蘇曉燕，韓步鷹，孟玉瓊，白曉易，李長(zhǎng)忠，馬 睿

( 1.青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016； 2.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016 )

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)屬鮭形目、鮭科，是一種養(yǎng)殖范圍較廣的冷水性魚類[1]。青海省處三江源低氧高海拔地區(qū)，水資源豐富，水質(zhì)純凈，主要以三倍體虹鱒養(yǎng)殖為主[2]，三倍體虹鱒特殊性在于性腺不發(fā)育，具有生長(zhǎng)快、周期短、肉質(zhì)好、高產(chǎn)、高效、市場(chǎng)廣闊等特點(diǎn)，被廣泛養(yǎng)殖[3]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)是檢測(cè)基因表達(dá)的重要方法[4]，操作靈敏、特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、檢驗(yàn)范圍廣，廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[5-6]。使用熒光定量對(duì)某一目的基因在不同組織中表達(dá)量進(jìn)行比較時(shí)，提取不同組織中RNA濃度的不同、反轉(zhuǎn)錄為cDNA效率不同等因素會(huì)影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性[7-12]，通常需選擇合適的內(nèi)參基因?qū)Υ嬖诘恼`差進(jìn)行校準(zhǔn)，選擇適宜的內(nèi)參基因或組合是精確計(jì)算目的基因表達(dá)水平且進(jìn)行基因功能研究的關(guān)鍵[13-17]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在不同組織中穩(wěn)定表達(dá)[18-19]，但絕對(duì)理想的內(nèi)參基因是不存在的，任何一種內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達(dá)都是相對(duì)的[20]。吳萍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)成魚不同組織中18S rRNA和GAPDH基因的平均穩(wěn)定值最低，相對(duì)表達(dá)量最穩(wěn)定；Ma等[22]研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒不同組織中，β-actin基因平均穩(wěn)定值最低，在虹鱒皮膚中穩(wěn)定表達(dá)； Reveco等[23]的研究表明，虹鱒在低氧應(yīng)激影響及投喂大豆替代飼料與正常飼養(yǎng)對(duì)比下，rpl8與ef1-α基因在虹鱒后腸中穩(wěn)定表達(dá)；Olsvik等[24]對(duì)大西洋鮭(Salmosalar)8種組織6個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的研究顯示，ef1-αA基因在肝臟、肌肉、鰓、頭腎、脾臟、胸腺中表達(dá)最穩(wěn)定，ef1-αB和β-actin基因在腦和腸中表達(dá)最穩(wěn)定。內(nèi)參基因的表達(dá)情況并非具有一致性[25]，因此在進(jìn)行三倍體虹鱒不同組織某種目的基因的表達(dá)水平變化研究時(shí)，選擇一個(gè)或多個(gè)內(nèi)參基因作為參考尤為重要。

基因表達(dá)分析時(shí)常用的內(nèi)參基因主要包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(gapdh)、核糖體大亞基蛋白基因(rplp2)、真核延伸因子基因(ef1-α)、β-肌動(dòng)蛋白基因(β-actin)、18S核糖體RNA(18S rRNA)等。甘油醛-3-磷酸脫氫酶是一種典型的糖酵解酶，是一種廣泛存在于各組織細(xì)胞中的多功能蛋白[26]；核糖體大亞基蛋白是細(xì)胞內(nèi)核糖體的主要構(gòu)成成分之一，屬于核糖體蛋白[27]；真核延伸因子是一種構(gòu)建核苷酸序列的啟動(dòng)子，具有調(diào)控肌動(dòng)蛋白組裝微絲的功能[28]；β-肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞中的一種重要骨架蛋白[29]；18S rRNA是真核生物體內(nèi)含量最多的核糖體RNA[30]。以上基因幾乎在所有組織中高水平表達(dá)，在相同的組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)量一般是恒定的，被廣泛用作標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參基因。

內(nèi)參基因的穩(wěn)定性直接關(guān)系到定量PCR分析的穩(wěn)定可靠性。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，目前廣泛使用的內(nèi)參基因篩選軟件有GeNorm軟件、NormFinder軟件、Best-Keeper軟件等。GeNorm軟件通過計(jì)算每個(gè)內(nèi)參基因平均表達(dá)穩(wěn)定值(M)，篩選出穩(wěn)定性好的內(nèi)參基因[31]；NormFinder軟件計(jì)算原理與GeNorm相似，通過計(jì)算內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值，篩選最適內(nèi)參基因，表達(dá)穩(wěn)定值越小的內(nèi)參基因?yàn)樽钸m內(nèi)參基因[32]；Best-Keeper軟件是針對(duì)內(nèi)參基因和目的基因表達(dá)量分析的程序[33]。

筆者以三倍體虹鱒不同組織為試驗(yàn)材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析β-actin、ef1-α、18S rRNA、gapdh和rplp2 5個(gè)內(nèi)參基因在三倍體虹鱒不同組織中的表達(dá)水平，通過Best-Keeper、NormFinder、GeNorm軟件分析5個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，選出適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因，以期為三倍體虹鱒的基因表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)用三倍體虹鱒取自青海省海南州龍羊峽三倍體虹鱒養(yǎng)殖基地，選擇體質(zhì)量約800 g的三倍體虹鱒6尾，用丁香酚(1∶10000)麻醉后，采用尾靜脈采血法抽取血液，之后剖取腦、眼、鰓、皮膚、心臟、腎臟(頭腎、中腎、后腎)、肝臟、脾臟、胃、幽門垂、腸(前腸、中腸、后腸)以及肌肉(紅肌、白肌、肌間隔)。采集的19個(gè)組織樣品迅速在液氮中速凍后置于-80 ℃保存。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

參照總RNA提取試劑盒(TAKARA，中國(guó))說明書提取剖取的三倍體虹鱒不同組織總RNA，提取結(jié)束后，利用超微量核酸蛋白測(cè)定儀(IMPLEN，德國(guó))和1%凝膠電泳對(duì)RNA的質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，中國(guó))說明書對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選內(nèi)參基因引物設(shè)計(jì)與合成

本試驗(yàn)選擇5個(gè)內(nèi)參基因作為三倍體虹鱒候選內(nèi)參基因，根據(jù)魚類同源基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，篩選可擴(kuò)增出特異DNA片段的基因引物進(jìn)行后續(xù)的候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析。篩選的5個(gè)候選內(nèi)參基因分別為β-actin、ef1-α、gapdh、rplp2和18S rRNA(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 候選內(nèi)參基因引物序列Tab.1 Primer information on candidate genes

1.4 三倍體虹鱒候選內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[34]的方法測(cè)定，分別將三倍體虹鱒各組織cDNA混合液(稀釋5倍)作為模板，對(duì)候選內(nèi)參基因引物進(jìn)行特異性檢測(cè)分析，PCR反應(yīng)體系：雙蒸水7 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(TAKARA，中國(guó))10 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.5 三倍體虹鱒候選內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR基因擴(kuò)增

將不同組織的cDNA稀釋5倍作為模板，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Light Cycler 384， ROCHE，瑞士)對(duì)所有候選內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(TAKARA，中國(guó))5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，雙蒸水3.4 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 s，50次循環(huán)；于70～95 ℃收集熔解曲線熒光信號(hào)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用GeNorm、NormFinder、Best-Keeper分析各候選內(nèi)參基因在三倍體虹鱒不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品RNA檢測(cè)

對(duì)提取的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，28S和18S條帶清晰，部分5S條帶隱約可見，完整性良好。超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定所有待測(cè)樣品RNA質(zhì)量濃度在200～1000 ng/μL間，吸光度1.8～2.0，滿足后續(xù)試驗(yàn)需求。

圖1 三倍體虹鱒19種組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from 19 tissues of triploid rainbow troutM.DNA標(biāo)記DL 2000； 1.腦； 2.眼睛； 3.鰓； 4.皮膚； 5.心臟； 6.頭腎； 7.中腎； 8.后腎； 9.肝臟； 10.脾臟； 11.胃； 12.幽門垂； 13.前腸； 14.中腸； 15.后腸； 16.紅肌； 17.白肌； 18.肌間隔； 19.血液.M.DL 2000 DNA marker; 1.brain; 2.eye; 3.gill; 4.skin; 5.heart; 6.head kidney; 7.middle kidney; 8.metanephros; 9.liver; 10.spleen; 11.stomach; 12.pylorus; 13.fore-gut; 14.mid-gut; 15.hindgut; 16.red muscle; 17.white muscle; 18.inter-muscular septum; 19.blood.

2.2 內(nèi)參基因引物特異性熔解曲線分析

將5個(gè)候選內(nèi)參基因的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析(圖2)。由圖2可見，熔解曲線呈現(xiàn)單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，沒有引物二聚體，引物特異性較好，熔解曲線能準(zhǔn)確地反映目的基因擴(kuò)增結(jié)果的變化，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

圖2 候選內(nèi)參基因溶解曲線Fig.2 Melting curve of candidate reference genes

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR Ct值比較

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，不同基因在對(duì)應(yīng)的組織中表達(dá)豐度與Ct值的大小成反比，即Ct值越大，該基因在對(duì)應(yīng)的組織中表達(dá)豐度就越低；反之，表達(dá)豐度就越高。rplp2基因Ct平均值最大，為26.33；其次為gapdh基因，在各個(gè)組織中Ct平均值為25.34；ef1-α基因在各個(gè)組織中Ct平均值為20.15；β-actin基因各個(gè)組織中Ct平均值為17.97；18S rRNA在各個(gè)組織中Ct平均值最小，為16.68(圖3)。試驗(yàn)結(jié)果表明，5個(gè)候選內(nèi)參基因在三倍體虹鱒的不同組織中表達(dá)量不同。

圖3 候選內(nèi)參基因在不同組織中的Ct值比較Fig.3 Ct value comparison of all candidate reference genes in different tissuesB.腦； E.眼睛； G.鰓； SK.皮膚； H.心臟； HK.頭腎； Me.中腎； Met.后腎； L.肝臟； S.脾臟； ST.胃； P.幽門垂； F.前腸； MI.中腸； HI.后腸； RM.紅?。?WM.白??； IS.肌間隔； BL.血液.B.brain; E.eye; G.gill; SK.skin; H.heart; HK.head kidney; Me.mesonephros; Met.metanephros; L.liver; S.spleen; ST.stomach; P.pyloric caeca; F.fore-gut; MI.mid-gut; HI.hind-gut; RM.red muscle; WM.white muscle; IS.inter-muscular septum; BL.blood.

2.4 GeNorm軟件分析結(jié)果

GeNorm軟件計(jì)算候選內(nèi)參基因在三倍體虹鱒不同組織中的平均表達(dá)穩(wěn)定值M(圖4)和配對(duì)差異值V(圖5)，5個(gè)候選內(nèi)參基因的M值依次為rplp2=β-actinef1-α>18S rRNA>gapdh。通過配對(duì)差異值(Vn/Vn+1)確定內(nèi)參基因數(shù)，n值為所需內(nèi)參基因的最佳數(shù)目，由圖5可見，V2/V3值最小，最適內(nèi)參基因數(shù)目為2。綜合M和Vn/Vn+1值，rplp2和β-actin是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

圖4 GeNorm分析候選內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定值Fig.4 Average expression stability value of candidate reference genes analyzed by GeNorm software

圖5 GeNorm程序分析最適內(nèi)參基因數(shù)目Fig.5 Analysis of the optimal number of the reference genes using GeNorm software

2.5 NormFinder軟件分析結(jié)果

NormFinder軟件計(jì)算候選內(nèi)參基因在三倍體虹鱒不同組織的平均表達(dá)穩(wěn)定值(圖6)，5個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值依次為rplp2=β-actinef1-α>18S rRNA>gapdh。

圖6 NormFinder分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值Fig.6 Average expression stability value of candidate reference genes analyzed by NormFinder software

2.6 Best-Keeper軟件分析結(jié)果

Best-Keeper可以計(jì)算每個(gè)內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)(r)、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。通過比較各值的大小，確定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性(表2)。

表2 Best-Keeper對(duì)候選內(nèi)參基因統(tǒng)計(jì)分析Tab.2 Descriptive statistics of the candidate reference genes using Best-Keeper software

由表2可見，5個(gè)候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差依次為rplp21時(shí)，則該內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定。根據(jù)Best-Keeper判定原則，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)綜合分析表明，rplp2基因穩(wěn)定性最佳。

3 討 論

3.1 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

本研究中，所有引物的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增特異性均較好，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有很高的質(zhì)量和好的引物特異性，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析5個(gè)候選內(nèi)參基因在三倍體虹鱒不同組織中表達(dá)情況，且通過NormFinder、GeNorm、Best-Keeper軟件對(duì)5個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。GeNorm軟件是專門用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR中篩選內(nèi)參基因及確定最適內(nèi)參基因數(shù)目的程序，最終選擇兩個(gè)或兩個(gè)以上合適的內(nèi)參基因來校正數(shù)據(jù)，GeNorm是通過計(jì)算每個(gè)基因穩(wěn)定性的M值來篩選穩(wěn)定性好的內(nèi)參基因，計(jì)算出的M值與內(nèi)參基因的穩(wěn)定性成負(fù)相關(guān)，通過計(jì)算內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異V值，根據(jù)Vn/Vn+1的比值確定最適內(nèi)參基因的數(shù)目，n值為所需內(nèi)參基因的最佳數(shù)目，本研究中，結(jié)合GeNorm軟件分析所得M值與V值，最終得出最適內(nèi)參基因?yàn)棣?actin和rplp2。NormFinder是另一種篩選最適穩(wěn)定性內(nèi)參基因的軟件，其判定標(biāo)準(zhǔn)與GeNorm相同，根據(jù)M值大小判定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，本研究中NormFinder分析最終得出最適內(nèi)參基因?yàn)閞plp2與β-actin。Best-Keeper是針對(duì)內(nèi)參基因和內(nèi)參基因表達(dá)分析的程序，可以計(jì)算每個(gè)基因之間產(chǎn)生配對(duì)的相關(guān)系數(shù)r，標(biāo)準(zhǔn)偏差與變異系數(shù)，通過比較各個(gè)值的大小最終確定穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因，判定標(biāo)準(zhǔn)為相關(guān)系數(shù)越大，標(biāo)準(zhǔn)偏差和相關(guān)系數(shù)越小，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好；反之，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越差。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差>1時(shí)，該內(nèi)參基因越不穩(wěn)定[35]。本研究中經(jīng)Best-Keeper軟件分析得出rplp2穩(wěn)定性最好。本研究中Best-Keeper最終分析結(jié)果與GeNorm和NormFinder分析結(jié)果不同，原因是Best-Keeper軟件是直接通過Ct值進(jìn)行配對(duì)相關(guān)分析，依賴于反應(yīng)原始數(shù)據(jù)，對(duì)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序沒有GeNorm軟件和NormFinder軟件有效，一般用其對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行初步篩選[36]。

3.2 不同組織內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

根據(jù)3種軟件統(tǒng)計(jì)分析得出rplp2與β-actin內(nèi)參基因在三倍體虹鱒各組織中表達(dá)最穩(wěn)定。類似的結(jié)果在其他魚類的研究中也有報(bào)道，茅華華等[37]研究發(fā)現(xiàn)，斑鱧(Channamaculata)成魚不同組織中β-actin基因最穩(wěn)定；費(fèi)越越等[38]研究發(fā)現(xiàn)，健康異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)不同組織中，ef1-α與β-actin基因表達(dá)最穩(wěn)定；董捷等[39]研究發(fā)現(xiàn)，草魚(Ctenopharyngodonidella)不同組織中，β-actin基因與18S rRNA表達(dá)最穩(wěn)定；McCurley等[40]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(Daniorerio)不同組織中，18S rRNA、rpl-13α和ef1-α基因表達(dá)最穩(wěn)定；Ingerslev等[41]對(duì)大西洋鮭的研究發(fā)現(xiàn)，3種常見內(nèi)參基因β-actin、ef1-α、RPS20，在不同組織中表達(dá)均有變化，其中ef1-α相對(duì)穩(wěn)定可以作為內(nèi)參基因；武夢(mèng)斌等[42]研究發(fā)現(xiàn)，在達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)成魚不同組織中ef1-α表達(dá)最穩(wěn)定，不同發(fā)育卵巢中rpl8表達(dá)最穩(wěn)定；孫海成等[43]研究發(fā)現(xiàn)，尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewarti)不同組織中rpl13基因表達(dá)最穩(wěn)定；Ma等[44]研究發(fā)現(xiàn)，許氏平鲉(Sebastodsschlegelii)不同組織中rpl17為穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在鱖魚(Sinipercachuatsi)、大西洋鮭和普通二倍體虹鱒的研究中，β-actin為穩(wěn)定的內(nèi)參基因[24,45-46]。說明內(nèi)參基因在不同的物種之間表達(dá)存在差異。

3.3 不同試驗(yàn)條件候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

另外，研究結(jié)果表明，在不同的組織、細(xì)胞、細(xì)胞增殖和器官發(fā)育所處的不同階段、體外培養(yǎng)、各種試驗(yàn)條件等情況下內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性不同。大西洋鮭中內(nèi)參基因ef1-f穩(wěn)定性最好，gapdh穩(wěn)定性最差[26,41,47]；在斑馬魚[40,48]的研究中發(fā)現(xiàn)，在不同生長(zhǎng)階段和不同組織中，ef1-α和βf1-α是穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，而且發(fā)現(xiàn)在不同性別的試驗(yàn)動(dòng)物中，內(nèi)參基因表達(dá)也不同；Shekh等[46]研究發(fā)現(xiàn)，β-actin在虹鱒皮膚中是最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因；Ma等[22]發(fā)現(xiàn)，虹鱒在熱應(yīng)激下，β-actin和ef1-f分別是肝臟和頭腎中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?？傊?，不同試驗(yàn)對(duì)象以及不同的試驗(yàn)處理對(duì)內(nèi)參基因的選擇有很大的影響，因此，內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性分析對(duì)于研究目的基因的表達(dá)具有重要意義。

3.4 多內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

一些試驗(yàn)對(duì)基因表達(dá)定量準(zhǔn)確度有較高的要求，單個(gè)內(nèi)參基因無法很好地起到校準(zhǔn)作用，需要兩個(gè)及以上的表達(dá)量穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn)[49]。在大西洋鮭8種不同組織中，6種內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性依次為ef1-αB(0.42)>ef1-αA(0.43)>β-actin(0.48)> rps20(0.5)>18S rRNA(0.56)>gapdh(0.6)，研究者建議使用ef1-αB與ef1-αA作為內(nèi)參基因[24]；斑馬魚的8種候選內(nèi)參基因分析結(jié)果顯示，tuba1、β-actin、ef1-α的穩(wěn)定性較高，建議可以在斑馬魚用作內(nèi)參基因[40]；藍(lán)點(diǎn)馬鮫(Scomberomorusniphonius)11種不同組織中4種內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)閑f1-α(0.393)>18S rRNA(0.406)>β-actin(0.44)>gapdh(0.630)[50]；健康異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)8個(gè)不同組織中4種內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性依次為β-actin(0.404)=ef1-α(0.404)>18S rRNA(1.501)>gapdh(1.885)，建議使用β-actin與ef1-α作為適宜內(nèi)參基因[38]；卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)8個(gè)不同組織中8個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)?8S rRNA=B2M(1.2)>rpl13(1.8)>UBCE(2)>β-actin(2.4)>ef1-α(2.6)>gapdh(2.8)>TTLL1(3.0)，建議使用18S rRNA與B2M作為內(nèi)參基因[51]。而本研究中，5個(gè)候選內(nèi)參基因在三倍體虹鱒19個(gè)不同組織中rplp2與β-actin最穩(wěn)定，建議作為三倍體虹鱒不同組織中的內(nèi)參基因，與上述研究部分相似，均選取兩個(gè)基因作為適宜的內(nèi)參基因，是因?yàn)殡p內(nèi)參組合能更加準(zhǔn)確地分析目的基因在不同組織的相對(duì)表達(dá)量，可以確保目的基因相對(duì)表達(dá)結(jié)果的可靠性，并且采用雙內(nèi)參基因組合，可以提高試驗(yàn)結(jié)果的精確度。

4 結(jié) 論

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合3種穩(wěn)定性分析軟件GeNorm、NormFinder、Best-Keeper對(duì)5個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，rplp2與β-actin在三倍體虹鱒不同組織中表達(dá)較為穩(wěn)定，同時(shí)使用兩個(gè)內(nèi)參基因作為研究三倍體虹鱒基因表達(dá)水平的內(nèi)參基因，可提高結(jié)果的準(zhǔn)確度，從而最大限度反映目的基因真實(shí)的表達(dá)水平，為后續(xù)三倍體虹鱒相關(guān)基因的定量表達(dá)分析提供參考依據(jù)。