程 璐，徐琪超，梅 舟，徐 哲

蘇州大學(xué)附屬常州老年病醫(yī)院/常州市第七人民醫(yī)院:1.檢驗科;2.血液腫瘤科，江蘇常州 213000；3.常州市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇常州 213000

結(jié)直腸癌作為較為常見的惡性腫瘤之一，目前已成為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。隨著人們飲食、環(huán)境的不斷改變，其發(fā)病率也呈持續(xù)上升趨勢，且患者術(shù)后多出現(xiàn)復(fù)發(fā)情況[2]。有研究顯示[3]，我國經(jīng)確診為結(jié)直腸癌的患者中，20%～25%患者發(fā)生復(fù)發(fā)和癌旁轉(zhuǎn)移。目前，主要通過手術(shù)、化學(xué)藥物方法進(jìn)行治療，并取得了一定的效果，但既往治療對于癌旁轉(zhuǎn)移認(rèn)識不足，因此導(dǎo)致術(shù)后易復(fù)發(fā)，影響預(yù)后，因此，針對免疫系統(tǒng)的抗癌療法對于治療結(jié)直腸癌具有重要意義，程序性死亡受體 1(PD-1)，程序性死亡配體 1(PD-L1)作為免疫系統(tǒng)負(fù)向調(diào)節(jié)因子在抗腫瘤免疫領(lǐng)域中起到了至關(guān)重要的作用[4-5]。因此本研究旨在探討PD-L1和PD-1在T4期結(jié)直腸癌組織及周圍轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)情況及與預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年12月至2021年5月常州市第七人民醫(yī)院收治的80例T4期結(jié)直腸癌患者，41例男性、39例女性；年齡34～86歲，平均(63.54±3.82)歲；按國際抗癌協(xié)會分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級：G1級12例、G2級49例、G3級19例。隨訪12個月。

1.2儀器與試劑 采用日本OLYMPULS公司BX51 顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果觀察并拍照。PD-1 抗體和 PD-L1 抗體均購于福建邁新生物技術(shù)有限公司，濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(產(chǎn)品編號 DAB-0031)購于邁新公司，免疫組化廣譜(EliVision TM plus)試劑盒(產(chǎn)品編號 KIT-9903)購于邁新公司。

1.3方法 對PD-L1、PD-1實施蛋白免疫組化檢測，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)鏈霉親和過氧化物酶，將組織切片放在特定濃度一抗中一晚，隔天，將組織切片放入羊抗兔 lgG 內(nèi)孵育 30 min，再將組織切片轉(zhuǎn)移至經(jīng)過氧化酶標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育 20 min。用50 μL TrisHCL 緩沖液 (pH=7.6)將切片染色，并放置于顯微鏡下觀察約 6 min，再用水沖洗，最后用蘇木素進(jìn)行染色，用1%鹽酸酒精分化、氨水返藍(lán)梯度酒精脫水、吹干、封片處理。

1.4觀察指標(biāo) 所有組織采用常州市第七人民醫(yī)院病理科病理組織庫中保存的結(jié)直腸癌患者癌及管狀腺瘤組織蠟塊。采用DAKO Hercept Test 評分，PD-L1 和 PD-1陽性顯色：細(xì)胞漿呈現(xiàn)黃色至黃褐色顆粒。采用半定量積分法來表達(dá)PD-L1 和 PD-1，評分指標(biāo)結(jié)合染色強度和陽性細(xì)胞百分比，選擇5個視野進(jìn)行觀察。染色強度：不著色提示0分；淺黃色提示1分；棕黃色提示2分；棕褐色提示3分，顏色越深，分值越高。陽性細(xì)胞百分比：低于0%～<10%為1分； 10%～<50%為2分；≥50%為3分。染色強度和染色的陽性細(xì)胞計數(shù)乘積小于3分為陰性，反之則為陽性。所有免疫組化切片由2名研究者獨立進(jìn)行判斷評估，若結(jié)果不一致時，則重新共同觀察確定。總生存期是指從隨機化開始至因任何原因引起死亡的時間；無進(jìn)展生存期是指隨機化到患者出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或死亡的時間。根據(jù)檢測出的陽性細(xì)胞數(shù)確定高表達(dá)、中度表達(dá)及低表達(dá)，其中低表達(dá)為陽性細(xì)胞數(shù)>20%，中度表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)>40%，高表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)>65%。

2 結(jié) 果

2.1PD-LI、PD-1在總生存期和無進(jìn)展生存期中的表達(dá)率比較 PD-L1、PD-1高表達(dá)患者總生存期和無進(jìn)展生存期表達(dá)率與PD-L1、PD-1中度表達(dá)和低表達(dá)患者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 PD-LI、PD-1在總生存期和無進(jìn)展生存期中的表達(dá)率比較[n(%)]

2.2T4期結(jié)直腸癌組織及周圍轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)患者PD-L1表達(dá)率比較 T4期結(jié)直腸癌組織及周圍轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)患者中檢測到54例 PD-L1表達(dá)，其中高表達(dá)38例(70.37%)、中度表達(dá)10例(18.52%)、低表達(dá)6例(11.11%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 T4期結(jié)直腸癌組織及周圍轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)患者PD-L1表達(dá)率比較[n(%)]

2.3T4期結(jié)直腸癌組織及周圍轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)患者 PD-1表達(dá)率比較 T4期結(jié)直腸癌組織及周圍轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)患者中檢測到54例PD-1表達(dá)，其中高表達(dá)38例(70.37%)、中度表達(dá)10例(18.52%)、低表達(dá)6例(11.11%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 T4期結(jié)直腸癌組織及周圍轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)患者PD-1表達(dá)率比較[n(%)]

2.4PD-L1、PD-1表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后關(guān)系 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級對PD-L1、PD-1表達(dá)存在影響。見表4。

表4 PD-L1、PD-1表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后關(guān)系

3 討 論

結(jié)直腸癌作為世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一[6]，目前主要采取手術(shù)、放化療及藥物控制等治療手段。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，不斷地有新型化療藥物及分子靶向藥物運用到臨床，并取得了顯著的成果，但因結(jié)直腸癌而死亡的患者人數(shù)仍占多數(shù)，且患者術(shù)后情況不容樂觀[7-8]。當(dāng)前免疫療法已成為治療腫瘤的重要策略，而免疫耐受現(xiàn)象則成為了腫瘤免疫療法的主要障礙，癌細(xì)胞在癌變部位通過各類機制對自身進(jìn)行保護(hù)，通過上調(diào)免疫抑制性分子PD-Ll表達(dá)而達(dá)到逃避機體免疫反應(yīng)的目的[9-10]。

PD-L1作為凋亡相關(guān)蛋白在免疫應(yīng)答中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，在免疫應(yīng)答中，PD-L1對其配體PD-1和淋巴細(xì)胞結(jié)合起到誘導(dǎo)作用，進(jìn)而傳遞給T淋巴細(xì)胞其抑制信號，最終起到調(diào)節(jié)外周T細(xì)胞免疫耐受的作用[11-12]。 PD-L1、PD-1通路及腫瘤免疫逃避系統(tǒng)在治療過程中受到破壞，T細(xì)胞的免疫功能將會增強，引起腫瘤細(xì)胞分解，從而達(dá)到治療效果[13-14]。有研究表明[15]，PD-L1、PD-1能夠廣泛表達(dá)在多種腫瘤組織中，但PD-L1、PD-1在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性尚待商榷。本研究結(jié)果顯示，PD-L1、PD-1高表達(dá)患者總生存期和無進(jìn)展生存期表達(dá)率與PD-L1、PD-1中度表達(dá)和低表達(dá)患者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。T4期結(jié)直腸癌組織及周圍轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)患者中檢測到分別有54例PD-L1和PD-1表達(dá)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級對PD-L1、PD-1表達(dá)存在影響。文獻(xiàn)[16]與本研究結(jié)果一致，PD-L1的表達(dá)能夠作為腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果初步證實了PD-L1、PD-1可能成為結(jié)直腸癌治療的關(guān)鍵靶點。PD-L1不僅能夠作為PD-1的配體在腫瘤環(huán)境中發(fā)揮作用，還能夠傳遞負(fù)性信號，阻止腫瘤細(xì)胞凋亡并抵抗細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解。同時，PD-L1還具有誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭及相關(guān)的抗原提呈細(xì)胞功能的缺失，聚集調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用[17]。有研究顯示PD-1、PD-L1通路不僅能夠調(diào)節(jié)腫瘤免疫，同時在腫瘤發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。最近，有學(xué)者通過研究PD-1在黑色素瘤細(xì)胞表面的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，這些黑色素瘤細(xì)胞能夠通過激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路來促進(jìn)自身增殖[18]。

綜上所述，PD-L1、PD-1表達(dá)在結(jié)直腸癌中上調(diào)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為轉(zhuǎn)移、侵襲性結(jié)直腸癌的新型生物標(biāo)志物發(fā)揮其重要作用。