浦 滇，李 俊?，李 芮，包崇卯，艾 黎，黃娜娜，和秋婷，劉雨珊，王生凡，范常偉

（1.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500；2.云南省高校藥食同用資源養(yǎng)生產(chǎn)品工程研究中心，云南 昆明 650500；3.云南與諾生物工程有限責任公司，云南 昆明 650217）

人參皂苷CK（compound K）為原人參二醇類人參皂苷。人參皂苷CK是人參皂苷在人體內(nèi)吸收和發(fā)揮藥理作用的主要形式之一，具有較高的生物活性[1]。但其在人參屬植物中的含量較低，無法滿足開發(fā)應用的需求。目前人參皂苷CK主要是通過微生物轉(zhuǎn)化和酶轉(zhuǎn)化制備得到[2]。有學者發(fā)現(xiàn)了人參皂苷經(jīng)過腸道細菌轉(zhuǎn)化成人參皂苷CK的代謝過程，這為人參皂苷CK后續(xù)的研究奠定了基礎[3]。之后的研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷CK具有保護心肌、抗炎、抗皮膚衰老、改善血糖、保護肝臟、抗過敏、保護神經(jīng)、抗腫瘤等多種藥理活性[3]。軟膠囊是將液體原料藥物或由固體原料藥物溶解、分散制成的溶液、混懸液、乳狀液或半固體顆粒密封于軟質(zhì)囊材中的膠囊劑，具有有效成分含量高、吸收迅速、穩(wěn)定性好、能掩蓋藥物的不良氣味、外形美觀等特點[4]。通過使用不同的囊殼材料，可制成腸溶膠囊、咀嚼膠囊、緩釋膠囊等不同特性的軟膠囊。軟膠囊中可以裝載各種類型的內(nèi)容物，如混懸液、溶液、半固體顆粒、固體顆粒、自微乳化釋藥系統(tǒng)等[5]。本研究主要是探討采用反相高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測人參皂苷CK軟膠囊中人參皂苷CK含量的效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（型號：Agilent 1260）；高效液相色譜儀（型號：SHIMADZU LC-2030）；中譜藍XY-C18Ⅱ色譜柱（規(guī)格為4.6 mm×250 mm、5 μm）；十萬分之一電子天平（型號：AB265-S）；萬分之一電子天平（型號：BSM120.4）；百分之一電子天平（型號：XCC-2002）；超聲波清洗器（型號：SK3300H）。

1.2 材料

甲醇（分析純，批號為190815，由四川西隴科學有限公司生產(chǎn)）；純化水（自制）；超純水；甲醇（色譜純，批號為I1082407013，由默克股份兩合公司生產(chǎn)）；乙腈（色譜純，批號為JB098030，由默克股份兩合公司生產(chǎn)）；人參皂苷CK對照品（質(zhì)量分數(shù)≥98.67，批號為RFS-R02811809026，由信陽市中檢計量生物科技有限公司生產(chǎn)）；人參皂苷CK軟膠囊（批號為20210101、20210301、20210302、20210303，自制）和空白軟膠囊（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷CK對照品10.13 mg，加入甲醇溶解并定容至10 mL，制得濃度為1.013 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液2 mL，加入甲醇定容至10 mL，搖勻，過0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，得到濃度為0.2026 mg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取裝量差異下的人參皂苷CK軟膠囊內(nèi)容物0.1000 g，置于10 mL的容量瓶中，加入甲醇適量定容至10 mL。對溶液進行10 min的超聲處理后放冷并搖勻，取上清液過0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得到供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為中譜藍XY-C18Ⅱ色譜柱，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A，以水溶液為流動相B，按表1中的數(shù)據(jù)進行梯度洗脫。體積流量為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長為203 nm，柱溫為30 ℃。理論塔板數(shù)按人參皂苷CK峰計算應不低于6000。

表1 反相HPLC法中的梯度洗脫數(shù)據(jù)

2.4 專屬性實驗

分別精密吸取人參皂苷CK對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10μL，按上述色譜條件進行檢測。檢測的結(jié)果顯示，人參皂苷CK的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度良好，對稱因子在0.95～1.05之間，理論板數(shù)大于6000。對照品溶液和供試品溶液在相同的保留時間均有出峰，陰性對照品溶液對人參皂苷CK的檢測無干擾。說明該檢測方法的專屬性強。檢測結(jié)果見圖1-3。

圖1 人參皂苷CK對照品溶液的反相HPLC圖

圖2 供試品溶液的反相HPLC圖

圖3 陰性對照品溶液的反相HPLC圖

2.5 線性關系考察

分別配制濃度為1.013 mg/mL、0.5065 mg/mL、0.2026 mg/mL、0.1013 mg/mL、50.65 μg/mL、10.13 μg/mL的人參皂苷CK對照品溶液，各精密吸取10 μL，按上述色譜條件進行檢測。以峰面積（Y）為縱坐標，人參皂苷CK對照品的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，得到人參皂苷CK的線性回歸方程為：y=4081.4x+3.2324，R2=1。該結(jié)果表明，在采用反相HPLC法進行檢測時，人參皂苷CK在10.13～1.013 mg/mL的范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12h、24 h注入液相色譜柱中，按上述色譜條件進行檢測，記錄峰面積。檢測的結(jié)果顯示，對照品溶液峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.10%，供試品溶液峰面積的RSD為1.13%。該結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收試驗

精密稱取人參皂苷CK軟膠囊內(nèi)容物適量，加入人參皂苷CK對照品溶液適量，配制成濃度分別為80%、100%和120%的供試品溶液。將各濃度的供試品溶液均制備3份，按上述色譜條件進行檢測，以外標法計算其中人參皂苷CK的含量，并計算其加樣回收率。結(jié)果顯示，80%、100%、120%供試品溶液的平均加樣回收率分別為99.07%、101.01%、100.92%，RSD分別為1.89%、0.92%、1.82%。詳見表2。

表2 人參皂苷CK軟膠囊內(nèi)容物加樣回收率試驗結(jié)果

2.8 人參皂苷CK含量的測定

精密稱取0.1000 g的人參皂苷CK軟膠囊內(nèi)容物，加入甲醇稀釋并定容至10 mL。對溶液進行10 min的超聲處理，過0.22 μm的濾膜，取續(xù)濾液。按上述色譜條件測定人參皂苷CK軟膠囊中人參皂苷CK的含量。檢測的結(jié)果顯示，每粒人參皂苷CK軟膠囊中人參皂苷CK的含量為10 mg。

3 討論

人參皂苷CK的極性較低，故本研究選用反相HPLC法對人參皂苷CK軟膠囊中人參皂苷CK的含量進行檢測。人參皂苷CK屬于四環(huán)三萜達瑪烷型人參皂苷，在203 nm處有最大吸收波長，故本研究進行檢測時選用203 nm作為檢測波長。本研究依據(jù)2020版《中國藥典》[6]中的相關規(guī)定采用HPLC法檢測人參皂苷CK軟膠囊中人參皂苷CK的含量，檢測結(jié)果符合《中國藥典》中關于人參皂苷CK軟膠囊中人參皂苷CK含量的規(guī)定。

本研究的結(jié)果證實，采用反相HPLC法檢測人參皂苷CK軟膠囊中人參皂苷CK含量的效果顯著，具有簡單易行、專屬性強、重復性好、穩(wěn)定性和精密度高等優(yōu)點。