范正超，尹 航，劉建震，李崇斌

(河北省胸科醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050000)

泌尿生殖系結(jié)核是僅次于淋巴結(jié)核病的第二大肺外結(jié)核病，其中腎結(jié)核最為多見[1-2]。病原學檢查及病理學檢查是確診腎結(jié)核的重要手段，但不典型的病理形態(tài)學表現(xiàn)經(jīng)常與其他慢性肉芽腫疾病如非結(jié)核分枝桿菌感、真菌感染、血管炎、結(jié)節(jié)病等難以區(qū)分，故病原學檢查有著更重要的意義[3-4]，臨床和病理科都應(yīng)盡力尋找病原菌證據(jù)。病理組織標本結(jié)核分枝桿菌病原菌的檢測方法包括組織培養(yǎng)、抗酸染色、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)及宏基因測序等分子生物學技術(shù)。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是結(jié)核病診斷的金標準，但因培養(yǎng)時間較長，臨床應(yīng)用價值受限[5]?？顾崛旧徽J為是診斷結(jié)核病的重要參考指標，但病理組織抗酸染色的敏感度并不理想，低于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢查結(jié)果，且抗酸染色陽性時不能排除非結(jié)核分枝桿菌、麻風桿菌、軍團菌屬等抗酸染色陽性菌[6-7]。近年來，各種病原學檢查技術(shù)尤其是分子生物學檢查方法應(yīng)用于病理標本的檢查，明顯提高了結(jié)核病尤其是肺外結(jié)核病的確診率[8]。本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)在腎結(jié)核組織切片中檢測結(jié)核分枝桿菌特異基因序列，評估實時熒光定量聚合PCR技術(shù)在腎結(jié)核病理診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2015年9月—2019年9月在我院泌尿外科通過后腹腔鏡技術(shù)或開放技術(shù)行腎切除術(shù)、病理科制作保存的石蠟包埋組織標本55例。以術(shù)前尿結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果為金標準，并結(jié)合術(shù)后病理診斷結(jié)果，將研究標本分為結(jié)核腎病組(陽性組)25例，非結(jié)核腎病組30例(陰性組)。其中結(jié)核腎病組(陽性組)男性10例，女性15例；病變位于左側(cè)12例，右側(cè)13例；年齡35～60歲，中位年齡47.0歲。患者均有反復(fù)尿頻、尿急、尿痛等癥狀≥3個月，每個患者均收集3次晨尿標本，行BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)或羅氏固體培養(yǎng)，結(jié)果每個患者至少有1次尿標本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性。患者術(shù)前均診斷為活動性無功能腎結(jié)核(患側(cè))，行后腹腔鏡或開放手術(shù)腎切除術(shù)，術(shù)后病理診斷HE染色為腎結(jié)核或符合腎結(jié)核。非結(jié)核腎病組(陰性組)：同一時期因腎結(jié)石、腎積水、腎外傷、腎腫瘤等行腎切除術(shù)或腎部分切除術(shù)的標本30例，其中無功能性腎結(jié)石3例，無功能性腎積水2例，創(chuàng)傷性腎碎裂傷2例，腎盂癌8例，腎癌15例，其中男性14例，女性16例；病變位于左側(cè)13例，右側(cè)17例；年齡35～65歲，中位年齡49.5歲。術(shù)前均采集3次尿標本行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，結(jié)果均陰性，且術(shù)后病理診斷均為非結(jié)核病。兩組性別、腎臟患側(cè)、年齡等一般資料差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均有可比性。

本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2納入標準 (1)結(jié)核腎病組納入標準：尿標本經(jīng)BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)或羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果為陽性，且病理診斷結(jié)果符合《中國結(jié)核病病理學診斷專家共識》[9]結(jié)核病病理診斷標準：①慢性肉芽腫伴壞死病變中找到經(jīng)典結(jié)核結(jié)節(jié)；②慢性肉芽腫伴壞死病變中査到抗酸桿菌；③慢性肉芽腫伴壞死病變中未見經(jīng)典結(jié)核結(jié)節(jié)或抗酸桿菌, 但臨床細菌學或影像學檢查支持結(jié)核診斷,并且抗結(jié)核治療有效；以上三條具備其中一條即可。(2)非結(jié)核腎病組納入標準：尿標本經(jīng)BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)或羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果為陰性，且術(shù)后病理診斷結(jié)果確診為非結(jié)核病變者。

1.3排除標準 符合以下條件者可不納入：標本病理診斷為其他感染性肉芽腫病變者。

1.4儀器與方法

1.4.1試劑及儀器 實時熒光定量PCR儀，型號ABI 7500，為我院分子實驗室提供，組織DNA提取試劑盒、結(jié)核分枝桿菌核酸測定試劑盒均購自成都博奧晶芯生物科技有限公司?？顾崛旧噭┖匈徸阅暇┮换萍加邢薰尽?/p>

1.4.2DNA提取及PCR擴增檢測 ①所有石蠟組織標本連續(xù)切片5 μm×10張，置于消毒好的1.5 mL離心管中。②按照DNA提取試劑說明書操作步驟提取組織標本DNA。③DNA擴增：按照結(jié)核分枝桿菌核酸測定試劑盒說明書要求進行。PCR反應(yīng)條件：92 ℃ 1 min→60 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min，30個循環(huán)。在72 ℃進行熒光檢測。每批檢測標本均設(shè)置陰性對照、強陽性對照、臨界陽性對照。檢驗結(jié)果判定：Ct<40且擴增曲線呈典型S型為陽性，Ct≥40或無擴增曲線為陰性。

1.4.3抗酸染色檢測 石蠟組織標本切片厚4 μm，常規(guī)二甲苯脫臘并水洗。具體染色方法略，參見堿性復(fù)紅法(Ziehl-Neelsen)染色法[10]。結(jié)果判定：抗酸菌呈紅色桿狀，其他組織細胞或細菌呈藍色。

1.5統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件和Medcalc統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料不滿足正態(tài)分布者采用兩組樣本比較的秩和檢驗(Mann-Whitney U)，計數(shù)資料采用兩組樣本比較的χ2檢驗，不滿足χ2檢驗條件時采用確切概率法。兩種檢測方法與術(shù)前尿標本BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)或羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果一致性分析采用Kappa檢驗，Kappa≥0.75說明一致性較好，Kappa<0.4說明一致性較差，0.75>Kappa≥0.4說明一致性一般。計算兩種檢測方法診斷效能采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析，0.50.9表示有很高的診斷價值。兩種診斷的ROC曲線下面積比較采用Z檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1實時熒光定量PCR檢測及抗酸染色的檢測結(jié)果 本研究中熒光定量PCR檢測結(jié)果Ct<40且擴增曲線呈典型S型者為陽性，Ct≥40或無擴增曲線者為陰性。抗酸染色檢測呈紅色桿狀、略彎曲、串珠狀者為抗酸桿菌陽性，抗酸桿菌多見于壞死的中心區(qū)或壞死區(qū)與上皮樣肉芽腫的交界處。

2.2熒光定量PCR檢測及抗酸染色檢測的診斷效能 在本研究55例石蠟組織標本中，結(jié)核腎病組25例，非結(jié)核腎病組30例，熒光定量PCR與抗酸染色技術(shù)在兩組標本中檢測結(jié)果見表1。以術(shù)前尿標本BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)或羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果為金標準，熒光定量PCR檢測石蠟組織標本結(jié)核分枝桿菌的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準確度分別為80.0%、96.7%、95.2%、85.3%、89.1%，一致性結(jié)果為Kappa=0.777,P<0.001(一致性較好)?？顾崛旧珯z測石蠟組織標本抗酸桿菌的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準確度分別為48.0%、93.3%、85.7%、68.3%、72.7%，一致性結(jié)果為Kappa=0.429,P<0.001(一致性一般)。熒光定量PCR檢測的敏感度高于抗酸染色檢測的敏感度，兩組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.556,P=0.018)。熒光定量PCR檢測的特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均高于抗酸染色檢測的結(jié)果，但兩者比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。熒光定量PCR檢測的準確度高于抗酸染色檢測的準確度(89.1%vs.72.7%)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.767，P=0.029)，見表2。

表1 熒光定量PCR與抗酸染色技術(shù)在兩組組織標本中的檢測結(jié)果Table 1 The detection results of fluorescent quantitative PCR and acid-fast staining technique in two groups of tissue samples (例數(shù))

表2 熒光定量PCR技術(shù)與抗酸染色技術(shù)對腎結(jié)核組織病理的診斷效能Table 2 The diagnostic efficacy of fluorescent quantitative PCR and acid-fast staining technique for histopathological diagnosis of renal tuberculosis

2.3熒光定量PCR與抗酸染色對腎結(jié)核組織標本診斷價值的ROC曲線分析 根據(jù)不同檢測方法檢測樣本在選擇的各點上的敏感度和特異度，繪制ROC曲線，以術(shù)前尿標本BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)或羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果為金標準擬合對腎結(jié)核組織標本診斷效能的ROC曲線，見圖1。分別以熒光定量PCR技術(shù)和抗酸染色技術(shù)為檢驗變量時，熒光定量PCR技術(shù)診斷的ROC曲線面積為0.883，有較高的診斷價值(0.8

圖1 兩種檢測方法對腎結(jié)核組織標本診斷效能受試者工作特征曲線分析結(jié)果

表3 兩種檢測方法的ROC曲線下面積值及比較Table 3 The area under the ROC curve of two detection methods and their comparison

3 討 論

結(jié)核病的分子生物學檢測開展較早，WHO于2013 年、我國于2017 年分別修訂了診斷標準，已將分子生物學技術(shù)作為病原學檢測的重要依據(jù)。分子生物學技術(shù)不僅可以檢測病原菌的核酸，還可以深度鑒定不同菌種、檢測耐藥基因。目前采用的技術(shù)包括：即時熒光定量 PCR、等溫擴增技術(shù)、探針-熔解曲線技術(shù)、基因測序技術(shù)、二代測序及液相芯片等[11-15]。

對于腎結(jié)核，尿結(jié)核桿菌培養(yǎng)最有診斷價值，但敏感度變化較大，且同樣存在培養(yǎng)周期長、延誤治療等問題，尿沉渣抗酸染色檢測存在敏感度低，易污染，不能有效排除其他抗酸染色陽性菌干擾(如包皮垢分枝桿菌)等問題[16-17]。尿結(jié)核分枝桿菌DNA檢測對結(jié)核桿菌具有較高特異度以及敏感度,國外有研究報道以尿結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性為金標準，PCR檢測尿TB菌的敏感度達95.6%，特異度達98.1%，而國內(nèi)有研究報道的敏感度為80.0%，特異度為78.5%[18-19]。因尿標本中存在某些擴增抑制藥物，或標本易被污染等，使得該檢查易出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。

本研究中采用敏感度及特異度較高的分子生物學方法實時熒光定量PCR技術(shù)檢測腎組織上的結(jié)核分枝桿菌特異DNA序列，以術(shù)前尿結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為金標準，并結(jié)合術(shù)后腎臟切除標本病理診斷結(jié)果，將研究對象分為陽性組和陰性組，并通過與同組腎組織標本抗酸染色檢測結(jié)果對比，研究實時熒光定量PCR技術(shù)在腎結(jié)核病理診斷中的診斷效能，以期對臨床診斷提供依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR檢測石蠟組織標本結(jié)核分枝桿菌的敏感度、特異度分別為80.0%、96.7%，與術(shù)前尿結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性金標準進行一致性檢驗，結(jié)果為Kappa=0.777，診斷一致性較好。在本研究顯示：①實時熒光定量PCR技術(shù)在腎結(jié)核確診病例組織切片中檢測的敏感度為80.0%，與文獻報道的在尿沉渣標本中檢測的敏感度有稍許差距，提示PCR檢測敏感度在不同介質(zhì)標本(液體、固體組織)中有差別，臨床應(yīng)用中應(yīng)注意相關(guān)區(qū)別。②腎組織實時熒光定量PCR檢測的敏感度較抗酸染色敏感度提高32.0%，差異有統(tǒng)計學意義。腎組織實時熒光定量PCR檢測的準確度亦明顯高于抗酸染色檢測結(jié)果，差異有統(tǒng)計學意義。實時熒光定量PCR技術(shù)和抗酸染色技術(shù)的ROC曲線下面積分別為0.883和0.707,前者高于后者0.177,差異有統(tǒng)計學意義(Z=3.502，P<0.05)。這充分提示在腎結(jié)核病理診斷中，實時熒光定量PCR技術(shù)較抗酸染色技術(shù)在病原學檢測方面具有更大的應(yīng)用價值。本研究對腎組織標本進行結(jié)核分枝桿菌核酸基因檢測，既擴展了實時熒光定量PCR技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌檢測領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，同時也增加了腎結(jié)核病理診斷的技術(shù)手段，并最終提高了腎結(jié)核的病理診斷準確度。

本研究腎結(jié)核組(研究組)中組織熒光定量PCR檢測陽性20例，其中9例抗酸染色陽性，11例抗酸染色陰性，分析可能原因：抗酸染色檢測的敏感度低于熒光定量PCR的檢測結(jié)果，在行充分抗結(jié)核治療后組織標本結(jié)核菌量水平明顯降低的情況下，抗酸染色的敏感度會進一步降低，假陰性率升高。腎結(jié)核組中抗酸染色檢測陽性12例，其中11例熒光定量PCR檢測陽性，1例陰性，考慮可能原因：①抗酸染色陽性標本中存在非結(jié)核分枝桿菌感染者；②抗酸染色陽性標本中存在擴增反應(yīng)抑制物，抑制PCR擴張，導(dǎo)致熒光定量PCR檢測陰性。在本研究陰性組(非結(jié)核腎病組)中熒光定量PCR檢測假陽性1例，考慮與標本間污染有關(guān)，需加強實驗室的清潔、消毒工作，提高檢測過程的質(zhì)量控制標準。陰性組中抗酸染色檢測假陽性2例，考慮除與標本之間污染有關(guān)外，可能有非結(jié)核分枝桿菌(如包皮垢分枝桿菌)、諾卡菌屬、軍團菌屬等抗酸染色陽性菌干擾有關(guān)，需通過熒光定量PCR檢測或結(jié)核桿菌培養(yǎng)區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，提高檢測的特異性。

綜上所述，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測方法簡單易行，與抗酸染色檢測技術(shù)相比可以提高腎結(jié)核病原體檢測的敏感度和準確度，在腎結(jié)核的病理診斷中具有良好的應(yīng)用價值。