賈良曦，楊柳，丁亞芳，邢維維，馬立才

(北京維德維康生物技術有限公司，北京 100095)

隨著微生物與人類的不斷斗爭，在抗菌藥物的使用過程中無可避免的會有“超級細菌”的出現(xiàn)[1]。所謂的“超級細菌”并不僅僅單指一種細菌的名稱，而是一類幾乎對所有抗生素都有強勁耐藥性的細菌統(tǒng)稱。新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase, NDM) 是一種新型的碳青霉烯酶，于2009年首次從印度新德里一名患者體內(nèi)的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中分離得到[2]。由于該類細菌對包括碳青霉烯類藥物在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物均耐藥，且攜帶耐氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素基因，導致其感染治療十分困難，因此也被稱為“超級細菌”，以其發(fā)現(xiàn)地新德里命名[3]。

Kumarasamy等[4]報道了NDM-1腸桿菌在印度、巴基斯坦以及英國等國家開始流行，引起國際性的關注。隨后，美國、德國、日本、中國香港等地不斷檢出攜帶NDM-1的菌株，多為大腸埃希菌、肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動桿菌等臨床常見的致病菌[5]。2012年中國農(nóng)業(yè)大學研究人員在北京周邊養(yǎng)殖場和屠宰場樣品中檢測到一株攜帶NDM-1的魯氏不動桿菌，這也是中國首次在動物養(yǎng)殖場中發(fā)現(xiàn)。隨后攜帶NDM-4、NDM-5、NDM-9等的菌株陸續(xù)在中國被檢出[6-7]。由此表明NDM基因在動物中傳播具有潛在危險，動物性食品安全向人們敲響警鐘[8]。

目前檢測NDM-1的方法主要有紙片擴散法[9]、Etest檢測法[10]、儀器方法[11]、PCR檢測法[12-13]、TaqMan熒光定量PCR[14-16]、環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[17]、基因芯片技術[18]等。其中，紙片擴散法、Etest檢測法、微量稀釋法靈敏度低，缺乏特異性，僅適合初篩試驗，而PCR可通過特異性引物對NDM-1陽性細菌進行確證，但對儀器設備的要求較高，且操作復雜，易發(fā)生污染。迄今未見有酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測NDM-1的報道。本研究利用表達純化的NDM-1可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠，制備單克隆抗體，通過對該方法的工作條件進行優(yōu)化，建立一種用于檢測細菌中NDM-1耐藥蛋白的雙抗體夾心ELISA方法，以期為NDM-1蛋白ELISA檢測方法的開發(fā)提供一定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原核表達載體 pET-28a、大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α和BL21(DE3)購自寶生物工程(大連)有限公司。大腸桿菌ATCC 25922、大腸桿菌ATCC 35150、鮑曼不動桿菌ATCC 19606、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031、銅綠假單胞菌ATCC 9027由中國農(nóng)業(yè)大學提供。攜帶NDM-1、NDM-4、NDM-5、NDM-9基因的雞源大腸桿菌，由國家獸藥安全評價中心提供。8周齡BALB/c健康雌性小鼠、SP2/0小鼠骨髓瘤細胞由北京維德維康生物技術有限公司提供。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、鎳離子螯合層析柱、卡那霉素、Tris-HCl緩沖液、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)、50%聚乙二醇(PEG)、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、TMB顯色液購自Sigma公司，LB培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購自美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 NDM-1重組蛋白的表達與純化

從GenBank中獲取NDM-1基因的氨基酸序列(Accession:AFI72857.1)，依據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性進行NDM-1基因的堿基序列的密碼子優(yōu)化，并委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成了優(yōu)化后的基因序列。采用PCR方法擴增NDM-1(G29-R270)，引入酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(表1)，為便于蛋白的純化，同時設計了His Tag標簽和TEV酶切位點。將NDM-1(G29-R270)片段克隆至質粒載體pET-28a中，然后通過化學轉化將重組質粒，轉至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，通過含有50 μg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板篩選陽性單克隆，并進行測序確認。

表1 擴增NDM-1基因的引物序列

將重組NDM-1(G29-R270)陽性質粒轉入感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，挑選陽性克隆菌株，接種至含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，分別在15 ℃條件下誘導16 h 和37 ℃條件下誘導4 h[7]。4 ℃條件下，3 200g離心15 min收集菌體，使用20 mmol/L Tris-HCl(含150 mmol/L NaCl)重懸菌體，3 000 W，10 s/10 s，15 min超聲裂解菌體。采用Ni-NTA鎳柱親和層析分離，收集目的蛋白，并進行SDS-PAGE和Western blot檢測表達及純化結果，獲得NDM-1(G29-R270)蛋白。

1.3 單克隆抗體制備

1.3.1 小鼠免疫與細胞融合

按照表2所示免疫程序，使用已獲得的NDM-1(G29-R270)蛋白免疫4只8周齡雌性BALB/c小鼠，四免1周后，對小鼠眼眶采血，室溫放置2 h，4 000 r/min離心10 min后采用間接ELISA方法對取血清檢測[19]。末次免疫后，將免疫小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)混合，用50%PEG進行細胞融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細胞，于96孔培養(yǎng)板中，37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后用HAT培養(yǎng)基半換液，9 d后進行全換液。

表2 單克隆抗體(小鼠)的免疫程序

1.3.2 雜交瘤細胞株篩選

待細胞長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，吸出雜交瘤細胞上清液，使用間接ELISA方法篩選陽性細胞。并用NDM-1陽性大腸桿菌和肺炎克雷伯菌裂解液包被的酶標板再次篩選，陰性對照為SP2/0細胞培養(yǎng)上清。前后共進行3次亞克隆，以得到能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株[20]。

1.3.3 腹水制備及純化

選取健康的BALB/c經(jīng)產(chǎn)小鼠4只，腹腔內(nèi)注射無菌石蠟油(0.5 mL/只)。10～14 d后即可接種雜交瘤細胞，預處理過的小鼠2月內(nèi)均可使用。收集生長良好的雜交瘤細胞，1 000 r/min離心10 min，棄去上清。重懸于DMEM培養(yǎng)液中將細胞數(shù)調至0.5×106個/mL～1×106個/mL，每只小鼠腹腔注射0.5 mL細胞懸液。次日觀察有無小鼠死亡情況，7 d后觀察小鼠腹部可否采集腹水，待小鼠腹部明顯膨大，消毒腹部皮膚后，用5 mL注射器接8號針頭刺入腹腔，收集腹水，每隔1 d抽取1次，一般可抽取3～5次。5 000 r/min離心10 min，收集淡黃色上清，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?，約一周后收集腹水進行分離純化。

純化：取5 mL離心后的腹水用50%硫酸銨沉淀，10 000 r/min離心30 min，取上清，用45%硫酸銨再次沉淀，4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，沉淀溶于等體積PBS(0.01 mol/L pH 值7.4)中，4 ℃冰箱中透析2 d，每天換2次透析液；4 000 r/min離心10 min，收集上清。測量抗體濃度后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品制備

挑取待檢測的單克隆菌落于4 mL BHI肉湯培養(yǎng)基中，將其置于37 ℃搖床中，100 r/min培養(yǎng)約2～4 h，4 ℃條件下，4 000 r/min離心5 min收集菌體，然后使用1 mL 20 mmol/L Tris-HCl(含150 mmol/L NaCl)重懸菌體，通過超聲裂解菌體(3 000 W，10 s/10 s，15 min)，作為待測樣品備用。

1.5 雙抗體夾心ELISA方法的建立

選擇合適的包被條件稀釋純化后的捕獲抗體至合適濃度，每孔加入100 μL進行包被；次日，棄去孔內(nèi)溶液，用PBST(0.01 mol/L PBS，0.1%Tween-20，pH=7.4)洗板3次，每次3 min；每孔加封閉液100 μL，37 ℃溫育2 h，封閉結束后，棄去孔內(nèi)溶液，用PBST洗板3次，甩干；在酶標板孔內(nèi)加入待測樣品，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌3次，甩干；加入最適濃度HRP標記的檢測抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，甩干；加入臨時配制的TMB溶液，每孔100 μL；37 ℃孵育10 min，加入終止液(2 mol/L H2SO4)50 μL/孔；用酶標儀檢測OD450，計算樣品孔與陰性孔的比值(P/N)，以P/N大于2.1作為陽性判定標準。

1.6 捕獲抗體和檢測抗體的確定

將獲得的單克隆抗體分別作為捕獲抗體和檢測抗體，其余步驟按照雙抗體夾心ELISA步驟進行操作，測定其P/N的值，根據(jù)P/N的值確定捕獲抗體和檢測抗體。

1.7 包被抗體和酶標檢測抗體濃度的篩選

采用棋盤滴定法測定，將包被抗體分別按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000稀釋包被，HRP標記的檢測抗體分別按1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000稀釋，按雙抗體夾心ELISA方法進行檢測，選擇P/N值最大時的濃度作包被抗體和檢測抗體的最佳使用濃度。

1.8 包被條件的篩選

分別用含0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH值9.6)、0.015 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)、0.01 mol/L的Tris-HCl溶液(pH值8.0)和0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH值7.4，含0.15 mol/L NaCl)作為包被液，分別置于37 ℃孵育1 h、2 h及4 ℃孵育過夜，然后按照雙抗體夾心ELISA方法進行檢測，計算P/N值，確定在該方法中所需最適的包被液以及包被時間。

1.9 靈敏度的判斷

將NDM-1陽性及陰性的大腸桿菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌活化后，接種于腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar，BHIA)培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落于BHI肉湯培養(yǎng)基中，置于搖床100 r/min，37 ℃培養(yǎng)24 h。將菌液按1%擴大培養(yǎng)至100 mL，搖床100 r/min，37 ℃培養(yǎng)12 h。取少量對數(shù)生長期的菌液進行平板計數(shù)，剩余菌液3 000 r/min離心10 min，收集細菌沉淀。

將NDM-1陽性的大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌分別用滅菌的PBS緩沖液以10倍梯度稀釋至108、107、106、105和104CFU/mL，利用優(yōu)化后的雙抗體夾心ELISA方法對每個稀釋梯度進行檢測，測定該檢測方法的最低菌落數(shù)的檢出量，以判定該方法的敏感性。

1.9.1 特異性驗證

采用建立的雙抗體夾心ELISA方法進行檢測。分別將攜帶NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9的陽性對照菌和大腸桿菌ATCC 25922，大腸桿菌ATCC35150，鮑曼不動桿菌ATCC 19606，肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031，銅綠假單胞菌ATCC 9027等配制成108CFU/mL同時設置陰性對照，每個樣品重復3個孔，以檢測其特異性。

1.9.2 重復性評價

板內(nèi)重復性試驗：在同一塊板內(nèi)同時檢測陽性、陰性等共5份耐藥菌菌數(shù)含量不同的樣品，每份樣品，重復5孔，按照雙抗體夾心ELISA進行測定，計算同一份樣品的OD450值的變異系數(shù)(CV)以檢驗板內(nèi)檢測樣品的重復性。

板間重復性試驗：取5塊用NDM-1抗體包被好的酶標板在相同條件下，檢測5份不同耐藥菌菌數(shù)含量不同的樣品，按照雙抗體夾心ELISA方法進行測定，計算同一份樣品在不同板間的OD450值的CV，以檢驗板間檢測樣品的重復性。

2 結果與分析

2.1 NDM-1蛋白的純化和鑒定

NDM-1表達質粒pET28a(+)-NDM-1經(jīng)誘導表達后進行鎳柱親和層析純化，結果顯示：在相對分子質量約54.6 kDa的區(qū)域出現(xiàn)明顯表達的蛋白條帶，該條帶與預期融合蛋白分子量大小一致，并且純度較高，而含有pET28a(+)-NDM-1的未誘導對照組和在15 ℃條件下誘導16 h的對照組，在相應位置均未出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶(圖1)，說明pET28a(+)-NDM-1表達成功，在非變性條件下，利用鎳柱親和層析柱對細胞裂解液上清中NDM-1蛋白進行純化。SDS-PAGE結果表明，獲得純化NDM-1蛋白(圖1)。

M1.蛋白Marker；M2.Western blot Marker；PC1.BSA (1 μg)；PC2.BSA (2 μg)；NC.未經(jīng)誘導的細胞裂解液；1. 15 ℃誘導16 h的細胞裂解液；2. 37 ℃誘導4 h的細胞裂解液；NC1.未經(jīng)誘導的細胞裂解上清；NC2.未經(jīng)誘導的細胞裂解沉淀；3. 15 ℃誘導16 h的細胞裂解液上清；4. 15 ℃誘導16 h的細胞裂解液沉淀；5. 37 ℃誘導4 h的細胞裂解液上清；6. 37 ℃誘導4 h的細胞裂解液沉淀圖1 SDS-PAGE(A)和Western blot(B, GST標簽抗體)檢測結果

2.2 抗血清效價的篩選

表3顯示，1號小鼠和2號小鼠血清效價均為1∶1 600時，3號小鼠血清效價為1∶12 800，4號小鼠血清效價為1∶25 600，對于后續(xù)生產(chǎn)陽性對照血清來說，滿足1∶3 200即可，因此選擇3號小鼠用于后續(xù)細胞融合。

表3 免疫BALB/c小鼠抗體效價ELISA檢測結果

2.3 單克隆抗體雜交瘤細胞株篩選

使用間接ELISA方法篩選出的陽性雜交瘤細胞，經(jīng)3次亞克隆后，當細胞融合率達到100%時可以建株。最終篩選到2株能穩(wěn)定分泌NDM-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為3H5和4G1，結果見表4。

表4 雜交瘤培養(yǎng)上清檢測結果

2.4 抗體配對的篩選

采用3H5和4G1 2株單抗分別作為捕獲抗體和檢測抗體，當抗體不同稀釋度OD450值和陰性對照OD450值的比值(P/N)越大，靈敏度越高，效果越好。結果表明，當3H5作為捕獲抗體，4G1作為檢測抗體，抗體稀釋濃度分別為1∶2 000和1∶8 000時，P/N的比值最高，為31.850(表5)。當4G1作為捕獲抗體，3H5作為檢測抗體時，抗體稀釋濃度分別為1∶4 000和1∶32 000，此時P/N的比值最高，為10.650(表6)。因此，選擇3H5作為捕獲抗體，4G1作為檢測抗體時效果最優(yōu)。

表5 3H5為捕獲抗體的測定結果

表6 4G1為捕獲抗體的測定結果

2.5 包被抗體和檢測抗體工作濃度的確定

如表7所示，經(jīng)方陣法檢測，隨著包被抗體3H5濃度的降低和檢測抗體4G1稀釋倍數(shù)的增大，其OD450值不斷變小。當3H5包被濃度為1∶2 000、4G1的稀釋濃度為1∶5 000時，P/N值達到最大，所以選擇1∶2 000和1∶5 000作為包被抗體3H5和檢測抗體4G1的最佳稀釋濃度。

表7 包被抗體(3H5)與檢測抗體(4G1)最佳工作濃度的確定

2.6 包被條件的確定

通過建立雙抗體夾心ELISA方法對包被條件進行優(yōu)化，根據(jù)P/N的值確定最佳包被時間和稀釋液。結果如表8所示，0.05 mol/L，pH值9.6碳酸鹽緩沖液作為抗原包被液，4 ℃孵育過夜時，包被條件最好，且P/N值最大，因此選擇0.05 mol/L，pH值9.6碳酸鹽緩沖液，4 ℃孵育過夜作為最佳包被條件。

表8 包被條件的確定

2.7 雙抗體夾心ELISA方法的靈敏度

將帶有NDM-1的陽性樣品進行10倍梯度稀釋，用建立的雙抗體夾心ELISA方法進行檢測，結果見9。隨著樣品中NDM-1含量的升高，OD450值逐漸升高。以測定孔與陰性對照孔OD450值之比大于2.1為陽性判定標準，當大腸桿菌、肺炎克雷伯菌中耐藥菌菌液濃度降低到105CFU/mL以下，P/N值就小于2.1；當鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌中菌液濃度降低到106CFU/mL以下，P/N值就小于2.1。因此得出該方法對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌檢出測限為105CFU/mL，對鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌檢測限為106CFU/mL。

表9 雙抗體夾心ELISA檢測的靈敏度

2.8 特異性驗證

分別選大腸桿菌ATCC 25922，大腸桿菌ATCC 35150，肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031，鮑曼不動桿菌ATCC 19606，銅綠假單胞菌ATCC 9027、陰性對照菌以及NDM-1、NDM-4、NDM-5、NDM-9陽性對照菌，按照雙抗體夾心ELISA方法做交叉反應試驗，結果見表10。該方法中NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9等4種陽性對照菌有明顯的交叉，這是因為幾種亞型與NDM-1氨基酸差異小，所以會出現(xiàn)交叉反應，但與大腸桿菌ATCC 25922、大腸桿菌ATCC 35150、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031、鮑曼不動桿菌ATCC 19606和銅綠假單胞菌ATCC 9027沒有交叉反應，說明本研究所建立的方法具有良好的特異性。

表10 特異性檢測

2.9 重復性評價

2.9.1 板內(nèi)重復性試驗

在同一塊板內(nèi)同時檢測陽性、陰性等共5份耐藥菌，樣品的含菌數(shù)量不同，每份樣品，重復5孔，按照試劑盒的操作程序，進行測定，計算同一份樣品OD450值的變異系數(shù)，以檢驗板內(nèi)檢測樣品的重復性。由表11可以看出其中OD450值變異系數(shù)均小于6%。具有良好的板內(nèi)重復性。

表11 板內(nèi)重復性試驗

2.9.2 板間重復性試驗

取5塊用NDM-1抗體包被好的酶標板，在相同條件下檢測5份不同耐藥菌，樣品含菌數(shù)量不同，按照試劑盒的操作程序，進行測定，計算同一份樣品在不同板間的OD450值的變異系數(shù)，以檢驗板間檢測樣品的重復性。由表12可以看出板內(nèi)檢測的5份樣品的OD450值變異系數(shù)均小于10%。說明板間檢測樣品的重復性好。

表12 板間重復性試驗

3 討論

現(xiàn)在國內(nèi)外NDM-1細菌的報道越來越多，甚至已在全球范圍流行并引發(fā)多種類型的感染，不僅可直接威脅人類健康，還可通過動物性食品對人類健康造成嚴重的威脅[21-22]。國內(nèi)外許多學者針對NDM-1基因研究建立了普通PCR、熒光定量PCR等快速檢測方法，對于雙抗體夾心ELISA方法檢測NDM-1研究報道甚少。本研究采用化學合成的方法獲得優(yōu)化后的NDM-1蛋白基因序列，并將其克隆至表達載體pET-28a，得到重組質粒pET-28a-NDM-1(G29-R270)，并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達并純化。通過免疫BALB/c小鼠，獲得了2株雜交瘤細胞株，分別命名為3H5和4G1，分別用作捕獲抗體和檢測抗體，建立雙抗體夾心ELISA方法。

雙抗體夾心ELISA方法是一個多成分系統(tǒng)，每個成分都會對試驗結果造成影響，針對捕獲抗體和檢測抗體，濃度過高易造成蛋白分子多層化，容易將蛋白洗掉造成浪費，而且容易造成試驗的非特異性；濃度過低易造成假陰性。包被條件對結果影響很大，若溫度過低則需要延長反應時間，溫度高則應減少反應時間[23]，因此本研究選擇4 ℃包被過夜，捕獲抗體和檢測抗體的稀釋度分別選擇1∶2 000和1∶5 000。

研究發(fā)現(xiàn)，攜帶NDM-1基因的細菌主要有大腸桿菌、不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等[24-25]。因此，本試驗檢測了上述幾種耐藥菌中NDM-1耐藥蛋白的靈敏度和特異性，結果顯示，NDM-1陽性大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌的最低濃度為1×105CFU/mL，NDM-1陽性鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的最低濃度為1×106CFU/mL。應用該方法檢測NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9，與4種陽性對照有明顯的交叉，但與大腸桿菌ATCC 25922、大腸桿菌ATCC 35150、鮑曼不動桿菌ATCC 19606、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031和銅綠假單胞菌ATCC 9027均無交叉反應，說明此方法具有良好的特異性；對本方法進行了重復性試驗，得到板內(nèi)變異系數(shù)小于6%，板間變異系數(shù)小于10%，說明本方法具有良好的重復性。