徐媛媛，胡黨振，南 京，詹 平，姜 玲

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家果樹脫毒種質(zhì)資源室內(nèi)保存中心/華中地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢，430070)

黃龍病Huanglongbing(HLB)是柑桔生產(chǎn)中最具破壞性的病害之一[1]，當(dāng)前黃龍病已蔓延到全世界53個(gè)國(guó)家(https：//www.cabi.org/isc/datasheet/16567)[2]。我國(guó)共有廣東、廣西、福建、浙江、江西、湖南、云南、貴州、海南和四川等10個(gè)省(自治區(qū))300余個(gè)縣發(fā)生黃龍病[3]。據(jù)報(bào)道，美國(guó)佛羅里達(dá)州自2005年感染黃龍病后，近期柑桔產(chǎn)量只有1997年的近1/3[4-5]。引起黃龍病的病原菌為韌皮部桿菌(CandidatusLiberibacter spp.)，其中，亞洲種(CandidatusLiberibacter asiaticus，CLas)是分布范圍最廣、危害面積最大的一個(gè)種。基因組分析表明，CLas為特殊的營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌，無法自主合成組氨酸、色氨酸、硫胺素、苯丙氨酸和酪氨酸，必需從宿主細(xì)胞獲取相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)[6]。CLas缺乏編碼毒素、酶或特殊分泌系統(tǒng)的基因，它通過消耗寄主營(yíng)養(yǎng)生存，從而打破寄主代謝平衡，干擾植物的運(yùn)輸功能，引起淀粉、蔗糖和葡萄糖的積累，導(dǎo)致感病柑桔葉片韌皮部堵塞，進(jìn)而在植株上表現(xiàn)出黃化斑駁癥狀[6-7]。黃龍病是一種系統(tǒng)性的柑桔病害，在柑桔葉、花、果、根系等器官都有癥狀表現(xiàn)。受黃龍病影響的柑桔根系密度銳減，新根生長(zhǎng)受到抑制[8-9]。根據(jù)其昆蟲媒介亞洲柑桔木虱(Citruspsyllid)以葉片汁液為食的特點(diǎn)，人們認(rèn)為黃龍病病原優(yōu)先在葉片定殖和發(fā)病[10]，但有研究發(fā)現(xiàn)病原優(yōu)先定殖于根部，成為“病原庫”，從而使病原的滴度在不同器官、不同季節(jié)表現(xiàn)出差異[11]。胼胝質(zhì)堆積通常被認(rèn)為是植物阻止病原菌擴(kuò)散的第一道防御反應(yīng)[12]，同時(shí)胼胝質(zhì)堆積也造成植物韌皮部運(yùn)輸受到抑制[13]。

在與黃龍病幾十年的抗?fàn)庍^程中，我國(guó)科學(xué)家總結(jié)出了黃龍病“三板斧”綜合防控的措施[3]。其中，莖尖嫁接脫毒是獲得健康苗木傳統(tǒng)且可靠的方法，也是防控黃龍病的重要措施之一[14]。目前，柑桔優(yōu)良品種的無病苗木供不應(yīng)求，急需研究人員改進(jìn)脫除病原的方法，但莖尖脫毒的效果受到莖尖帶病程度的影響，如果先將母本帶病率大幅降低，再實(shí)施微芽嫁接，則對(duì)于提高柑桔的病原脫除效率有極大的幫助。

芽孢桿菌(Bacillus)是土壤和自然界的優(yōu)勢(shì)微生物種群，很多種類都具有抑制植物病害的能力，如：枯草芽孢桿菌(B.subtilies)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)等[15-16]。芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗病能力，通過競(jìng)爭(zhēng)、殺菌、促生等多種方式發(fā)揮作用[17]。有報(bào)道證明，解淀粉芽孢桿菌對(duì)植物病害有拮抗作用，如對(duì)番茄青枯病[18-19]、馬鈴薯晚疫病[20]等。使用混合生物控制劑(Biological Control Agent，BCAs)還可以增加不同環(huán)境下生物控制的穩(wěn)定性[21]。這些事例給黃龍病的控制提供了啟示。部分芽孢桿菌可以誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性(Induction of systemic resistance，ISR)[22]，如：芽孢桿菌B-916可以誘導(dǎo)水稻的抗性[23]。生物控制劑在柑桔生產(chǎn)上的應(yīng)用，未來依然有巨大潛力。

本研究通過復(fù)合芽孢桿菌的持續(xù)應(yīng)用，尋找在柑桔苗木上控制和降低黃龍病病原的方法，達(dá)到降低母本植株病原濃度和提高脫毒效率的目的，并通過對(duì)生理指標(biāo)的分析，結(jié)合顯微觀察，對(duì)復(fù)合芽孢桿菌處理減輕根系褐變進(jìn)行解析，從而闡明復(fù)合芽孢桿菌緩解和控制黃龍病的理論依據(jù)，為解決柑桔無病良種繁育的瓶頸問題提供有效的手段。

1 材料與方法

1.1 菌劑的準(zhǔn)備選用農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的貝萊斯芽孢桿菌TD2-1(B.velezensisiTD2-1)和解淀粉芽孢桿菌TD2-2(B.amyloliquefaciensTD2-2)用于感病柑桔苗木的處理。兩種菌分別進(jìn)行固體發(fā)酵。挑取單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中200 轉(zhuǎn)/min、37 ℃培養(yǎng)，分別取TD2-1和TD2-2培養(yǎng)菌液(OD600nm=1)10 mL，加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基包括1 kg麥麩、1 kg米糠、0.4 kg玉米淀粉、0.2 kg豆粕、20 g紅糖，按照料水比1∶1.1混勻)，30 ℃固體發(fā)酵7 d，每天翻動(dòng)1次。然后，將培養(yǎng)物在60 ℃下干燥，再粉碎為細(xì)粉，檢測(cè)活菌數(shù)在200億個(gè)/g。使用時(shí)，兩種菌劑等量混合均勻，按所需劑量在清水中形成懸濁液，每株用量0.5 L。

1.2 菌劑處理方法南豐蜜桔苗木來源于江西南豐(江西南豐縣果業(yè)局提供)，均為1年生嫁接苗，砧木為枳，種植于大棚內(nèi)，盆栽基質(zhì)包含1/3泥炭、1/3蛭石和1/3腐殖土，2018年9月28日定植。處理組有15株苗木，對(duì)照組有4株苗木。所有苗木管理?xiàng)l件一致。處理組共進(jìn)行了15次復(fù)合菌劑的灌根，從2018年12月12日起在大棚內(nèi)1.6 g/L 2次(間隔時(shí)間為3周)，從2月19日起在大棚外先2.5 g/L 7次(每隔二周處理1次)、后5 g/L 6次(每隔1周處理1次)。對(duì)照為清水處理。最后一次處理后24 h進(jìn)行樣品采集，樣品貯存于-70 ℃，待用。

沙糖桔苗木為1年生苗，砧木為枳，來源于廣西南寧，2018年5月28定植。苗木管理?xiàng)l件一致。處理組共進(jìn)行了23次復(fù)合菌劑的灌根，其中，從2018年12月12日起在大棚內(nèi)1.6 g/L 2次(間隔時(shí)間為3周)，從2月19日起大棚外先2.5 g/L 7次(每隔2周1次)、后5 g/L 14次(每周1次)。對(duì)照為清水處理。

1.3 黃龍病檢測(cè)方法從植株東、南、西和北四個(gè)方位分別采集葉片或枝皮，用液氮速凍碾磨成粉，用CTAB法提取DNA[24]。

使用OI1/OI2c和P400+/P400-兩對(duì)引物用于PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為10 μL，其中，包含上下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL，2×PCR mix(翊圣生物科技有限公司)5 μL，DNA樣品1 μL，ddH2O 3.8 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃變性3 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。用健康的柑桔愈傷組織做負(fù)對(duì)照，分別用pMD18-16S rDNA質(zhì)粒和pMD18T-P400質(zhì)粒做正對(duì)照。采用美國(guó)Bio-Rad PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。

表1 柑桔黃龍病檢測(cè)所用引物的信息

qPCR擴(kuò)增在Corbett RG 6000儀器(德國(guó))上進(jìn)行，內(nèi)參基因?yàn)橹参锛?xì)胞色素氧化酶基因COX[25-26]，目的基因?yàn)楦探埸S龍病亞洲型病原的核糖體蛋白基因rpLJ/rp1L[25]，引物信息見表1。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。qPCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃變性3 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，40個(gè)循環(huán)。計(jì)算公式：ΔΔCt=(CT1目標(biāo)基因-CT1看家基因)-(CT0目標(biāo)基因-CT0看家基因)，mRNA相對(duì)表達(dá)量為2-ΔΔCT[27]。設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以健康愈傷組織為負(fù)對(duì)照。將負(fù)對(duì)照的2-ΔΔCT值設(shè)置為1，若樣品的2-ΔΔCT值大于1，則認(rèn)為樣品為黃龍病疑似病株。

1.4 胼胝質(zhì)含量和防御酶活性的測(cè)定胼胝質(zhì)：2019年11月12日最后一次處理后24 h取樣，取樣部位為苗木中部接穗第3～5片葉。采用植物胼胝質(zhì)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)測(cè)定柑桔葉片中胼胝質(zhì)含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，用多功能酶標(biāo)儀(TECAN)檢測(cè)。

防御酶：2019年11月12日最后一次處理后12 h取樣，取植株早秋梢上基部起第3-4個(gè)葉片，用液氮速凍并于-80 ℃保存。測(cè)定時(shí)準(zhǔn)確稱取0.5 g葉片于預(yù)冷的研缽中，根據(jù)文獻(xiàn)[28-29]進(jìn)行SOD、POD、CAT酶活測(cè)定；硫氧還蛋白還原酶(TrxR)使用北京索萊寶公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，TrxR單位活性以每克樣品每分鐘催化1 μmol DTNB還原為TNB表示。

以上試驗(yàn)處理和對(duì)照設(shè)置3～5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)利用t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 根系掃描電鏡觀察分別取南豐蜜桔處理組和對(duì)照組的根系，2019年11月12日最后一次處理后24 h取樣，用清水洗凈，切割成3～5 mm的小段，轉(zhuǎn)入2.5%戊二醛溶液中固定，經(jīng)磷酸緩沖液漂洗和乙醇梯度脫水，然后將樣品用導(dǎo)電膠粘貼于樣品臺(tái)上，用離子濺射儀將樣品表面鍍膜后放入掃描電鏡(HITACHI SU8010)腔室進(jìn)行觀察。

1.6 根系石蠟切片觀察2019年11月12日在菌劑最后一次處理后24 h取樣，分別取南豐蜜桔處理組和對(duì)照組的須根和根毛制作石蠟切片，切片及染色方法參考植物顯微技術(shù)指導(dǎo)書[30]進(jìn)行。利用德國(guó)Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，用奧林巴斯BX53型生物顯微鏡進(jìn)行切片觀察。

1.7 脂肽類抗生素的RP-HPLC 分析與鑒定將伊枯草菌素A(iturin A)、表面活性素(surfactin)標(biāo)準(zhǔn)樣品(標(biāo)樣)溶于色譜純的無水甲醇配制成1 mg/mL的溶液，置4 ℃冰箱備用。RP-HPLC(反相高效液相色譜)分析系統(tǒng)為Waters分析型高效液相色譜儀，色譜柱為 ZORBAX Eclipse Plus C18(5 μm，4.6 nm×250 nm)。

iturin A的RP-HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為25 ℃；等梯度洗脫，流動(dòng)相A為10 mmol/L乙酸銨，流動(dòng)相B為色譜純乙腈，流動(dòng)相之比為VA∶VB=65∶35；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

surfactin的RP-HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為35 ℃；流動(dòng)相A為色譜純乙腈(含0.1%TFA)，流動(dòng)相B為超純水(含0.1%TFA)，起始流動(dòng)相之比VA∶VB=60∶40，在洗脫前5 min內(nèi)流動(dòng)相之比均速變化為VA∶VB=93∶7，此后流動(dòng)相之比保持不變；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

菌株TD2-2待測(cè)樣品的準(zhǔn)備按文獻(xiàn)付瑞敏[31]方法進(jìn)行。按上述操作進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種芽孢桿菌共處理抑制黃龍病病原的效果試驗(yàn)結(jié)果看出，南豐蜜桔處理組樣品，在菌劑處理前葉脈和枝皮的黃龍病病原陽性率分別為60%和93.33%，綜合陽性率為100%；菌劑處理后葉脈和枝皮的陽性率分別為6.67%和53.33%，綜合陽性率為53.33%，綜合陽性率減少了46.67個(gè)百分點(diǎn)，處理前后的差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)。對(duì)照組樣品，在處理前對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)葉脈和枝皮的黃龍病病原陽性率分別為25%和100%，綜合陽性率為100%；處理后時(shí)間點(diǎn)葉脈和枝皮的陽性率分別為50%和75%，綜合陽性率仍為100%。處理前，處理組與對(duì)照組的綜合陽性率差異無顯著性；處理后，處理組與對(duì)照組的綜合陽性率差異有顯著性(p<0.05)(見表2和表3)。

表2 兩種芽孢桿菌共用處理前南豐蜜桔黃龍病病原檢測(cè)結(jié)果

表3 兩種芽孢桿菌共用處理后南豐蜜桔黃龍病病原檢測(cè)結(jié)果

2.2 兩種芽孢桿菌共處理降低葉片胼胝質(zhì)含量的效果在菌劑處理后，南豐蜜桔處理組和對(duì)照組葉片中胼胝質(zhì)含量分別為0.80和0.98 mg/g，兩者的差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)，相比對(duì)照組，處理組的胼胝質(zhì)含量下降了18.37%(見圖1)。

圖1 兩種芽孢桿菌共處理對(duì) HLB 感病柑橘葉片胼胝質(zhì)含量的影響

2.3 兩種芽孢桿菌共處理對(duì)葉片防御酶活性的影響菌劑處理可以提高葉片SOD活性。在處理12 h后，SOD活性比對(duì)照組提高了23.0%，且在12～24 h一直保持較高活性。菌劑處理后，在0～24 h內(nèi)TrxR活性呈升高趨勢(shì)，在24～48 h一直保持在較高活性水平；在24 h時(shí)，TrxR活性為109.1 U/g，與對(duì)照組(50.9 U/g)的差異達(dá)到顯著水平。菌劑處理后，在36 h內(nèi)CAT活性緩慢升高；在36 h時(shí)達(dá)到最大值[74.4 ΔA240/(min·gFW)]，比對(duì)照組[46.41 ΔA240/(min·gFW)]高了60.3%；在36～48 h內(nèi)，CAT活力又快速下降至44.43 ΔA240/(min·gFW)]。 菌劑處理后，在48 h內(nèi)POD活性一直平穩(wěn)升高；在36 h時(shí)，POD活性[488.2 ΔA470/(min·gFW)]是對(duì)照組[294.0 ΔA470/(min·gFW)]的1.66倍，差異達(dá)顯著水平；在48 h時(shí)，POD活性達(dá)到最大值523.5 ΔA470/(min·gFW)，比對(duì)照組[303.7 ΔA470/(min·gFW)]高了72.4%(見圖2)。

圖2 感染黃龍病的南豐蜜桔經(jīng)兩種芽孢桿菌共處理后葉片防御酶活性的變化

2.4 兩種芽孢桿菌共處理減輕根系褐變的效果試驗(yàn)結(jié)果看出，經(jīng)菌劑處理后，南豐蜜桔處理前苗木(圖3a和3b)，處理后苗木(圖3c和3d)，處理組比對(duì)照組苗木生長(zhǎng)更旺盛；處理組苗木分枝數(shù)多，根系較為發(fā)達(dá)，根系褐變現(xiàn)象輕(圖3e至圖3g)；對(duì)照組苗木生長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較弱，新梢分枝少，新生根系較少，根系褐變現(xiàn)象突出(圖3h至圖3j)。

注：a(處理)和b(對(duì)照)為試驗(yàn)前苗木，c(處理)和d(對(duì)照)為試驗(yàn)后苗木，e—g為試驗(yàn)后處理根系，h—j為試驗(yàn)后對(duì)照根系。

經(jīng)菌劑處理后，沙糖桔處理前苗木(圖4a和4b)和處理后苗木(圖4e和4f)，圖4c和4d分別是圖4a和4b局部根系放大，有褐變現(xiàn)象發(fā)生。沙糖桔處理組苗木生長(zhǎng)更旺盛，根系較為發(fā)達(dá)，須根數(shù)量多，僅有少量褐變根系(見圖4h)；對(duì)照組苗木生長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較弱，頂端有黃化葉片，新生根系較少，根系有木栓化和褐變現(xiàn)象(見圖4g)。

注：a和b為試驗(yàn)前苗木，c和d是前兩者根部放大，均可見到褐色根；e為試驗(yàn)后對(duì)照苗木，f為試驗(yàn)后處理苗木，g為試驗(yàn)后對(duì)照根系(有木栓化和部分根呈褐色)，h為試驗(yàn)后處理根系(根系發(fā)達(dá)，僅有少量木栓化或褐色根系)。

2.5 兩種芽孢桿菌共處理對(duì)根系結(jié)構(gòu)的影響掃描電鏡觀察表明，處理組根系無明顯病癥，根尖粗壯飽滿，根系外表皮細(xì)胞排列緊密，表皮光滑平整(圖5A-a和圖5A-b)，在韌皮部篩管和伴胞中僅有少量的物質(zhì)存在(圖5A-c至圖5A-d)，說明復(fù)合芽孢桿菌處理后，篩管和伴胞細(xì)胞得到輸通。而對(duì)照根系的根尖表皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死，皮層細(xì)胞變形塌陷(圖5A-e)，根系表皮有明顯鱗片狀開裂和脫落現(xiàn)象，表皮細(xì)胞木栓化(圖5A-f和圖5A-g)，韌皮部篩管和伴孢中有大量物質(zhì)的聚積，在木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞中有較多物質(zhì)的聚集(圖5A-h)。

注：電鏡照片：兩種芽孢桿菌共處理材料，a—d為肉眼觀察表現(xiàn)正常的根系，e—h為褐化的根系。石蠟切片：a—d為對(duì)照樣品，a.正常的根系，b.正常的根毛，c.褐化的根系，d.褐變的根毛。e—h為菌劑處理樣品，e.正常的根系，f.正常的根毛，c.褐化的根系，d.褐變的根毛。字母注釋：C為木栓層，E為表皮，En為內(nèi)皮層，Px為初生木質(zhì)部，Pp為初生韌皮部，X為木質(zhì)部，Ca為形成層，P為韌皮部，M為髓部。染色結(jié)果為植物番紅固綠染色結(jié)果：木質(zhì)化的細(xì)胞壁及核呈紅色，薄壁細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)呈綠色。箭頭所指字母表明具體的器官或組織。

在復(fù)合芽孢桿菌處理和對(duì)照材料中，肉眼觀察為正常的根系和根毛，石蠟切片觀察表明其表皮細(xì)胞、皮層、韌皮部、形成層、木質(zhì)部和髓部組織均表現(xiàn)正常(圖5B-a、 b、e 和 f)。在對(duì)照樣品中，褐變的根系表皮和皮層細(xì)胞破裂，皮層細(xì)胞形狀發(fā)生變化，形狀不規(guī)則(圖5B-c)，褐變的根毛部分表皮細(xì)胞木栓化，皮層細(xì)胞排列松散，出現(xiàn)大空洞(圖5B-d)。在復(fù)合芽孢桿菌處理的樣品中，褐變的根系表皮細(xì)胞破裂，表皮細(xì)胞木栓化，皮層細(xì)胞變形(圖5B-g)，根毛表面只有少量表皮細(xì)胞褐化，但皮層、韌皮部、形成層、木質(zhì)部和髓部組織均表現(xiàn)正常(圖5B-h)。因此，復(fù)合芽孢桿菌處理刺激更多的新根產(chǎn)生，保持根毛內(nèi)部結(jié)構(gòu)呈正常狀態(tài)，根毛破壞程度明顯減小。

2.6 菌株TD2-2培養(yǎng)液粗提物的脂肽類抗生素檢測(cè)在相同條件下，對(duì)surfactin標(biāo)樣與樣品(菌株TD2-2培養(yǎng)液粗提物)進(jìn)行RP-HPLC分析的結(jié)果表明，surfactin標(biāo)樣在保留時(shí)間11.549 min、13.274 min、13.741 min和15.511 min處出現(xiàn)特征峰，而TD2-2粗提物樣品在surfactin特征峰出現(xiàn)的保留時(shí)間附近也出現(xiàn)峰，由此推測(cè)TD2-2粗提物樣品中含有surfactin的同系物。在相同條件下，對(duì)iturin A標(biāo)樣和樣品(菌株TD2-2培養(yǎng)液粗提物)進(jìn)行RP-HPLC分析的結(jié)果表明，iturin A標(biāo)樣在保留時(shí)間17.433 min、27.136 min和29.286 min處出現(xiàn)了特異峰，TD2-2粗提物樣品的特征峰不在iturin A標(biāo)準(zhǔn)峰位置出現(xiàn)，說明TD2-2粗提物樣品中可能沒有iturin A，或者iturin A被修飾，位置發(fā)生了偏移；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，TD2-2粗提物樣品的特征峰穩(wěn)定地存在于15 min、23 min、25 min左右，推測(cè)可能有其他次生代謝物存在(見圖6)。

圖6 菌株TD2-2次生代謝物的反相高效液相分析

3 討論

利用貝萊斯芽孢桿菌TD2-1和解淀粉芽孢桿菌TD2-2懸濁液對(duì)南豐蜜桔感病苗木進(jìn)行高強(qiáng)度和持續(xù)的灌根處理，降低了黃龍病病原關(guān)鍵基因在葉脈和枝皮中的表達(dá)量，黃龍病陽性率明顯降低。這項(xiàng)研究對(duì)提高后續(xù)莖尖嫁接脫毒效率有潛在應(yīng)用價(jià)值。

柑桔感染黃龍病后，胼胝質(zhì)在葉脈韌皮部中沉積，并且編碼胼胝質(zhì)沉積的相關(guān)基因上調(diào)[6，11]，導(dǎo)致形成層細(xì)胞增厚和無序化[8]。解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌都具有很好的促生作用，解淀粉芽孢桿菌可以分泌多種植物生長(zhǎng)因子，對(duì)植物產(chǎn)生多種作用[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種芽孢桿菌共處理，葉片中胼胝質(zhì)含量下降，葉脈堵塞現(xiàn)象得到緩解。

提高防御酶的表達(dá)，是植株通過ISR來抵御病原菌的主要方式之一。SOD為動(dòng)植物體內(nèi)抗氧化物保護(hù)酶，在植物抗性反應(yīng)中起重要作用[34]。POD不僅參與植物體內(nèi)次生代謝，同時(shí)參與體內(nèi)過氧化產(chǎn)物的清理。

SOD和POD是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧系統(tǒng)中的重要酶，能有效地阻止O2-和H2O2在植物體內(nèi)積累，防止細(xì)胞受自由基的毒害。PPO為植物體內(nèi)酚類物質(zhì)代謝的參與酶，其氧化產(chǎn)物醌類物質(zhì)對(duì)病原物具有比酚類物質(zhì)更強(qiáng)的毒性，在植物抗病性方面起著重要的作用[28，35]。曲慧[36]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌BP30可以誘導(dǎo)梨果實(shí)中POD和PPO的活力提高，從而增加對(duì)灰霉病的抗性。對(duì)拮抗菌C-02防治棉花黃萎病的研究表明，菌株C-02處理棉苗后，PAL、POD和PPO的活性提高幅度大，提高了棉苗的系統(tǒng)防御能力[29]。本研究通過復(fù)合芽孢桿菌處理感病柑桔苗木，誘導(dǎo)4種防御酶活性的提高，提高了柑桔苗木系統(tǒng)防御能力，減少了根系的褐化。

解淀粉芽孢桿菌分泌的抑菌物質(zhì)豐富，常見的種類分為脂肽物質(zhì)和聚酮類物質(zhì)。如：解淀粉芽孢桿菌SQR9可以合成bacillomycin D(桿菌霉素D)和fengycin(芬薺素)兩種脂肽，對(duì)香蕉枯萎菌有顯著的拮抗作用[32]。在成功應(yīng)用的解淀粉芽孢桿菌FZB42中就發(fā)現(xiàn)了3種聚酮類物質(zhì)——地非西丁、大環(huán)內(nèi)脂和桿菌烯，它們對(duì)細(xì)菌有強(qiáng)烈的抑制活性[37-38]。貝萊斯芽孢桿菌12-51對(duì)棉花黃萎病有拮抗作用[39]。本試驗(yàn)證明，解淀粉芽孢桿菌TD2-2可以產(chǎn)生表面活性素等次生代謝物。TD2-2對(duì)柑桔苗木黃龍病的緩解可能與其產(chǎn)生的表面活性素的殺菌作用密切相關(guān)。