陸 丹，周雪婷，陳雨婷，魏 望，曹宇杰，薛 魁

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬邳州市人民醫(yī)院檢驗科，江蘇邳州 221300

感染性疾病是臨床常見疾病之一，嚴重危害人類健康。對于重癥感染患者，若病情未能得到及時控制，可導(dǎo)致多器官功能障礙、感染性休克甚至死亡，而早期應(yīng)用敏感抗菌藥物治療是控制病情的關(guān)鍵舉措[1]。除了規(guī)范抗菌藥物使用之外，病原菌的快速、有效鑒定顯得尤為重要，對患者的生存率和病死率有著重要影響[2]。目前，微生物實驗室對臨床可疑感染標本的病原菌檢測多基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、分離培養(yǎng)及生化反應(yīng)，操作煩瑣且周期較長；基于分子的生物學(xué)技術(shù)不需要微生物的培養(yǎng)生長，比傳統(tǒng)方法更具優(yōu)勢，但由于該技術(shù)對人員要求較高，且成本較高，難以在各種類型的實驗室開展，大規(guī)模應(yīng)用可能受到限制[2]。近年來，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)，以其快速、高通量、高效率、低成本的特點，徹底改變了臨床微生物實驗室的微生物鑒定方法，使臨床微生物學(xué)的鑒定發(fā)生了革命性變化[3]。Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)為當今市場諸多MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析系統(tǒng)之一，由鄭州安圖生物有限公司生產(chǎn)，因此，本研究旨在通過對本院臨床分離菌株進行鑒定，以評價Autof MS 1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)在微生物實驗室的鑒定能力，為其能否在各實驗室開展提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院2020年9月至2021年5月分離自臨床的常見非重復(fù)菌株共190株。其中革蘭陽性需氧菌58株，革蘭陰性需氧菌93株，厭氧菌6株，酵母樣真菌33株。

1.2儀器與試劑 Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)及配套試劑購自鄭州安圖生物有限公司；VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及配套鑒定卡購自法國生物梅里埃有限公司。

1.3質(zhì)控菌株 質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌 ATCC 25922、金黃色葡萄球菌 ATCC 29213、腸球菌ATCC 29212、白色假絲酵母菌ATCC 14053均由鄭州安圖生物有限公司提供。

1.4方法

1.4.1VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定 對分離培養(yǎng)得到的純菌落進行涂片及革蘭染色，根據(jù)菌落形態(tài)和染色結(jié)果選擇相應(yīng)的配套鑒定卡上機檢測，嚴格按照說明書規(guī)范操作?？尚哦?90% 的唯一鑒定結(jié)果為可接受結(jié)果。

1.4.2Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定 對分離培養(yǎng)得到的純菌落使用直涂法或甲酸涂布法上機檢測，嚴格按照說明書規(guī)范操作。質(zhì)譜鑒定結(jié)果以分數(shù)表示，分數(shù)為0.0～10.0分。得分區(qū)間為9.5～10.0分表示該結(jié)果種水平可信；得分區(qū)間為9.0～<9.5分表示該結(jié)果屬水平可信，種水平參考；得分區(qū)間為6.0～<9.0分表示該結(jié)果屬水平參考，需結(jié)合其他鑒定方法驗證；得分區(qū)間為0.0～<6.0分表示該結(jié)果不可信。本研究Autof MS1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果可信水平>9.0分為可接受結(jié)果。

1.4.3鑒定結(jié)果分析 以實驗室已有的VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果為參比結(jié)果，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)和VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果不一致的菌株、Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)或VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)未鑒定出或鑒定結(jié)果不可信的菌株首先應(yīng)用上述兩種方法重復(fù)鑒定，結(jié)果仍不可接受的送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行細菌16SrDNA測序或真菌ITS區(qū)測序，以測序結(jié)果為“金標準”[4]。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1菌株分布及鑒定結(jié)果 本研究共納入190株菌株，分別分離自痰液、血液、尿液、腦脊液、胸腔積液、腹水、傷口分泌物、膿液等標本，覆蓋本院80%～90%常見病原菌。其中革蘭陽性需氧菌58株，包括葡萄球菌屬30株，鏈球菌屬15株，腸球菌屬7株，棒桿菌屬3株，諾卡菌屬2株，芽孢桿菌屬1株；革蘭陰性需氧菌93株，包括腸桿菌科細菌50株，非發(fā)酵菌及其他少見革蘭陰性需氧菌43株；厭氧菌6株；酵母樣真菌33株。在190株分離株中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)可將180株(94.7%)鑒定至種，分數(shù)均>9.0分；VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)可將179株(94.2%)鑒定至種，可信度均>90%。Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)與VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)相比，在種水平上一致的有166株(87.4%)，在屬水平上一致的有20株(10.5%)，完全不一致或未鑒定出結(jié)果的有4株(2.1%)。其中58株革蘭陽性需氧菌中，種水平鑒定一致的有51株(87.9%)，屬水平鑒定一致的有5株(8.6%)，2株VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)未鑒定出(3.4%)；93株革蘭陰性需氧菌中，種水平鑒定一致的有80株(86.0%)，屬水平鑒定一致的有12株(12.9%)，1株Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)與VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)均未鑒定出(1.1%)；6株厭氧菌中，種水平鑒定一致的有4株(66.7%)，屬水平鑒定一致的有2株(33.3%)；33株酵母樣真菌中，種水平鑒定一致的有31株(93.9%)，屬水平鑒定一致的有1株(3.0%)，1株VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)未鑒定出(3.0%)。

2.2結(jié)果不一致分析 本次分析的190株菌株中，共有24株(12.6%)鑒定結(jié)果在種水平上不一致。其中20株(10.5%)在屬水平上一致，3株(1.6%)VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)未鑒定出，1株(0.5%)VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)均未鑒定出。見表1。以測序結(jié)果為“金標準”，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)的準確率為70.8%(17/24)，VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)的準確率為45.8%(11/24)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩種系統(tǒng)鑒定結(jié)果不一致或無鑒定結(jié)果的比較分析

續(xù)表1 兩種系統(tǒng)鑒定結(jié)果不一致或無鑒定結(jié)果的比較分析

2.3鑒定總準確率分析 190株菌株中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定總準確率[93.2%(177/190)]略高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定總準確率[90.0%(171/190)]，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其中Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)革蘭陽性需氧菌鑒定準確率為94.8%(55/58)，略高于革蘭陰性需氧菌鑒定準確率(89.2%，83/93)；厭氧菌鑒定準確率為100.0%(6/6)；酵母樣真菌鑒定準確率為100.0%(33/33)。見表2。

表2 兩個系統(tǒng)對臨床分離病原菌鑒定準確率的比較分析[%(n/n)]

3 討 論

目前臨床病原菌的鑒定主要依靠傳統(tǒng)的表型鑒定及分子生物學(xué)鑒定。傳統(tǒng)的表型鑒定包括細菌的分離培養(yǎng)、菌落形態(tài)及生理生化反應(yīng)等，操作煩瑣，周期較長且靈敏度及特異度低。此外，有些細菌較難培養(yǎng)，容易造成病原菌的漏檢或誤檢，影響臨床治療。近年來，分子生物學(xué)的快速發(fā)展極大縮短了鑒定周期，其快速、特異度高、靈敏度高及準確率高等優(yōu)勢為臨床感染性疾病的診治提供新的思路。分子生物學(xué)鑒定包括基于核酸水平的檢測，如實時熒光定量PCR、限制性片段長度多態(tài)性分析、基因芯片、DNA測序等，以及蛋白水平的檢測，如MALDI-TOF MS技術(shù)[5-6]。MALDI-TOF MS技術(shù)能通過鑒別微生物不同質(zhì)量蛋白獲得蛋白指紋圖譜，通過與數(shù)據(jù)庫信息比對，篩選并確定相應(yīng)圖譜，進而得到鑒定結(jié)果，從而實現(xiàn)對不同細菌種、屬的鑒定，快速、準確且成本低，被認為是基因測序的可替代方法[7]。

目前法國生物梅里埃等多家公司的質(zhì)譜系統(tǒng)已常規(guī)用于實驗室病原菌的檢測。近年來，國產(chǎn)Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)在臨床工作中的優(yōu)勢也逐漸顯現(xiàn)出來，本研究旨在通過對本院常見臨床病原菌的鑒定來評價該系統(tǒng)的鑒定能力。

本研究結(jié)果顯示，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定總準確率略高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定總準確率，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其中Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對革蘭陽性需氧菌鑒定準確率略高于革蘭陰性需氧菌鑒定準確率；24株種水平不一致或未鑒定出結(jié)果的菌株中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定準確率為70.8%，高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定的準確率(45.8%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

58株革蘭陽性需氧菌中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定準確率略高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)。Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對葡萄球菌屬、腸球菌屬的鑒定準確率為100.0%，對肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌及口腔鏈球菌的鑒定能力相對較差，但因標本量少，更多研究將在后續(xù)實驗中繼續(xù)驗證。之前相關(guān)研究表明，鏈球菌屬鑒定準確率低的原因可能是細菌之間親緣關(guān)系較近、同源性較高進而導(dǎo)致蛋白峰差異不明顯的緣故[8]。因此在臨床工作中，應(yīng)結(jié)合其他輔助方法如奧普托欣敏感試驗做出正確判斷。2株諾卡菌屬VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)均未鑒定出結(jié)果，而Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)則100.0%鑒定，說明Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對一些臨床罕見菌的準確鑒定優(yōu)勢明顯。

93株革蘭陰性需氧菌中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定準確率略高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)。Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對陰溝腸桿菌復(fù)合群及鮑曼不動桿菌不能正確鑒定至種，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)將陰溝腸桿菌鑒定為陰溝/阿氏腸桿菌和霍氏腸桿菌，將鮑曼不動桿菌鑒定為醋酸鈣不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌。分析原因可能為細菌親緣關(guān)系近，蛋白高度相似，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)不能準確區(qū)分至種或亞種，必要時需輔以其他試驗確認，如通過實時熒光定量PCR擴增dnaJ基因可將陰溝腸桿菌復(fù)合群鑒定至種[9]。對于1株沙門菌，VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)均只能鑒定至屬，需輔以血清凝集試驗進一步鑒定至種或亞種。以上均是導(dǎo)致革蘭陰性需氧菌的鑒定準確率低于革蘭陽性需氧菌的原因。對于其他腸桿菌科細菌、非發(fā)酵菌及臨床少見革蘭陰性桿菌，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)均能正確鑒定。特別是本次鑒定的馬耳他布魯菌，作為一種潛在的生物恐怖病原菌，容易導(dǎo)致實驗室獲得性感染，對人具有極強的致病力，因此，早期鑒定對于生物安全防護、規(guī)避風(fēng)險至關(guān)重要。Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)和VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)均未鑒定出鹵代二氫鹽單胞菌，經(jīng)分析與數(shù)據(jù)庫不完整、Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)中不存在其標準圖譜有關(guān)，需要廠家及時擴展更新。但值得注意的是，數(shù)據(jù)庫中已知典型微生物的數(shù)量只占全球多樣性的一小部分，因此在嚴格意義上現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫永遠不可能是完整的。在臨床微生物學(xué)中，雖然對與人體相關(guān)微生物的認識已經(jīng)達到了很高的水平，但由于存在地區(qū)差異性及來源多樣性等問題，仍然需要不斷研究和完善[10]。

厭氧菌因其生長緩慢、生長條件苛刻等因而在臨床鑒定中相對困難。本研究中Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)將6株厭氧菌均正確鑒定至種，其準確率明顯高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)，且顯著減少了標本周轉(zhuǎn)時間，優(yōu)勢明顯。由于納入菌株數(shù)量少不足以評價，需在后期實驗中加大標本量繼續(xù)予以評估。但已有研究表明，在鑒定已知138株脆弱擬桿菌的分析評價中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)相比其他一些鑒定系統(tǒng)在種水平上有更高的準確率[11]。

近期，有研究表明，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對其鑒定能力異常突出，鑒定準確率明顯優(yōu)于VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)，尤其對于一些罕見的酵母樣真菌[12]。本研究結(jié)果顯示，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對33株酵母樣真菌的鑒定準確率高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定準確率，對于少見菌如平常假絲酵母菌、皮瘤毛孢子菌亦能正確鑒定，雖然納入菌株數(shù)量有限，仍需進一步研究，但Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對酵母樣真菌的鑒定價值初步體現(xiàn)。

本研究顯示，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)與VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)的鑒定結(jié)果較為一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定時間短、操作簡單、成本較低，特別對臨床罕見菌鑒定效果尤為突出，明顯優(yōu)于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)，這與文獻[13-14]報道結(jié)果一致。同時，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)具有中國本土化的菌株蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，更適合中國用戶，適合在國內(nèi)實驗室推廣使用。

MALDI-TOF MS技術(shù)是近年來迅速興起的新型微生物鑒定技術(shù)，及時、準確地鑒定病原菌能夠減少周轉(zhuǎn)時間、快速提供細菌學(xué)診斷，早期合理地進行干預(yù)治療，有利于減少細菌耐藥、控制病情、改善預(yù)后[15-16]。對于一些致病性強的病原菌，MALDI-TOF MS技術(shù)能夠在不到1 h之內(nèi)知曉結(jié)果，對于生物安全防范至關(guān)重要。盡管MALDI-TOF MS技術(shù)優(yōu)勢明顯，但因為技術(shù)的局限性，仍存在不足之處。首先，質(zhì)譜技術(shù)對檢測藥物敏感性試驗的方法尚未應(yīng)用于常規(guī)檢測[17]，鑒定結(jié)果上報臨床后，需根據(jù)當?shù)氐募毦退帞?shù)據(jù)初步選擇抗菌藥物，最后藥敏結(jié)果仍依賴傳統(tǒng)的藥敏實驗。但鑒于其較高的種屬符合率，可作為初級報告上報臨床，滿足臨床早期診斷的需求[18]。其次，細菌的正確鑒定很大程度上取決于數(shù)據(jù)庫的完整性，需要不斷地擴展和更新。此外，質(zhì)譜技術(shù)目前只能鑒定單一菌落，關(guān)于混合感染情況下的質(zhì)譜鑒定有待進一步研究。最后，一些鑒定前因素也影響質(zhì)譜鑒定結(jié)果，如培養(yǎng)基成分、多次傳代培養(yǎng)、培養(yǎng)溫度、黏液型菌落、涂布菌量的多少等[8]。因此，規(guī)范操作、排除客觀因素的影響對于病原菌的正確鑒定至關(guān)重要。

總之，MALDI-TOF MS技術(shù)是現(xiàn)代微生物學(xué)上的巨大變革，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)作為國產(chǎn)質(zhì)譜系統(tǒng)滿足臨床對微生物鑒定的需求，建議在實驗室推廣使用。但由于本研究室質(zhì)譜技術(shù)開展時間相對較短，故而納入研究菌株數(shù)量有限，后期將加大標本量繼續(xù)驗證?？紤]到每種方法都有其局限性，因此，多種檢測方法的聯(lián)合應(yīng)用可為臨床快速、可靠的診斷提供依據(jù)。