胞融合中原生質(zhì)體的來(lái)源等。愈傷組織培養(yǎng)不僅是一種植物快繁手段，同時(shí)也是植物改良、種質(zhì)保存、有用化合物生產(chǎn)的理想途徑[1]。光是植物生長(zhǎng)重要因素之一，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，影響葉綠素a、葉綠素b對(duì)光的吸收，從而影響光合作用的光反應(yīng)階段；同時(shí)還作為一種信號(hào)影響植物生長(zhǎng)代謝、物質(zhì)運(yùn)輸、果實(shí)品質(zhì)等。有研究表明，不同LED光質(zhì)對(duì)番茄、蘿卜、草莓果實(shí)的著色有益，對(duì)豌豆苗、生菜品質(zhì)有益[2]，對(duì)火龍果、蘋果砧木組培苗分化有益[3-4]，但在火龍果愈傷組織培養(yǎng)上的應(yīng)用研究較少。因此，本研究采用5種不同配比的LED光質(zhì)，篩選對(duì)火龍果胚性愈傷組織生長(zhǎng)適宜的光照組合，為植物愈傷組織培養(yǎng)中LED光源的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所果樹中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)，紅皮紅肉“玫瑰紅龍”火龍果成熟胚，種胚消毒滅菌后采用芽誘導(dǎo)培養(yǎng)液1/2 MS+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+20 g/L蔗糖，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，光照為全白光12 h/d，誘導(dǎo)15 d左右，可誘導(dǎo)出兩片子葉，25 d左右子葉中部生長(zhǎng)出幼芽，切除根系后接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，每瓶10個(gè)，50瓶1組分別放置于不同光質(zhì)處理下培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基pH值5.8，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 LED光質(zhì)條件設(shè)置

LED光照培養(yǎng)采用專利號(hào)為ZL 2019.2.1299069.3的節(jié)能組培架，LED光源置于每層頂部，垂直照射，設(shè)置LED白光、紅光、紅光+藍(lán)光、綠光+藍(lán)光、紅光+綠光、紅光+藍(lán)光+綠光等6個(gè)處理；光照強(qiáng)度分別13.5～14.0、14.6～14.9、14.4～14.8、14.3～14.5、14.3～14.9、14.3～14.9 μmol·m-2·s-1，白光波長(zhǎng)424～724 nm，波長(zhǎng)峰值459 nm，紅光波長(zhǎng)606～657 nm，波長(zhǎng)峰值635 nm，藍(lán)光波長(zhǎng)440～500 nm，波長(zhǎng)峰值465 nm，綠光波長(zhǎng)488～562 nm，波長(zhǎng)峰值517 nm?；瘕埞墒炫呓臃N愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，放置于不同光質(zhì)處理培養(yǎng)室，12 h/d；另設(shè)置紅光+綠光培養(yǎng)下，每天分別照射8、12、16 h等處理時(shí)長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，比較不同處理愈傷組織鮮質(zhì)量差異和細(xì)胞活性。

1.3 愈傷組織生長(zhǎng)量測(cè)定

接種后第20天開始，每隔10 d，分別取不同光質(zhì)處理30個(gè)愈傷組織稱量其鮮質(zhì)量，連續(xù)測(cè)量5次，比較不同光質(zhì)處理的愈傷組織生長(zhǎng)量。

1.4 細(xì)胞活性測(cè)定

接種后每7 d測(cè)定不同光質(zhì)處理火龍果愈傷組織細(xì)胞活性1次，方法參考劉華等[16]的TTC法，吸光度(OD值)即代表細(xì)胞活性，吸光度越大，細(xì)胞活性越大。

1.5 光照時(shí)長(zhǎng)的影響測(cè)定

紅光+綠光處理下，接種后每7 d測(cè)量不同光照時(shí)長(zhǎng)處理下火龍果愈傷組織鮮質(zhì)量及細(xì)胞活性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響

從表1看出，不同光質(zhì)處理下，愈傷組織增殖速率呈穩(wěn)定增長(zhǎng)狀態(tài)，紅光+綠光處理對(duì)火龍果愈傷組織鮮質(zhì)量增殖效果最好，培養(yǎng)30 d鮮質(zhì)量32.1 g，培養(yǎng)70 d鮮質(zhì)量41.3 g，其余處理愈傷組織鮮質(zhì)量從高到低依次為白光>紅光+藍(lán)光>綠光+藍(lán)光>紅光+藍(lán)光+綠光>紅光，紅光處理培養(yǎng)30 d鮮質(zhì)量14.1 g，培養(yǎng)70 d鮮質(zhì)量22.8 g。不同光質(zhì)處理均能使火龍果愈傷組織增殖，但差異不顯著。

表1 不同LED光質(zhì)處理的火龍果愈傷組織生長(zhǎng)情況比較

2.2 不同光質(zhì)對(duì)愈傷組織細(xì)胞活性的影響

從圖1可以看出，除紅光處理外，其余處理愈傷組織細(xì)胞活性7～21 d均呈上升趨勢(shì)，在第28天時(shí)達(dá)到頂峰，28～42 d平緩增長(zhǎng)，42 d后下降，49～70 d緩慢下降。其中紅光+綠光處理下，愈傷組織細(xì)胞活性最高，在第28天達(dá)到峰值0.78，后下降，49～56 d有小幅度上升，56～70 d緩慢下降。紅光處理下14 d前細(xì)胞活性有所下降，后呈上升趨勢(shì)，35～42 d達(dá)到峰值0.47。說(shuō)明紅光+綠光處理對(duì)火龍果愈傷組織培養(yǎng)效果較好，可在較短時(shí)間內(nèi)使火龍果愈傷組織細(xì)胞大量生長(zhǎng)且活性較高。

圖1 不同LED光質(zhì)處理的火龍果愈傷組織細(xì)胞活性(OD值)比較

2.3 同光質(zhì)不同處理時(shí)長(zhǎng)的影響

從圖2可以看出，紅光+綠光12 h/d處理對(duì)火龍果愈傷組織增重效果最佳，平穩(wěn)增重，8 h/d處理次之，16 h/d處理最弱。說(shuō)明照射12 h/d最有利于愈傷組織細(xì)胞鮮質(zhì)量增長(zhǎng)。

圖2 紅光+綠光不同時(shí)長(zhǎng)處理對(duì)火龍果愈傷組織鮮質(zhì)量的影響

從圖3可以看出，紅光+綠光不同時(shí)長(zhǎng)處理的愈傷組織細(xì)胞活性都在第28天達(dá)到頂峰，28～42 d緩慢下降，42～49 d下降迅速，49～56 d時(shí)小幅上升，56～70 d平穩(wěn)下降。光照12 h/d第28天細(xì)胞活性最高，為0.78，說(shuō)明12 h/d處理的愈傷組織細(xì)胞活性最佳。

圖3 紅光+綠光不同時(shí)長(zhǎng)處理對(duì)火龍果愈傷組織細(xì)胞活性的影響

3 結(jié)論與討論

本研究中，火龍果愈傷組織鮮質(zhì)量在不同光質(zhì)條件下均隨培養(yǎng)時(shí)間平穩(wěn)增加。紅光+綠光處理更有利于火龍果愈傷組織生長(zhǎng)，培養(yǎng)70 d時(shí)愈傷組織鮮質(zhì)量為41.3 g；細(xì)胞活性在培養(yǎng)28 d時(shí)達(dá)到最高，為0.78；培養(yǎng)28～42 d細(xì)胞活性較高，為0.75～0.78，42 d后細(xì)胞活性急速降低，可能與培養(yǎng)基中養(yǎng)分消耗殆盡有關(guān)，此時(shí)需及時(shí)更換培養(yǎng)基，以保證愈傷組織有充足養(yǎng)分持續(xù)生長(zhǎng)。總體看來(lái)紅光+綠光最有利于火龍果胚愈傷組織培養(yǎng)，相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)可獲得更多的愈傷組織，且細(xì)胞活性最佳。單純紅光不利于火龍果愈傷組織生長(zhǎng)，且細(xì)胞活性最低。

目前不同波長(zhǎng)光質(zhì)在植物培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，光質(zhì)對(duì)植物形態(tài)發(fā)生、光形態(tài)建成、生長(zhǎng)控制、代謝物含量影響及各種反應(yīng)機(jī)制的研究也越來(lái)越深入，不同光質(zhì)對(duì)植物愈傷組織、原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)、分化有一定影響[5]。不同LED光質(zhì)處理中，黃光有利于白蘿卜下胚軸和子葉的分化，綠光對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有一定抑制作用，藍(lán)紅光對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)不及單色光[6]，這與本研究紅光+綠光有利于火龍果愈傷組織生長(zhǎng)的結(jié)果不相符。

有研究發(fā)現(xiàn)，油菜采用一定強(qiáng)度的單色光處理，可以縮短外植體的啟動(dòng)時(shí)間，促進(jìn)愈傷組織增殖[7]。以河套密瓜外植體培養(yǎng)愈傷組織，紅藍(lán)混合光對(duì)子葉和葉片愈傷組織形成比單色光弱，且發(fā)育不良[8]。LED橙光和LED紅光處理下龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)緩慢、長(zhǎng)勢(shì)較差，呈水浸狀態(tài)；LED藍(lán)光和LED綠光處理下的愈傷組織水浸狀，顏色褐黃，生長(zhǎng)量最小，長(zhǎng)勢(shì)最差[9]。研究不同光質(zhì)對(duì)葡萄愈傷組織生長(zhǎng)的影響發(fā)現(xiàn)，綠光、黃光有利，藍(lán)光和紅光次之[10]。黃瓜、番茄在藍(lán)光和紅光下的生物量最大，綠光次之[11]。對(duì)龍眼胚性愈傷組織[12]、石刁柏愈傷組織培養(yǎng)[13]發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光、紅光對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。藍(lán)光和黃光對(duì)白樺愈傷組織的增殖生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，綠光次之，紅光對(duì)愈傷組織的增殖效果不明顯[14]，這與本研究單純紅光對(duì)火龍果愈傷組織生長(zhǎng)增殖效果不明顯相符。這些研究結(jié)果與本研究所得結(jié)果有一定差異，這可能由于不同植物愈傷組織對(duì)光質(zhì)的需求不同。對(duì)于不同LED光質(zhì)對(duì)火龍果愈傷組織的次生代謝物是否有影響，需要進(jìn)一步研究。