鐘明志,陳 歡,姜媛媛,楊瑞武,張 利*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，四川 雅安 625000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625000)

植物在生長發(fā)育過程中，由于自身防御手段有限及外界環(huán)境的影響，往往會受到病原菌的侵染，導(dǎo)致植物生長發(fā)育過程受阻[1].特別是一些經(jīng)濟(jì)作物，受病害影響導(dǎo)致產(chǎn)量下降、質(zhì)量降低，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益.在植物與病原菌長期相互作用的過程中，植物自身逐漸形成了以生理生化反應(yīng)為主要手段抵御病原菌侵染的防御機(jī)制[2].植物體內(nèi)存在的一些防御酶均與植物抗病性密切相關(guān)，如超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化氫酶(CAT)等[3].

芍藥(PaeonialactifloraPall.)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(PaeoniaL.)，是多年生宿根草本植物[4].以干燥根入藥，具有平抑肝陽、柔肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗等功效[5].灰霉病和葉霉病是致植物壞死病原菌[6]，擁有廣譜的寄生對象，易侵襲老、傷或衰弱的植物[7].芍藥生長周期較長，抗逆性較差，干旱和水澇等易導(dǎo)致芍藥植株枯萎衰敗直至死亡；此外，在生長過程中還易受到灰霉病和葉霉病病原菌的侵染，導(dǎo)致其發(fā)育受到影響，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益.Gastón等[8]在智利南部7個地點采集芍藥灰霉病病葉，從中分別分離到了灰霉病菌(Botrytiscinerea)、芍藥芽孢桿菌(Botrytispaeoniae)和葡萄孢霉菌(Botrytispseudocinerea)，在溫室接種試驗中發(fā)現(xiàn)3種病原菌都能對芍藥造成損害.Zhao等[9]采集了2個對灰霉病抗性有顯著性差異的芍藥品種“紫峰玉”和“大富貴”，進(jìn)行了sRNA測序，鑒定出了4個miRNA可能參與芍藥對灰霉病的應(yīng)答，為芍藥抗灰霉病的分子機(jī)制提供依據(jù).芍藥葉霉病最早經(jīng)藍(lán)瑩等[10]鑒定病原為芍藥枝孢霉(CladospriumpaeoniaePass.)，主要危害芍藥的葉和莖，導(dǎo)致芍藥葉片或莖表面生成暗紫紅色小斑點，最終導(dǎo)致植株枯焦甚至死亡，嚴(yán)重影響芍藥的經(jīng)濟(jì)價值.李麗等[11]利用rDNA-ITS以及形態(tài)學(xué)鑒定手段對芍藥葉霉病病原菌進(jìn)行鑒定，確定山東省芍藥葉霉病是由鏈格孢(Alternaria alternata)和細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)兩種病原菌引起的復(fù)合侵染，為芍藥葉霉病的防治提供了理論基礎(chǔ).

針對灰霉病和葉霉病對芍藥生長發(fā)育帶來的不利影響，課題組經(jīng)專題調(diào)研、種質(zhì)資源收集與評價，對白花川芍藥等4個品系藥用芍藥分別進(jìn)行灰霉病和葉霉病病原菌接種，觀察接種后葉片發(fā)病情況及其生理生化指標(biāo)變化，比較不同品系藥用芍藥在抗病方面的差異.本研究旨在評價紅花川芍藥和白花川芍藥的抗病差異，為川芍藥抗病育種的深入研究和新品種選育提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用芍藥包含4個品系，分別由本課題組2008年在四川省中江縣自主選育“紅花川芍藥”(CSY-H)品系和“白花川芍藥”(CSY-B)品系；引種至中江縣的“杭芍藥”(HSY)和“亳芍藥”(BSY)，分別來自浙江磐安和安徽亳州，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊瑞武教授鑒定為芍藥科芍藥屬(PaeonialactifloraPall.)“杭芍藥”和“亳芍藥”.

1.2 試驗方法

1.2.1 栽培方法 采用盆栽育苗的方式，選用下底直徑18 cm、上口直徑25 cm、高27.5 cm的盆栽盆，在盆底鋪設(shè)砂礫，每盆裝載土壤約3 kg，并于底部裝入適合的接水盤.將芍頭分切至大小均勻的3個芽頭，于2017年12月13日在盆中種植芍頭，次年葉片展開時接種灰霉病和葉霉病病原菌.

1.2.2 抗病性鑒定 在中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買編號分別為cfcc87910和cfcc86571的芍藥枝孢霉(CladospriumpaeoniaePass.)和灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)菌株，并接種在PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng).

借鑒鄧立寶等[12]和李喜玲等[13]的方法，用打孔器將培養(yǎng)的灰葡萄孢菌打成直徑4 mm的菌餅，菌絲一面貼在芍藥葉片傷口處，用濕潤的脫脂棉固定，套袋保濕3 d，分別于接種前(第0 d)及接種后5,10,20,30 d時采集芍藥葉片，觀察各品系芍藥葉片發(fā)病情況.采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[14]測定SOD活性,采用愈創(chuàng)木酚法[14]測定POD酶活性,采用高錳酸鉀滴定法[14]測定CAT活性,參考李忠光等[15]的方法測定PPO活性,參考Tovar等[16]的方法測定PAL活性,采用硫代巴比妥酸法[17]測定MDA含量.

參考石顏通等[18]、李樹德[19]的分級標(biāo)準(zhǔn)評定芍藥葉片灰霉病病斑等級(表1)，并計算病情指數(shù):

表1 芍藥灰霉病葉部病斑分級標(biāo)準(zhǔn)

參考楊德翠[20]的方法，用毛刷將PDA培養(yǎng)基上芍藥枝孢霉的病原孢子刷下，用無菌水配成3.5×106個·mL-1的孢子懸浮液，將孢子懸浮液噴于芍藥葉片的正反面，直至滴水為止，套袋保濕3 d，分別在接種前(第0 d)以及接種后5,10,15,20,30 d時采集各品系芍藥葉片，測定葉片的SOD,POD,CAT,PPO,PAL活性和MDA含量，觀察各品系芍藥葉片發(fā)病情況，并參考楊德翠[20]、李樹德[19]的分級標(biāo)準(zhǔn)評定芍藥葉霉病葉部病斑等級(表2)，計算病情指數(shù):

表2 芍藥葉霉病葉部病斑分級標(biāo)準(zhǔn)

各品系芍藥在感染葉霉病和灰霉病的第30 d，根據(jù)病情指數(shù)進(jìn)行抗性水平評價(表3)[18].

表3 芍藥灰霉病和葉霉病的抗性水平分類

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 22.0進(jìn)行顯著性分析和方差分析，Origin 9.1進(jìn)行繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品系芍藥葉片灰霉病和葉霉病發(fā)生程度

如圖1和圖2所示，在感染灰霉病、葉霉病30 d后，各品系芍藥葉片都出現(xiàn)一定的受損和病斑，HSY葉片受損程度及病斑數(shù)量和大小均顯著高于其他品系.而BSY受灰霉病和葉霉病影響最小，其次是CSY-H和CSY-B.

圖1 接菌30 d后不同品系芍藥葉片灰霉病發(fā)生程度

圖2 接菌30 d后不同品系芍藥葉片葉霉病發(fā)生程度

2.2 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片生理特性的影響

2.2.1 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響 如圖3所示，隨著感染灰霉病天數(shù)增加，4個品系芍藥的SOD活性、 CAT活性以及HSY和BSY的POD活性均呈先上升后下降趨勢；感染葉霉病芍藥的SOD和POD活性基本呈上升趨勢，CAT活性先上升后下降.

在灰霉病感染下第10 d時，HSY的SOD和POD活性以及BSY與CSY-H的CAT活性均達(dá)到峰值，隨后開始下降.在第30 d時，CSY-H和CSY-B的POD活性達(dá)到最大值，BSY,CSY-B和CSY-H的CAT活性下降到接種前水平，而HSY的CAT活性顯著低于接種前(P<0.05).

在接種葉霉病第5～30 d期間，BSY的SOD活性都高于其他品系芍藥，在第10～30 d期間，各品系芍藥POD活性均顯著增加(P<0.05)，在第20 d時CSY-H和CSY-B的CAT活性達(dá)到峰值，在第30 d時，4個品系芍藥的POD活性都達(dá)到最大值；整體來說BSY的SOD和POD活性上升幅度更大，且保持了較好的活性.

圖3 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片SOD、POD和CAT活性的影響

2.2.2 灰霉病和葉霉病對芍藥防御酶系統(tǒng)的影響 如圖4所示，感染灰霉病后，CSY-B和CSY-H的PPO活性和PAL活性、HSY的PPO活性以及BSY的PAL活性均呈先上升后下降趨勢；HSY的PAL活性則呈先上升后下降再上升趨勢，BSY的PPO活性呈持續(xù)上升趨勢.在接種灰霉病前，BSY的PPO活性顯著低于其他3個品系芍藥(P<0.05)，感染第5～20 d時，4個品系芍藥的PPO活性都顯著上升，其中CSY-B和CSY-H的上升速率高于HSY.接種20 d后4個品系芍藥PAL活性均達(dá)最大值，BSY的PAL活性提升程度高于其他3個品系芍藥.

接種葉霉病后，HSY,BSY和CSY-B的PPO活性先增高后下降再增高，CSY-H的PPO,PAL以及CSY-B的PAL逐漸增加，HSY和BSY的PAL活性先升高后降低.CSY-B的PPO活性和PAL活性以及BSY的PPO活性在染病第10 d時達(dá)到第一個峰值，隨后下降又上升.在第20 d時，BSY和CSY-H的PAL活性達(dá)到最大值，30 d時下降到感病前水平，CSY-H的PPO活性在30 d時達(dá)到最大值.

圖4 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片PPO和PAL活性的影響

2.2.3 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片MDA含量的影響 如圖5所示，在感染灰霉病時，4個品系的芍藥MDA含量均表現(xiàn)出先上升后下降趨勢.在第20 d時達(dá)到峰值，且CSY-B,CSY-H以及HSY的MDA含量顯著高于BSY(P<0.05).第30 d時，各品系芍藥MDA含量開始顯著下降(P<0.05)，且CSY-B的MDA含量顯著高于BSY和CSY-H(P<0.05)，與HSY之間差異不顯著(P>0.05).在感染葉霉病后，HSY,BSY和CSY-B的MDA含量整體呈上升趨勢，而CSY-H的MDA含量先增高后降低.第30 d時，CSY-B,HSY和BSY的MDA含量達(dá)到峰值.CSY-H在第5 d時MDA含量達(dá)到了最大值，總體來說BSY的MDA含量增加最少.

圖5 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片丙二醛含量影響

2.3 不同品系芍藥對灰霉病和葉霉病的抗性水平

由表4和表5可以看出，隨著感病時間的延長，各品系芍藥灰霉病和葉霉病病情均不斷加重.在感染灰霉病的情況下，HSY病情發(fā)展最快，其次是CSY-B和CSY-H，最后是BSY.在染病的各個時期，BSY和CSY-H病情指數(shù)都顯著低于HSY和CSY-B.接種灰霉病第30 d時，發(fā)現(xiàn)HSY表現(xiàn)為中感，BSY，CSY-B和CSY-H均表現(xiàn)為中抗.

在接種葉霉病第5 d時，發(fā)現(xiàn)HSY染病率和感病程度顯著低于CSY-H和CSY-B，但隨后其病情指數(shù)開始不斷上升，且病情發(fā)展最快.BSY染病最晚，病情發(fā)展最慢，其病情指數(shù)在各時期均顯著低于其他芍藥.在接種前期，CSY-H和CSY-B染病最早，病情指數(shù)顯著高于BSY和HSY，隨后兩者病情發(fā)展緩慢.根據(jù)接種葉霉病第30 d時的病情指數(shù)，HSY表現(xiàn)為高感，BSY為中抗，CSY-B和CSY-H均為中感.整體上看，BSY對灰霉病和葉霉病抗性最強(qiáng)，其次是CSY-H和CSY-B，HSY對灰霉病和葉霉病的抗性最弱.

表4 不同品系芍藥灰霉病病情發(fā)展及抗性水平

表5 不同品系芍藥葉霉病病情發(fā)展及抗性水平

3 討論

大量研究表明，病原菌侵染植物后，植株體內(nèi)會產(chǎn)生過量的活性氧物質(zhì)，從而影響自身正常的生理活動，這時保護(hù)酶系統(tǒng)則起到了清除活性氧自由基及過氧化物的作用[21].本研究發(fā)現(xiàn)，各品系芍藥在感染灰霉病后，其SOD,POD和CAT活性發(fā)生了先增高后降低的變化，說明在灰霉病感染前期，病原菌復(fù)制數(shù)量較低，各品系芍藥抗性均較強(qiáng)，芍藥處于防御應(yīng)激階段，抗氧化酶活性較為活躍.而隨著病原菌入侵時間增加，各品系芍藥抗氧化酶活性開始緩慢下降，說明病原菌復(fù)制數(shù)量增多，在植物細(xì)胞局部位置積累，進(jìn)而使得芍藥體內(nèi)代謝過程紊亂，生物膜功能受到不利影響，從而抑制了芍藥體內(nèi)抗氧化酶活性[22].

在長期自然選擇和人為選育的干預(yù)下，抗病品種抗氧化酶的活性和合成效率往往高于感病品種[23].本研究中，BSY無論在感染灰霉病還是葉霉病的情況下，其抗氧化酶活性在達(dá)到峰值時的增加幅度都高于其他品系，且下降速度較慢.楊翠徳[20]在研究牡丹感染紅斑病后抗氧化酶活性變化的過程中，發(fā)現(xiàn)抗病性較強(qiáng)的“魯菏紅” SOD,POD和CAT活性的上升幅度大于易感病的“趙粉”.張成玲等[24]曾利用鐮刀菌侵染不同品種甘薯，最終發(fā)現(xiàn)SOD,POD和CAT酶活性增加率高低與甘薯品種的抗性呈正相關(guān).

多數(shù)植物都存在抵御病原菌侵染的酶，如PPO可以促進(jìn)醌類化合物生成，對病原菌起到毒害作用，以此來抑制病原菌的侵染[25]，PAL參與苯丙烷的代謝，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)[26].在本研究中，各品系芍藥接種葉霉病和灰霉病后PPO和PAL活性都顯著高于對照組，且抗病性最強(qiáng)的BSY接種灰霉病后PPO和PAL活性增幅最大.陳夕軍等[27]在研究黃瓜感染白粉病后其防御酶活性變化的過程中發(fā)現(xiàn)，抗性品種接種后PPO活性迅速上升，而感病品種防御活性酶的上升幅度緩慢.王生榮等[28]曾說明，植物在抵御病原菌入侵的過程中，其PAL活性會增強(qiáng)，抗病品種體內(nèi)的PAL活性相對感病品種上升幅度更大，活性持續(xù)時間更長，積累更多抗菌物質(zhì).

大量研究表明，植物受到病原菌入侵后，代謝過程會紊亂，MDA會在植物中積累，而過量的MDA含量會導(dǎo)致感染病原菌細(xì)胞的膜系統(tǒng)受到損害[29].因此，MDA含量是病原菌入侵程度的間接反映.本研究中，各品系芍藥在灰霉病和葉霉病的感染前期MDA含量開始積累，但由于芍藥體內(nèi)清除活性氧的SOD和POD活性也顯著增強(qiáng)，二者協(xié)同作用使得MDA含量在感染的后期開始下降.灰霉病和葉霉病抗性更強(qiáng)的BSY，其MDA含量低于其他品系.李捷[30]研究也發(fā)現(xiàn)，枸杞感染根腐病后，抗病品種MDA含量的凈增加值顯著低于感病品種.

系統(tǒng)選育抗病性強(qiáng)的藥用植物品種能夠減輕藥材在生長發(fā)育過程中受病原菌影響程度，增加最終產(chǎn)量和藥用成分質(zhì)量，從而增加該藥材產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益.新品種的選育是一個長期復(fù)雜的過程，而要選育出抗病性較強(qiáng)的優(yōu)良品種則需要在選育過程中進(jìn)行抗病性鑒定和研究.對選育對象直接接種病原菌則是檢驗選育對象抗病性強(qiáng)弱的有效手段.張恩慧[31]等采用苗期室內(nèi)人工接種鑒定和田間自然誘發(fā)鑒定相結(jié)合的方法將TuMV、黑腐病、CMV病原體分別接種于不同品種的甘藍(lán)中，并篩選出了2種抗病性較強(qiáng)的甘藍(lán)材料.陳夕軍[32]等利用5個水稻品種“Lemont”、“武育粳3號”、“Jasmine85”、“C418”和“YSBR1”分別于溫室苗期接種30個不同的水稻紋枯病菌株，發(fā)現(xiàn)各品種抗病性和不同菌株致病力均存在極顯著差異，證明5個水稻品種均可作為抗水稻紋枯病鑒定材料.本研究中，接種灰霉病和葉霉病后，BSY，CSY-B和CSY-H表現(xiàn)出的抗病性均強(qiáng)于HSY，且都對灰霉病表現(xiàn)為中抗，而川產(chǎn)道地藥材CSY-H和CSY-B藥用品質(zhì)優(yōu)良、產(chǎn)量高，且目前對川芍藥的抗病研究較少[33].因此，CSY-B和CSY-H均可作為進(jìn)行系統(tǒng)選育的優(yōu)良抗病候選品系，對于后續(xù)川芍藥抗病育種的深入研究具有重要意義.

4 結(jié)論

本研究通過鑒定CSY-B，CSY-H，HSY，BSY對灰霉病和葉霉病抗性差異，初步明確BSY的抗性最強(qiáng)，對灰霉病和葉霉病均表現(xiàn)為中抗；其次是CSY-B和CSY-H，對灰霉病表現(xiàn)為中抗；HSY抗病性最弱，分別對灰霉病和葉霉病表現(xiàn)為中感和高感.由于CSY-B和CSY-H藥用品質(zhì)較高且研究較少，認(rèn)為CSY-B和CSY-H均可作為抗病育種研究和新品種推廣應(yīng)用的候選品系.