宋春蘭，左海洋，王 偉，陳 甫，商 微*

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心生殖中心，北京 100037；2.中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)醫(yī)學(xué)部，北京 100700)

植入前遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing，PGT)技術(shù)的發(fā)展逐步應(yīng)用于單基因病、染色體病等遺傳性疾病的預(yù)防，為高齡和反復(fù)流產(chǎn)等患者帶來了希望，通過對植入子宮前的胚胎進行遺傳學(xué)檢測，選擇不攜帶致病基因和異常染色體的整倍體胚胎移植，能夠提高輔助生殖的妊娠率，阻斷遺傳性疾病向子代傳遞。PGT主要分為植入前遺傳學(xué)非整倍體檢測(PGT for aneuploidies，PGT-A)、染色體結(jié)構(gòu)重排檢測(PGT for structural rearrangements，PGT-SR)和單基因病檢測(PGT for monogenic，PGT-M)[1]。本研究對行PGT-A及PGT-SR的患者進行了分析，為此類患者的遺傳咨詢提供依據(jù)，為PGT技術(shù)的推廣與臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2018年1月—2019年12月于中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心行PGT-A及PGT-SR助孕夫婦的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：體外受精-胚胎移植禁忌證。共納入PGT-A 194個周期，635個胚胎，101個移植周期；共納入PGT-SR 92個周期，399個胚胎，40個移植周期。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2研究方法

1.2.1控制性超促排卵、受精及胚胎培養(yǎng) 所有患者采用合適的方案促排卵。注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)36 h后行陰道超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)。均采用卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射受精方式，取卵后第1天觀察卵子受精情況，雙原核為正常受精。第5～7天行囊胚期胚胎(滋養(yǎng)細胞)活組織檢查取樣?；罱M織檢查后的胚胎行常規(guī)玻璃化冷凍單個存放。

1.2.2胚胎檢測 采用MALBAC專利技術(shù)(即多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(shù))對胚胎活檢樣本進行全基因組擴增，利用酶切打斷建庫的方法進行測序文庫構(gòu)建，通過高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)分析胚胎染色體非整倍體等異常情況。

1.2.3凍融胚胎移植、黃體支持及隨訪 選擇活組織檢查檢測正常的胚胎進行單胚胎移植，黃體支持采用雌激素聯(lián)合孕激素，移植后1周檢測血清HCG，HCG陽性者移植后約4周行陰道超聲檢查，觀察宮腔內(nèi)孕囊數(shù)目及有無胎心搏動以確定臨床妊娠，期間根據(jù)患者激素水平保胎，統(tǒng)計生化妊娠率、臨床妊娠率；后期電話隨訪本周期妊娠情況及結(jié)局，隨訪羊水穿刺染色體檢查結(jié)果、性別、出生體重、妊娠孕周及有無先天畸形等情況，統(tǒng)計流產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率、活產(chǎn)率。生化妊娠：胚胎移植后 7～14 d HCG >25 U/L。臨床妊娠：移植后約4周，陰道超聲檢查可見宮腔內(nèi)妊娠囊。流產(chǎn)：妊娠28周前妊娠終止。持續(xù)妊娠：妊娠持續(xù)到20周及以后。活產(chǎn)：妊娠≥28周后分娩活嬰。

1.3分組情況 將PGT-A患者根據(jù)年齡分為年輕女性(<35歲)組與高齡女性(≥35歲)組，比較分析2組基本情況、胚胎情況、移植結(jié)局。為更好比較不同年齡階段的PGT-A助孕女性的結(jié)局，將高齡女性進一步分為35～37歲組、38～39歲組、40～41歲組及≥42歲組，與<35歲組比較基本情況、胚胎情況、移植結(jié)局。將PGT-SR患者根據(jù)年齡分為年輕女性(<35歲)組與高齡女性(≥35歲)組，比較分析2組基本情況、胚胎情況、移植結(jié)局。因PGT-SR周期較少，故不再將高齡組進一步分組。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS23.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。非正態(tài)分布的計量資料比較采用非參數(shù)秩和檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PGT-A

2.1.1患者一般資料 共納入194個周期，送檢635個胚胎，移植101個周期。年輕女性組(<35歲)共43個周期、199個胚胎，平均年齡(31.81±2.03)歲；高齡組(≥35歲)共151個周期、436個胚胎，平均年齡(39.43±2.80)歲。<35歲組和≥35歲組體重指數(shù)(body mass index,BMI)、基礎(chǔ)促卵泡生成素(follicle stimulating hormone,FSH)、基礎(chǔ)促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、不孕類型、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。將高齡女性進一步分為35～37歲組、38～39歲組、40～41歲組及≥42歲組，與<35歲組比較，基礎(chǔ)FSH差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各組間體重指數(shù)、基礎(chǔ)LH、不孕類型、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 <35歲組及≥35歲組PGT-A 臨床基本情況比較Table 1 Comparison of general clinical data of PGT-A between patients <35 years of age and patients ≥35 years of age

表2 不同年齡組PGT-A 臨床基本情況比較Table 2 Comparison of general clinical data of PGT-A among different age groups

2.1.2胚胎情況比較 <35歲組平均獲卵數(shù)高于≥35歲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2組獲卵率、卵子成熟率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成有效囊胚率、囊胚形成率、可利用囊胚率、有效囊胚率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。將高齡女性進一步分為35～37歲組、38～39歲組、40～41歲組及≥42歲組，與<35歲組比較，各組間獲卵數(shù)、卵子成熟率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，余各項差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4；≥35歲組正常胚胎率明顯低于<35歲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，將高齡女性進一步分為35～37歲組、38～39歲組、40～41歲組及≥42歲組，與<35歲組比較，各組間正常胚胎率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5，6。

表3 <35歲組及≥35歲組PGT-A胚胎情況比較Table 3 Comparison of embryonic status of PGT-A between patients <35 years of age and patients ≥35 years of age [M(QR)]

表4 不同年齡組PGT-A胚胎情況比較Table 4 Comparison of embryonic status of PGT-A among different age groups [M(QR)]

表5 <35歲組及≥35歲組PGT-A胚胎活組織檢查結(jié)果比較Table 5 Comparison of embryo biopsy results of PGT-A between patients <35 years of age and patients≥35 years of age (胚胎數(shù)，%)

表6 不同年齡組PGT-A胚胎活組織檢查結(jié)果比較Table 6 Comparison of embryo biopsy results of PGT-A among different age groups (胚胎數(shù)，%)

2.1.3移植結(jié)局比較 <35歲組共移植40個周期，臨床妊娠17例，活產(chǎn)17例，均為足月產(chǎn)?！?5歲組共移植61個周期，臨床妊娠32例，活產(chǎn)27例，其中1例早產(chǎn)。所有子代均健康。2組生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 將高齡女性進一步分為35～37歲組、38～39歲組、40～41歲組及≥42歲組，與年輕女性組(<35歲)比較，生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表7，8。

表7 <35歲組及≥35歲組PGT-A 移植結(jié)局比較Table 7 Comparison of embryo transfer outcome of PGT-A between patients <35 years of age and patients ≥35 years of age (周期數(shù)，%)

表8 不同年齡組PGT-A 移植結(jié)局比較Table 8 Comparison of embryo transfer outcome of PGT-A among different age groups (周期數(shù)，%)

2.2PGT-SR

2.2.1患者一般資料 共納入92個周期，送檢399個胚胎。<35歲組共63個周期、277個胚胎，平均年齡(31.06±2.06)歲；≥35歲組共29個周期、122個胚胎，平均年齡(38.28±2.20)歲。2組基礎(chǔ)FSH差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，BMI、基礎(chǔ)LH、不孕類型、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表9。

表9 PGT-SR臨床基本情況比較Table 9 Comparison of general clinical data of PGT-SR

2.2.2胚胎情況比較 <35歲組平均獲卵數(shù)高于≥35歲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2組獲卵率、卵子成熟率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成有效囊胚率、囊胚形成率、可利用囊胚率、有效囊胚率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表10；≥35歲組正常胚胎率明顯低于<35歲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表11。

表10 2組PGT-SR胚胎情況比較Table 10 Comparison of embryonic status of PGT-SR between two groups [M(QR)]

表11 PGT-SR 2組胚胎活組織檢查結(jié)果比較Table 11 Comparison of embryo biopsy results of PGT-SR between two groups (胚胎數(shù)，%)

2.2.3移植結(jié)局比較 <35歲組共移植31個周期，臨床妊娠14例，流產(chǎn)2例，活產(chǎn)12例，均為足月產(chǎn)?！?5歲組共移植9個周期，臨床妊娠8例，流產(chǎn)1例，活產(chǎn)7例，均為足月產(chǎn)。所有子代均健康。2組生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表12。

表12 2組PGT-SR移植結(jié)局比較Table 12 Comparison of embryo transfer outcome of PGT-SR between two groups (周期數(shù)，%)

3 討 論

PGT至今已有20余年，主要應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、高齡、染色體病和單基因病等患者，目前通過染色體非整倍體檢測、染色體病檢測和單基因病檢測技術(shù)阻斷了遺傳缺陷向子代傳遞，改善了這些患者的臨床妊娠結(jié)局。早期，PGT分為植入前遺傳學(xué)診斷和植入前遺傳學(xué)篩查兩個部分[2]。PGD適用于單基因病和染色體病患者，PGS適用于女方高齡、反復(fù)流產(chǎn)、反復(fù)種植失敗和嚴重男性因素不育患者。2017年，國際輔助生殖技術(shù)監(jiān)控委員會對PGT進行了新的分類，包括PGT-A、PGT-SR、PGT-M三個部分[1]。PGT-A用于女方高齡、反復(fù)流產(chǎn)、反復(fù)種植失敗和嚴重男性因素不育患者，能夠篩查出非整倍體胚胎，而胚胎非整倍體是導(dǎo)致早期流產(chǎn)最常見的原因之一[3]。PGT-SR適用于易位、倒位、重復(fù)、缺失等染色體結(jié)構(gòu)異?；颊?，可以發(fā)現(xiàn)胚胎的拷貝數(shù)變異，通過移植不攜帶缺失和重復(fù)的整倍體胚胎，降低因染色體不平衡導(dǎo)致的反復(fù)移植失敗及早期流產(chǎn)的發(fā)生。單基因病患者攜帶的致病基因遺傳給子代，會導(dǎo)致子代患病，加重家庭負擔(dān)。PGT-M可以篩選出不攜帶致病基因的胚胎，阻斷遺傳缺陷，獲得健康后代[4]。

近年來，微陣列芯片和二代測序等PGT技術(shù)不斷發(fā)展，提高了檢測準(zhǔn)確性，降低了誤診率，但仍然存在檢測時間長、成本高、等位基因脫扣和無法識別染色體平衡易位等問題[5]。針對以上問題，近來有新的技術(shù)方法應(yīng)用于臨床，能準(zhǔn)確識別攜帶致病基因的染色體，鑒別易位攜帶狀態(tài)的胚胎，提高異常胚胎的檢出率，改善子代的臨床結(jié)局[6-7]。

本研究結(jié)果顯示，PGT-A助孕人群，≥35歲組獲卵數(shù)少于<35歲組，其后胚胎發(fā)育差異無統(tǒng)計學(xué)意義，胚胎活組織檢查后≥35歲組正常胚胎率明顯低于<35歲組，PGT-SR結(jié)果中也存在此現(xiàn)象，且隨著年齡增長，胚胎活組織檢查染色體異常率逐漸升高，因此胚胎形態(tài)學(xué)評價并不能反映胚胎染色體是否正常，胚胎染色體異常與女方年齡密切相關(guān)。在一項對12 298個胚胎進行PGT-A的研究中，結(jié)果顯示,年齡>35歲的女性整倍體率隨著年齡的增長而急劇下降，活組織檢查胚胎的數(shù)量也隨著年齡的增長而減少，特別是對于年齡>37歲的女性[8]。在一項前瞻性多中心研究提示，胚胎整倍體水平與年齡呈負相關(guān)，非整倍體水平與年齡呈正相關(guān)[9]。

既往很多研究發(fā)現(xiàn)，隨著女性年齡增長，胚胎非整倍體率逐漸升高，<35歲女性囊胚非整倍體率約32%，此概率隨年齡增加不斷升高，≥42歲女性的囊胚非整倍體率已高達85%[10-11]。本研究結(jié)果顯示，PGT-A中<35歲女性異常胚胎率為39.20%，≥35歲女性異常胚胎率為63.76%；在染色體結(jié)構(gòu)異常夫婦中，<35歲女性異常胚胎率為56.32%，≥35歲女性異常胚胎率為83.61%。相較于無染色體結(jié)構(gòu)異常的女性，染色體結(jié)構(gòu)異常女性的胚胎染色體異常比率較高，存在更高的流產(chǎn)風(fēng)險。PGT-SR患者中包括平衡易位、羅氏易位、倒位等多種染色體異常，染色體異常類型及異常所在染色體位置可能與染色體非整倍體發(fā)生率有關(guān)[12-14],夫婦一方或雙方染色體結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致子代非整倍體率明顯升高[15-16]。

胚胎染色體異常是造成高齡女性自然流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局的主要因素。高齡女性胚胎染色體異常導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)，增加了女性的生理、心理及經(jīng)濟負擔(dān)。經(jīng)過PGT后，移植染色體平衡的胚胎，高齡女性與年輕女性移植結(jié)局差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明當(dāng)去除胚胎染色體異常這一因素后，高齡女性可獲得同年輕女性相似的妊娠結(jié)局，從而減少流產(chǎn)的發(fā)生，減輕患者的痛苦。但臨床中，需要考慮的更多。本研究結(jié)果顯示，隨著女性年齡的增長，胚胎活組織檢查正常率逐漸下降，40～41歲女性胚胎活組織檢查正常率為29.13%，≥42歲女性胚胎活組織檢查正常率僅為10.39%，且年齡越大，胚胎嵌合體發(fā)生率越高，導(dǎo)致最終無可移植囊胚，所以，對于40歲以上女性，尤其超過42歲女性，是否行PGT值得臨床醫(yī)生權(quán)衡利弊。有研究發(fā)現(xiàn)，高齡女性行PGT-A助孕的周期取消率增高，尤其對于卵巢功能減退、胚胎少的高齡女性，是否行PGT-A應(yīng)權(quán)衡利弊后決定[17]。

本研究結(jié)果顯示，PGT-A中，共移植101個胚胎，活產(chǎn)44例，活產(chǎn)率達43.56%，PGT-SR中，共移植40個胚胎，活產(chǎn)19例，活產(chǎn)率達47.50%，可見PGT是解決復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、高齡女性、染色體異常夫婦等的有效治療手段，PGT的臨床應(yīng)用尤其能夠有效改善高齡女性的生育狀況。

本研究亦存在不足，為回顧性研究，可能存在未知偏移影響統(tǒng)計結(jié)果；納入樣本量偏少，尤其移植周期數(shù)偏少，可能影響統(tǒng)計學(xué)效力，待更多前瞻性研究進一步支持。

綜上所述，PGT是解決復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、高齡女性、染色體異常夫婦等的有效治療手段，PGT的臨床應(yīng)用尤其能夠有效改善高齡女性的生育狀況，但并不適合所有高齡的女性，尤其40歲以后的女性。目前國內(nèi)可開展PGT技術(shù)的生殖中心有限，很多中心處于PGT起步階段，國內(nèi)關(guān)于PGT臨床結(jié)局的研究有限，對于40歲以后的女性患者，其治療方案應(yīng)個體化、權(quán)衡利弊綜合考量。