鄒毅輝，徐婧君，陳育青，黃紅宣，2

(1 漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，福建漳州，363000；2 漳州市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，漳州，363000)

百香果PassifloracoeruleaL.，又名雞蛋果，西番蓮，是西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬草質(zhì)藤本植物，栽培于廣東、海南、福建、云南、臺(tái)灣，有時(shí)逸生于海拔180～1 900 m的山谷叢林中[1]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)百香果、百香果汁以及副產(chǎn)物(果皮、果葉、種籽)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)百香果主要含有黃酮類、三萜類、生物堿等，具有抗氧化、抗菌、神經(jīng)保護(hù)作用等多種生物活性[2]。福建省百香果種植面積近1.33萬hm2，年產(chǎn)值50億元，惠及10萬農(nóng)戶，帶動(dòng)農(nóng)戶戶均增收4萬元以上。

雖然百香果產(chǎn)業(yè)發(fā)展積極性高，但病害問題日漸突出，易感病毒[3]、細(xì)菌和真菌病害[4]，栽培百香果具有明顯的連作障礙現(xiàn)象。連作障礙是指在同一土壤上種植同一作物多年，由于土壤質(zhì)量的耗損，害蟲和有害土壤微生物群落的增加，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。連作多年的百香果園地，即使是重新栽種的植株，生長情況及產(chǎn)量也遠(yuǎn)低于新開墾種植園[5]，連作障礙嚴(yán)重影響百香果產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

土壤微生物多樣性是維持土壤健康和肥力的關(guān)鍵因素，土壤中分布廣泛的微生物與土壤的重要功能息息相關(guān)[6]。根際土壤微生物參與了保持土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)、土壤養(yǎng)分循環(huán)、病蟲害控制和污染物降解等提升土壤生產(chǎn)力過程[7]。有研究報(bào)道，連作影響根際土壤微生物結(jié)構(gòu)，因此，根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與連作障礙的關(guān)系日益受到關(guān)注[8-10]。對(duì)連年種植的西瓜根際土壤微生物群落組成研究發(fā)現(xiàn)，連作后根際土壤微生物細(xì)菌群落多樣性下降而真菌群落多樣性上升，不同種植年限的西瓜根際微生物群落組成存在顯著差異[11]。胡蘿卜[12]、枸杞[13]和香草[14]等作物連作也會(huì)使根際土壤菌群多樣性下降，使菌群結(jié)構(gòu)退化，導(dǎo)致根際微生態(tài)失衡，從而引發(fā)連作病害。連作百香果的根際土壤微生物多樣性變化和群落結(jié)構(gòu)組成鮮見報(bào)道。

高通量測序具有成本低、通量高和信息豐富等特點(diǎn)，使其在土壤微生物研究中的應(yīng)用具有優(yōu)越性[15]。從土壤中提取DNA后進(jìn)行高通量測序?yàn)橥寥郎锒鄻有员O(jiān)測和評(píng)估提供了可能性。本研究通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，分析百香果根際土壤細(xì)菌和真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)，探索連作百香果根際土壤細(xì)菌和真菌群落變化規(guī)律，為揭示百香果連作障礙機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

福建省漳州市華安縣綿治村，平均海拔600 m左右，年平均氣溫17.5～21.4 ℃，年平均降雨量1 700 mm，屬于南亞熱帶季雨林氣候，土壤紅壤。2020年6月26日，在當(dāng)?shù)剡x取相鄰的百香果新植園和連作3年試驗(yàn)地，沿“S”形路徑在每個(gè)樣方內(nèi)選擇百香果10株，取1～10 cm深度的根際土壤，抖落并用小毛刷收集根際土壤至無菌培養(yǎng)皿中保存?zhèn)溆?，將每個(gè)樣方內(nèi)取得的10份根際土壤混勻?yàn)?份土樣，每個(gè)樣方重復(fù)3次。采集的樣本放置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冰箱保存待測。

1.2 根際土壤DNA提取及PCR擴(kuò)增

以O(shè)MEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒進(jìn)行土壤DNA提取，利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量。PCR所用的引物為細(xì)菌16S V3-V4區(qū)341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)[16]，真菌18S V4區(qū)18SV4F(GGCAAGTCTGGTGCCAG)和18SV4R(ACGGTATCTRATCRTCTTCG)[17]。以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，使用Illumina橋式PCR兼容引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測定量后純化回收，由生工(上海)生物工程有限公司的Illumina-MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Cutadapt、Pear、Prinseq、Usearch和uchime軟件進(jìn)行序列的質(zhì)量篩選和優(yōu)化。以97%相似度對(duì)樣本序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類，利用Alpha分析物種多樣性和豐富度。利用RDP classifier及Silva數(shù)據(jù)庫分析樣本中不同分類水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)及組成[20-22]。采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落豐度與多樣性分析

細(xì)菌16S高通量測序后共獲得624 213條有效序列，真菌18S高通量測序后共獲得488 535條有效序列。經(jīng)與數(shù)據(jù)庫比對(duì)后，細(xì)菌16S共獲得10 570個(gè)OTU，真菌18S共獲得3 942個(gè)OTU，樣本文庫的覆蓋率達(dá)到了99.4%以上，說明測序數(shù)據(jù)量達(dá)到飽和，能夠真實(shí)地反映樣品根際土壤微生物的群落組成。

通過Alpha多樣性指數(shù)分析微生物群落的豐富度和多樣性，包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)。群落豐富度的指數(shù)主要包括Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，指數(shù)越大，群落豐富度越高。由表1可以看出，新植園根際土壤的細(xì)菌Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)低于3年連作園，說明連作后根際土壤的細(xì)菌群落豐富度增加；群落多樣性指數(shù)包括香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)，香農(nóng)指數(shù)越大，群落多樣性越高，辛普森指數(shù)越大，群落多樣性越低。新植園根際土壤樣本的細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)高于3年連作園，辛普森指數(shù)低于3年連作園，說明連作后樣品根際土壤的細(xì)菌群落多樣性降低，兩者差異顯著。新植園根際土壤樣本的真菌Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)低于3年連作園，兩者差異顯著；而香農(nóng)指數(shù)升高，辛普森指數(shù)下降，但差異不顯著，說明連作后根際土壤真菌的群落豐富度顯著增加，群落多樣性升高(見表1)。

表1 福建省漳州市華安縣綿治村百香果不同種植園根際土壤細(xì)菌和真菌的Alpha多樣性分析

2.2 細(xì)菌群落組成與群落結(jié)構(gòu)

細(xì)菌門水平的差異性分析結(jié)果顯示，兩個(gè)樣本根際土壤的優(yōu)勢菌門(相對(duì)豐度>5%)均為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)。擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)相對(duì)豐度比較低(2%～5%)。連作后的根際土壤中變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)相對(duì)豐度分別增加了5.86個(gè)百分點(diǎn)和2.21個(gè)百分點(diǎn)，放線菌門(Actinobacteria)減少了3.40個(gè)百分點(diǎn)(見圖1)。

圖1 福建省漳州市華安縣綿治村百香果不同種植園根際土壤門水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

細(xì)菌屬水平上的差異性分析結(jié)果顯示，新植園土樣相對(duì)豐度排名前五的細(xì)菌屬為Gp2、unclassified_Gammaproteobacteria、unclassified_Bacteria、unclassified_Acidobacteria_Gp1、unclassified_Rhodospirillaceae。3年連作園土樣相對(duì)豐度排名前五的細(xì)菌屬為Gp2、unclassified_Gammaproteobacteria、unclassified_Bacteria、unclassified_Acidobacteria_Gp1、unclassified_Xanthomonadaceae。3年連作園根際土壤中γ-變形菌綱未分類屬unclassified_Gammaproteobacteria相對(duì)豐度增加了5.55個(gè)百分點(diǎn)，黃單胞桿菌科未分類屬unclassified_Xanthomonadaceae相對(duì)豐度增加了6.03個(gè)百分點(diǎn)，酸桿菌門中Gp2相對(duì)豐度降低了3.90個(gè)百分點(diǎn)(見圖2)。

圖2 福建省漳州市華安縣綿治村百香果不同種植園根際土壤屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.3 真菌群落組成與群落結(jié)構(gòu)

真菌門水平上相對(duì)豐度顯示，新植園根際土壤主要的優(yōu)勢真菌門為子囊菌門(Ascomycota)，相對(duì)豐度為75.82%；3年連作園根際土壤主要優(yōu)勢真菌門為子囊菌門(Ascomycota)和毛霉門(Mucoromycota)，相對(duì)豐度分別為47.41%和21.19%。3年連作園的根際土壤中子囊菌門(Ascomycota)減少了28.41個(gè)百分點(diǎn)，而毛霉門(Mucoromycota)增加了14.73個(gè)百分點(diǎn)(見圖3)。

圖3 福建省漳州市華安縣綿治村百香果不同種植園根際土壤門水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)

真菌屬水平上相對(duì)豐度顯示，枝孢霉屬(Cladosporium)、子囊菌屬(Archaeorhizomyces)、小被孢霉(Mortierella)、孢子絲菌屬(Sporothrix)、糞殼菌屬(Sordaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)、糞盤菌屬(Ascobolus)、枝瑚菌屬(Ramaria)為豐度較高菌屬。3年連作園的根際土壤的子囊菌屬(Archaeorhizomyces)、孢子絲菌屬(Sporothrix)、糞殼菌屬(Sordaria)減少了11.80個(gè)百分點(diǎn)、6.63個(gè)百分點(diǎn)和6.52個(gè)百分點(diǎn)，小被孢霉(Mortierella)、鐮刀菌屬(Fusarium)分別增加了8.35個(gè)百分點(diǎn)和4.05個(gè)百分點(diǎn)(見圖4)。

圖4 福建省漳州市華安縣綿治村百香果不同種植園根際土壤屬水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論與討論

植物根際土壤中包含病原微生物，它們可以引起植物病害或者產(chǎn)生有毒物質(zhì)，從而對(duì)植物生長產(chǎn)生不利影響。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，如何通過農(nóng)業(yè)生產(chǎn)措施有效維持植物健康的根際微生物群落，從而提高植物抗病性、抗逆性、養(yǎng)分利用效率等，是未來研究的重要方向[20-22]。有益微生物減少和病原微生物富集可引發(fā)植物各種土傳病害，導(dǎo)致土壤微生物群落組成多樣性失衡，這是造成連作障礙的根本原因[24]。本研究利用Illumina高通量測序技術(shù)分析百香果連作后根際土壤微生物群落變化，連作后根際土壤的細(xì)菌群落豐富度增加，細(xì)菌群落多樣性降低；真菌群落豐富度顯著增加，群落多樣性升高。連作后根際土壤中細(xì)菌群落多樣性降低，真菌群落多樣性增高，導(dǎo)致土壤由“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)化，這是百香果連作病害頻發(fā)的一個(gè)重要因素。

百香果連作后根際細(xì)菌群落多樣性的降低主要是由于細(xì)菌類群的相對(duì)豐度變化引起的。分析細(xì)菌群落組成發(fā)現(xiàn)，連作后百香果根際土壤中放線菌門(Actinobacteria)的相對(duì)豐度顯著減少。這一結(jié)果與不同連作年限馬鈴薯、西瓜、甘薯土壤細(xì)菌多樣性研究結(jié)果一致[11，25-26]。放線菌門細(xì)菌(Actinobacteria)是土壤養(yǎng)分供給的主要來源，也是生態(tài)系統(tǒng)中最為廣泛的細(xì)菌門類之一。放線菌可以通過產(chǎn)生抗菌和殺線蟲化合物來預(yù)防一些土傳病害[27]；而細(xì)菌性疾病和線蟲也是引起百香果產(chǎn)量減少的重要原因。在細(xì)菌屬水平上，3年連作園根際土壤中黃單胞桿菌科未分類屬unclassified_Xanthomonadaceae相對(duì)豐度顯著增加，而黃單胞菌屬中大部分成員是植物致病細(xì)菌，引起的植物病害遍布全世界[28]。

分析真菌群落組成發(fā)現(xiàn)，連作園根際土壤中主要的優(yōu)勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)和毛霉門(Mucoromycota)。子囊菌門(Ascomycota)是養(yǎng)分循環(huán)中的重要分解者，在真菌群落中占主導(dǎo)地位[29]。百香果連作后，子囊菌門(Ascomycota)相對(duì)豐度顯著降低，進(jìn)而可能極大地影響百香果植株的生長發(fā)育。鐮刀菌是土傳病害中主要致病真菌，百香果的莖基腐病和枯萎病主要由于鐮刀菌引起[30-31]。連作百香果根際土壤中鐮刀菌屬(Fusarium)真菌豐度增加了8.35個(gè)百分點(diǎn)，鐮刀菌豐度的增加是導(dǎo)致百香果連作障礙的重要原因；鐮刀菌也是百合、草莓、蘋果等植物連作障礙的有害真菌[32-34]。生物熏蒸土壤消毒[35]、微生物菌肥[36]、豆科綠肥[37]、石灰聯(lián)合碳銨熏蒸[38]、輪作[39]等方法可以改變土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)，降低鐮刀菌屬真菌的相對(duì)豐度。這些方法可以作為克服百香果連作障礙的綠色環(huán)保措施。

本試驗(yàn)利用高通量測序方法對(duì)比分析了百香果新種園和連作園根際土壤中微生物多樣性和群落組成結(jié)構(gòu)差異性，發(fā)現(xiàn)連作會(huì)使根際土壤微生物群落發(fā)生改變，根際土壤中致病菌增加，可能進(jìn)而導(dǎo)致植株發(fā)病率增加，產(chǎn)量減少。根際土壤中有益菌數(shù)量下降同時(shí)，病原菌數(shù)量急劇增長，微生物群落結(jié)構(gòu)的改變不利于作物的生長，最終導(dǎo)致種植單一作物出現(xiàn)嚴(yán)重連作障礙。根際土壤菌群結(jié)構(gòu)組成的改變引發(fā)了連作障礙，這一結(jié)果在其他作物上也得到印證。本研究從土壤微生物角度揭示了連作導(dǎo)致百香果發(fā)病率升高，產(chǎn)量降低的因素，為防控百香果連作障礙提供參考。