劉肖蓮，李春艷，白曉慧，郝 爽，劉國山，劉克明，馬 林，姜巨峰

( 天津市水產(chǎn)研究所，天津市觀賞魚技術(shù)工程中心，天津 300221 )

草金魚(Carassiusauratus)，又名紅鯽或金鯽，是金魚中最古老的一種，體形和尾鰭與普通鯽魚相似，體色有紅色、五花等。該品種抗病力和適應(yīng)性強，耐低溶解氧，養(yǎng)殖難度低，投入成本小，回報率高，是發(fā)展都市農(nóng)業(yè)、開發(fā)休閑漁業(yè)、保證漁民增收的理想養(yǎng)殖品種之一。草金魚中有一類為透明草金魚，因鳥糞素缺失，其頭部、鱗片和身體均為透明，內(nèi)臟和骨骼清晰可見。研究發(fā)現(xiàn)，鳥糞素并非真正的有色物質(zhì)，而是與水結(jié)合成晶體形式的嘌呤，能將光線從表面反射出來，當(dāng)鳥糞素缺失時，光線就能透過魚體顯示出內(nèi)部的器官[1]。由于其身體透明，與普通草金魚相比，透明草金魚具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。而目前關(guān)于草金魚的研究主要集中在飼料添加劑對體色的影響[2]以及病害致病機理研究[3-4]等方面。在體色方面，Xu等[5]對透明鯽魚和紅草金魚進行雜交和自交，通過觀察不同組合子代的體色，發(fā)現(xiàn)透明性狀對于不透明性狀來說為顯性，且透明性狀為數(shù)量性狀，推論金魚體色的遺傳機制是復(fù)雜的，需要進一步研究。

轉(zhuǎn)錄組是指在某一發(fā)育時期或特定條件下機體某組織所轉(zhuǎn)錄的全部RNA，包括信使RNA和非編碼RNA。在沒有基因組信息的情況下，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可作為對物種進行基因發(fā)掘、查找控制特異性狀的關(guān)鍵基因和了解性狀形成的分子機制的有效手段。史東杰等[6]通過對白色皮膚和紅色皮膚的錦鯉(Cyprinuscarpiovar.koi)進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)其差異表達基因富集在包括肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)/黏著斑通路在內(nèi)的132個代謝途徑。郝世鑫[7]采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究新西蘭黑金鮑(Haliotisiris)軟體獨特的黑色性狀，篩選出4個與黑色素合成代謝相關(guān)的基因。筆者對透明草金魚與不透明草金魚進行轉(zhuǎn)錄組測序，從轉(zhuǎn)錄組水平上研究透明草金魚的分子形成機制，為進一步篩選草金魚透明性狀的目的基因及創(chuàng)制透明草金魚新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用草金魚采自天津市馬永紅水產(chǎn)養(yǎng)殖合作社，于相同的飼養(yǎng)環(huán)境中隨機選取透明草金魚3尾、不透明草金魚3尾，體長為(45.00±5.42) mm。將試驗魚麻醉，刮去魚鱗后取皮膚組織，經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取、文庫構(gòu)建與測序

皮膚組織總RNA采用Trizol reagent試劑盒(Invitrogen)進行提取，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否降解，Nanodrop超微量紫外光分光光度計檢測D(260 nm)/D(280 nm)，Qubit檢測RNA質(zhì)量濃度，Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA分子完整數(shù)(RIN值)。按照TruSeq DNA Library Prep Kit (Illumina)說明書，通過cDNA合成，末端修復(fù)，連接接頭和擴增純化，得到草金魚皮膚組織cDNA文庫。建好的文庫在Illumina HiSeq4000測序平臺上進行測序(天津諾禾致源生物信息科技有限公司)。

1.3 序列拼接及功能注釋

將測序所得的原始序列中的帶接頭的和低質(zhì)量的序列去除，得到的序列稱為過濾序列。由于已發(fā)表基因組缺乏完整的基因注釋文件，故對得到的轉(zhuǎn)錄組序列進行無參分析。采用Trinity軟件對過濾序列進行拼接，選擇最長的轉(zhuǎn)錄本作為unigene。將所得的unigene與美國國立生物技術(shù)信息中心蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Nr)、美國國立生物技術(shù)信息中心核酸序列數(shù)據(jù)庫(Nt)、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(Pfam)、同源蛋白簇數(shù)據(jù)庫(KOG/COG)、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swiss-prot)、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)、基因本體論(GO)等數(shù)據(jù)庫進行比對，以獲得unigene的注釋信息。

1.4 差異基因表達分析

采用軟件Bowtie將每個樣品的過濾序列比對到組裝出來的轉(zhuǎn)錄本上，使用軟件RSEM統(tǒng)計每個樣品比對到每個基因上的read count數(shù)目，根據(jù)每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數(shù)目(FPKM)估算基因的表達水平。采用DESeq軟件篩選差異表達基因，差異基因的篩選條件為：padj<0.05且log2|Fold Change|>1。通過Goseq行差異表達基因的GO富集分析，通過KOBAS進行KEGG通路顯著性富集分析，找出差異表達基因參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.5 微衛(wèi)星分析

采用MISA軟件對獲得的unigene進行微衛(wèi)星序列的查找，其篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為：單、二、三、四、五、六堿基重復(fù)的最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與組裝

采用Illumina HiSeq4000測序平臺對透明草金魚和不透明草金魚(各3尾個體)進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序產(chǎn)出數(shù)據(jù)質(zhì)量評估情況見表1。6個樣品分別得到52 630 100、54 113 970、41 297 798、42 691 754、59 027 442、59 603 014條過濾序列，各樣品的GC含量為45.80%～47.59%，Q30堿基百分比在93.16%以上，表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)組裝分析。對測序所得序列進行轉(zhuǎn)錄本拼接，共獲得72 083個unigene，總核苷酸數(shù)為95 213 926，平均長度為1321 bp，N50為2264 nt。

表1 樣品測序產(chǎn)出數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Tab.1 Quality assessment of sequencing data output

2.2 功能注釋

將所得的unigene序列與Nr、Nt、Pfam等數(shù)據(jù)庫進行比對，發(fā)現(xiàn)有38 516個基因注釋到Nr數(shù)據(jù)庫，占總數(shù)的53.43%(表2)；69 547條序列注釋到Nt數(shù)據(jù)庫，占總數(shù)的96.48%；8545條序列在7個數(shù)據(jù)庫中均得到注釋，占總數(shù)的11.85%；70 032條序列至少在1個數(shù)據(jù)庫中得到注釋，占總數(shù)的97.15%。

表2 unigene注釋成功率統(tǒng)計Tab.2 Statistical result of unigene annotation

2.3 差異表達分析

對透明草金魚和不透明草金魚2組樣品進行差異表達分析，當(dāng)基因在2組樣品之間的表達量差異為2倍以上時，則認(rèn)為該基因在樣品間存在顯著的表達差異，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果繪制基因表達差異火山圖(圖1)。由圖1可見，透明草金魚與不透明草金魚共存在181條差異表達基因，其中上調(diào)基因66條，下調(diào)基因115條。

圖1 樣品組間基因差異表達分析火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed genes between the two groups藍(lán)色圓點表示無顯著性差異的基因，紅色圓點表示有顯著性差異的上調(diào)基因，綠色圓點表示有顯著性差異的下調(diào)基因.Blue dots represent non-differentially expressed genes, red dots represent significantly up-regulated genes, and green dots represent significantly down-regulated genes.

2.4 差異表達基因的富集

對差異基因進行GO功能注釋(圖2)。在生物學(xué)過程中，基因多富集在單有機體過程、刺激反應(yīng)、生物過程調(diào)節(jié)等方面，也有基因富集在黑素體定位、色素沉著、色素顆粒運輸?shù)菺O類別上；在細(xì)胞組成中，基因多富集在膜、色素顆粒、黑素體、肌動蛋白復(fù)合物等；在分子功能中，基因多富集在催化活性、肌動蛋白結(jié)合、水解酶活性等。

圖2 樣品組間差異表達基因GO功能注釋Fig.2 Gene ontology annotation of differentially expressed genes between the two groups

將透明草金魚和不透明草金魚的差異表達基因比對到KEGG數(shù)據(jù)庫中，進行代謝通路富集分析。選取富集最顯著的20個通路條目繪制KEGG富集散點圖(圖3)。由圖3可見，差異表達基因主要富集在MAPK信號通路、嘌呤代謝、Toll樣受體信號通路、細(xì)胞緊密連接、甘油磷脂代謝等通路中。

圖3 差異表達基因KEGG富集分析散點圖Fig.3 KEGG pathway enrichment of differentially expressed genes

2.5 微衛(wèi)星分析

從72 083個unigene中找到38 775個微衛(wèi)星位點，占unigene總數(shù)的53.79%，微衛(wèi)星位點的平均間距為2456 bp。其中復(fù)合型微衛(wèi)星4565個，單堿基重復(fù)20 918個，二堿基重復(fù)9481個，三堿基重復(fù)3236個，四堿基重復(fù)491個，五堿基重復(fù)65個，六堿基重復(fù)19個。在單核苷酸重復(fù)類型中，數(shù)量最多的重復(fù)基元是A/T(23 720個)，二堿基重復(fù)中出現(xiàn)次數(shù)最多的是AC/GT(7715個)，三堿基重復(fù)中則以AAT/ATT出現(xiàn)次數(shù)最多(662個)。

3 討 論

3.1 透明草金魚轉(zhuǎn)錄組組裝與注釋分析

3.2 透明草金魚差異表達基因功能分析

對透明草金魚皮膚和不透明草金魚皮膚的基因表達水平進行比較，發(fā)現(xiàn)181條差異表達基因，其中上調(diào)基因66條，下調(diào)基因115條。為了解差異基因的功能與代謝通路，對差異基因進行了GO功能分類與KEGG通路分析。差異基因主要富集在微管、微管結(jié)合、微管錨定、微管調(diào)控過程、蛋白質(zhì)綁定、肌動蛋白結(jié)合、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合、中間纖維、中間纖維細(xì)胞骨架、肌動蛋白復(fù)合物等條目，與虹彩細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能相吻合。虹彩細(xì)胞的反射層由折射率不同的小板有序排列而成，反射小板的主要成分是鳥嘌呤，鳥嘌呤與水結(jié)合后形成鳥嘌呤晶體，可以折射一定長度的波長。而虹彩細(xì)胞中色素顆粒的定向運動與微管、肌動蛋白有關(guān)[14]。本試驗結(jié)果與文獻[15]的研究結(jié)果一致，其對錦鯉的紅色皮膚和白色皮膚進行RNA轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)差異表達基因大多富集在細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、肌纖維和糖原磷酸化酶活性等方面。本試驗中，下調(diào)的差異表達基因Cluster-22359.15170與黑素體定位、細(xì)胞色素的沉著等功能有關(guān)，可作為候選基因?qū)ζ涔δ苓M行深入研究。KEGG通路分析結(jié)果表明，差異基因多富集在MAPK通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路、嘌呤代謝通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工通路等，這些通路上的SAR1(GTP酶)、PAK(P21活化激酶)、ACTN(肌動蛋白)、CACN(電壓依賴性鈣通道)等基因在透明草金魚皮膚中均表現(xiàn)為下調(diào)，說明這些基因可能與虹彩細(xì)胞中鳥嘌呤合成或色素顆粒轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。

對差異表達基因中差值較大的差異表達基因進行功能分析發(fā)現(xiàn)，透明草金魚中上調(diào)倍數(shù)較高的差異表達基因主要富集在tRNA鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶活性、GTP酶活性、嘌呤核苷三磷酸結(jié)合、嘌呤核苷酸結(jié)合、鳥苷酸結(jié)合、7-甲基鳥苷RNA加帽等生物學(xué)過程，這些基因參與調(diào)節(jié)了鳥嘌呤的合成，導(dǎo)致透明草金魚皮膚中虹彩細(xì)胞和鳥嘌呤的缺失，使其皮膚呈現(xiàn)透明性狀，這與Bian等[9]的研究結(jié)果一致。與不透明草金魚相比，透明草金魚中下調(diào)程度較高的差異表達基因在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性、酪氨酸代謝、微管結(jié)合、微管骨架組織、核糖核蛋白復(fù)合物的生物發(fā)生等GO條目，通常認(rèn)為，酪氨酸酶代謝是影響脊椎動物黑色素生成的主要通路，而細(xì)胞內(nèi)色素顆粒的運動與微管有關(guān)，這些基因在透明草金魚中表達下調(diào)，說明它們參與了細(xì)胞內(nèi)黑色素的合成和遷移。同時，下調(diào)程度較高的基因富集到MAPK信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗原處理和呈遞等通路，MAPK信號通路也是黑色素生成的主要通路之一，而酪氨酸酶基因家族蛋白一般通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體加工后轉(zhuǎn)運到黑色小體中參與黑色素的合成，這與下調(diào)基因富集在糖核蛋白復(fù)合物的生物發(fā)生的生物學(xué)過程也是相吻合的。富集在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗原處理和呈遞等免疫相關(guān)通路的基因在透明草金魚中顯著下調(diào)，可能與黑色素細(xì)胞中的黑色素可作為物理屏障吸收和屏蔽紫外線，保護DNA免受紫外輻射損傷有關(guān)[16]。以上差異表達基因可作為草金魚透明性狀的候選基因，對其在不同時期皮膚組織中的表達模式以及功能研究有待進一步分析。

4 結(jié) 論

采用高通量測序技術(shù)對透明草金魚與不透明草金魚的皮膚組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得72 083個unigene，通過差異表達分析篩選出181個差異基因，對差異表達基因進行GO功能注釋和KEGG通路分析，了解了差異基因有關(guān)的分子功能、生物學(xué)過程以及代謝通路，同時鑒定了38 775個微衛(wèi)星位點。試驗結(jié)果有利于進一步開展草金魚透明性狀的功能基因以及分子形成機制等研究。