楊學芳 蔡蓉

（濟川藥業(yè)集團有限公司，江蘇 泰興 225441）

蒲地藍消炎口服液是由蒲公英、苦地丁、板藍根、黃芩四味中藥配伍，經(jīng)提取、配制而成的中藥復方制劑，具有清熱解毒，消腫利咽的功效，主要用于癤腫、腮腺炎、咽炎、扁桃體炎的治療[1，2]。近年研究表明，蒲地藍消炎口服液治療小兒手足口病[3]、急性上呼吸道感染[4]、口腔潰瘍[5]、皰疹咽炎[6]等效果明顯。王偉偉等[7]研究發(fā)現(xiàn)，蒲地藍消炎口服液聯(lián)合奧司他韋治療小兒病毒性肺炎療效較好；趙東鐸[8]研究則表明，利用標準三聯(lián)療法+蒲地藍消炎口服液治療幽門螺桿菌感染性胃炎的療效及安全性均良好。可見，蒲地藍消炎口服液在消炎、抗病毒方面效果突出。

蒲地藍消炎口服液的質(zhì)量標準中，依據(jù)藥典制劑通則，分別對總菌及控制菌（大腸埃希菌）進行了控制，滿足了《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》對微生物限度控制的基本要求。但對非無菌藥品而言，尤其是水制劑，未對其他潛在的微生物做進一步的研究。洋蔥伯克霍爾德菌（Bcc.）（即為水制劑產(chǎn)品中具有潛在危害的一類微生物，目前被定義為不可接受微生物，其耐受消毒劑和抗生素，并能在水基質(zhì)的非無菌藥品中能夠存活甚至繁殖，尤其對免疫力缺失或低下的用藥人群存在較高的健康風險[9]。美國FDA 從2017 年就發(fā)布通知，建議制藥企業(yè)關(guān)注在非無菌水基質(zhì)藥品中不可接受微生物洋蔥伯克霍爾德菌群的污染風險。而我國，也曾屢次出現(xiàn)過因洋蔥伯克霍爾德菌引起的感染病例[10，11]，并有研究報道了其耐藥性分布情況[12-14]，正是由于其在重癥監(jiān)護室的感染率逐漸上升以及強大的耐藥性，引起了人們的高度重視。

美國藥典USP 中明確指出，用于吸入或口服、口服黏膜、皮膚或鼻腔使用的含水制劑需要檢查是否含有洋蔥伯克霍爾德菌[15]。對于中藥液體制劑而言，因其含水量高容易助長微生物的生長繁殖，導致霉變、酸敗等現(xiàn)象，嚴重者則造成藥物的安全性問題[16]，故應(yīng)加強微生物指標控制。本研究旨在建立蒲地藍消炎口服液及其制藥用水（純化水）中不可接受微生物洋蔥伯克霍爾德菌的檢查方法，以此來加強從源頭到成品的整體控制，降低致病菌污染風險，提升產(chǎn)品質(zhì)量控制水平，保障公眾用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HR1200-ⅡB2 生物安全柜（青島海爾）；BSC-1000ⅡB2 生物安全柜（蘇凈安泰）；HPX-Ⅱ-400 生化培養(yǎng)箱、SPX-400-Ⅱ生化培養(yǎng)箱（上海躍進）；ASM-0.6安瓿水浴滅菌器（山東新華）。

1.2 試劑與藥品 洋蔥伯克霍爾德菌（菌株編號：ATCC25416），來源于美國菌種保藏中心；蒲地藍消炎口服液（批號：2011126，10 mL/ 支）和純化水（批號：210223），均為濟川藥業(yè)集團有限公司自制；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（德國默克）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（德國默克）；洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BCSA，北京三藥）；BCSA 選擇性添加劑（北京三藥）；pH7.0 無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液（青島海博）；麥氏比濁管（廣東環(huán)凱）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 接種洋蔥伯克霍爾德菌至10 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)45 h。取上述培養(yǎng)物用麥氏比濁管比濁確定濃度，再用pH 7.0 無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液10 倍系列稀釋至約1～100 cfu/mL。取含菌量1～100 cfu/mL 洋蔥伯克霍爾德菌懸液1 mL 至2個平皿中，加胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基并搖勻，30 ℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)結(jié)果見表1。

表1 菌液制備菌種計數(shù)結(jié)果

2.2 供試品溶液制備 取供試品（蒲地藍消炎口服液、純化水）10 mL，加pH 7.0 無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液90 mL，制成1∶10 的供試液。

2.3 檢查方法 取1∶10 的供試液，采用平皿法進行洋蔥伯克霍爾德菌檢查。

2.4 方法適用性試驗

2.4.1 供試品組 取1∶10 的供試液10 mL，接種至100 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置32.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取上述預培養(yǎng)物劃線接種于洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（每500 mL 培養(yǎng)基中加入1 支BCSA選擇性添加劑）平板上，置32.5 ℃培養(yǎng)48 h。

2.4.2 陽性對照組 取1∶10 的供試液10 mL 及1～100 cfu/mL 的洋蔥伯克霍爾德菌懸液1 mL，接種至100 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置32.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取上述預培養(yǎng)物劃線接種于洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（每500 mL 培養(yǎng)基中加入1 支BCSA 選擇性添加劑）平板上，置32.5 ℃培養(yǎng)48 h。

2.4.3 陰性對照組 取pH 7.0 無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液10 mL，接種至100 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置32.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取上述預培養(yǎng)物劃線接種于洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（每500 mL 加入1 支BCSA 選擇性添加劑）平板上，置32.5 ℃培養(yǎng)48 h。

2.4.4 結(jié)果判斷 若洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判定為未檢出洋蔥伯克霍爾德菌。若洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上有菌落生長，且為周圍黃色的綠棕色菌落，或者周圍粉紅色的白色菌落，則應(yīng)進行分離、純化、鏡檢鑒定，確認是否為洋蔥伯克霍爾德菌。

若陽性對照組檢出洋蔥伯克霍爾德菌，供試品組和陰性對照組未檢出洋蔥伯克霍爾德菌，則不可接受微生物（洋蔥伯克霍爾德菌）驗證試驗結(jié)果符合要求。驗證結(jié)果見表2、表3、圖1。

表2 蒲地藍消炎口服液驗證結(jié)果

表3 純化水驗證結(jié)果

圖1 驗證結(jié)果

2.5 結(jié)論 陽性對照組檢出洋蔥伯克霍爾德菌，供試品組和陰性對照組未檢出洋蔥伯克霍爾德菌，不可接受微生物驗證試驗結(jié)果符合要求。該方法可用于蒲地藍消炎口服液及純化水中不可接受微生物洋蔥伯克霍爾德菌的檢查。

3 討論

采用涂布法對洋蔥伯克霍爾德選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BCSA）進行了適用性檢查。選取洋蔥伯克霍爾德菌（ATCC25416）、新洋蔥伯克霍爾德菌（BNCC331058）、多噬伯克霍爾德菌（BNCC301368）進行了BCSA 促生長能力及指示特性檢查；選取金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、銅綠假單胞菌（ATCC9027）進行了BCSA 抑制能力檢查。培養(yǎng)結(jié)果顯示，BCSA 對洋蔥伯克霍爾德菌、新洋蔥伯克霍爾德菌、多噬伯克霍爾德菌有促生長作用，而對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌有抑制能力，空白對照無菌生長，BCSA 適用性檢查符合規(guī)定。

取公司自制蒲地藍消炎口服液3 批、純化水3 批，采用文中經(jīng)驗證過的方法進行檢查，結(jié)果：每1 mL 蒲地藍消炎口服液菌未檢出洋蔥伯克霍爾德菌；每1 mL 純化水未檢出洋蔥伯克霍爾德菌。

蒲地藍消炎口服液自2015 年便收錄于《中國藥典》中。該品種質(zhì)量標準中，在理化方面，針對處方藥材分別建立了3 個定性及2 個定量成分的研究。在微生物方面，目前僅滿足中國藥典中對口服給藥液體制劑的基本要求，即《中國藥典》中對總菌及控制菌的基本要求。洋蔥伯克霍爾德菌，作為新出現(xiàn)的一種條件致病菌，污染廣，危害大，可考慮將其納入蒲地藍消炎口服液質(zhì)量標準中，并納入公司純化水控制標準中，進而從源頭保障其他水制劑產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

綜上所述，文中建立的檢查方法，不僅可以用于蒲地藍消炎口服液及純化水中不可接受微生物洋蔥伯克霍爾德菌的檢查，也可以參考應(yīng)用到其他水制劑產(chǎn)品的風險評估和安全控制中，對于提升整體藥品的安全性，有較大的借鑒意義。