楊光明，彭小勇，雷 艷，胡 弋，薛明英，李 濤，劉良明

(1.陸軍特色醫(yī)學(xué)中心野戰(zhàn)外科研究部武器殺傷生物效應(yīng)評(píng)估研究室，重慶 400042；2.陸軍特色醫(yī)學(xué)中心野戰(zhàn)外科研究部戰(zhàn)傷休克與輸血研究室/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042)

缺血缺氧是多種臨床疾病中廣泛存在的病理生理過程，是引起重要組織器官損傷的最常見因素之一。機(jī)體供血不足導(dǎo)致的組織缺血缺氧是發(fā)生嚴(yán)重創(chuàng)傷失血休克的最主要原因，其不僅會(huì)引起組織器官的直接損傷，還可能增加機(jī)體對(duì)細(xì)菌、毒素、炎癥介質(zhì)等因素的敏感性，在多種繼發(fā)性損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1-2]。因此，深入研究組織細(xì)胞缺血缺氧損傷的發(fā)生機(jī)理和調(diào)節(jié)過程對(duì)嚴(yán)重創(chuàng)傷失血休克等臨床重癥的治療具有重要意義。

缺血缺氧可導(dǎo)致多種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的激活，如細(xì)胞自噬和鐵死亡。自噬通過溶酶體系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞自身組成成分進(jìn)行降解并循環(huán)利用，在生理和病理狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞命運(yùn)有著決定作用[3-4]。多項(xiàng)對(duì)缺血性疾病的研究顯示，自噬增強(qiáng)可對(duì)缺血缺氧狀態(tài)下的心肌細(xì)胞和神經(jīng)元起保護(hù)作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞存活。然而也有研究表明，自噬可通過自身介導(dǎo)的死亡機(jī)制或觸發(fā)細(xì)胞凋亡等死亡通路，加重缺血缺氧后的細(xì)胞損傷程度，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[5-7]。這些不同的結(jié)論與自噬自身“雙刃劍”的特點(diǎn)有關(guān)，但自噬在缺血缺氧損傷中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制仍未完全闡明。鐵死亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞死亡模式，其在腫瘤和神經(jīng)等疾病中的重要作用已得到證實(shí)，近年來在出血性和缺血性疾病中也發(fā)現(xiàn)了鐵死亡的參與[8-10]。然而，目前關(guān)于鐵死亡的研究尚處于初期階段，鐵死亡的調(diào)節(jié)機(jī)制和臨床作用尚需進(jìn)一步探索。

氧化應(yīng)激與自噬、鐵死亡緊密相關(guān)。氧化應(yīng)激激活的保護(hù)性自噬反應(yīng)和氧化應(yīng)激引起的自噬性細(xì)胞死亡均有報(bào)道[11-12]。而鐵死亡以鐵依賴的脂質(zhì)過氧化損傷為主要特征，其可導(dǎo)致活性氧蓄積、細(xì)胞損傷死亡，與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，氧化應(yīng)激在創(chuàng)傷失血休克后血管功能障礙的發(fā)生過程中具有重要作用[13]。但目前尚不清楚在創(chuàng)傷失血休克后缺血缺氧狀態(tài)下，氧化應(yīng)激與自噬和鐵死亡是否存在聯(lián)系，亦不清楚調(diào)控氧化狀態(tài)能否影響細(xì)胞自噬狀態(tài)或鐵死亡發(fā)生進(jìn)而參與血管功能調(diào)節(jié)。為此，本研究采用體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)，觀察抗氧化劑依達(dá)拉奉(edaravone，EDA)對(duì)低氧低糖處理后VSMC自噬和鐵死亡發(fā)生以及細(xì)胞反應(yīng)性的影響；同時(shí)采用創(chuàng)傷失血休克大鼠模型，觀察抗氧化劑對(duì)休克血管功能的作用，以探討抗氧化干預(yù)調(diào)節(jié)休克血管功能與低氧低糖VSMC反應(yīng)性的作用，及其與細(xì)胞自噬和鐵死亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)SD大鼠62只，體質(zhì)量180～220 g，由陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(軍)2017-0058。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，EDA購自TOCRIS公司，兔源性微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體和p62抗體購自Cell Signaling Technology公司，兔源性谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)抗體和溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)抗體購自Abcam公司，小鼠源性β-actin抗體購自Invitrogen公司，山羊抗兔和抗小鼠熒光二抗購自Jackson公司，蛋白酶抑制劑片購自Thermo公司，熒光素標(biāo)記的牛血清白蛋白(fluorescein isothiocyanate-conjugated bovine serum albumin，F(xiàn)ITC-BSA)購自Sigma公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 原代大鼠VSMC培養(yǎng)及低氧低糖模型構(gòu)建

在無菌條件下分離30只大鼠的腸系膜動(dòng)脈，采用貼塊法進(jìn)行VSMC原代培養(yǎng)[13]。用含10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至3～5代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組：正常對(duì)照組、低氧低糖組、低氧低糖+EDA 0.1 mmol/L組、低氧低糖+EDA 1 mmol/L組。正常對(duì)照組更換新鮮的正常培養(yǎng)基；低氧低糖組細(xì)胞用無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基換液，置于低氧培養(yǎng)罐中培養(yǎng)12 h；低氧低糖+EDA組在缺氧前加入不同劑量的EDA。

1.3 Western blot檢測細(xì)胞自噬標(biāo)志物和鐵死亡標(biāo)志物表達(dá)水平

常規(guī)提取細(xì)胞蛋白并進(jìn)行Western blot檢測[13]。取各組樣本用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，電泳條件為：4 ℃、恒定電壓堆積膠80 V、分離膠100～120 V。然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，封閉后分別加入LC3抗體(1∶1 000)、p62抗體(1∶1 000)、GPx4抗體(1∶1 000)、SLC7A11抗體(1∶1 000)或β-actin抗體(1∶2 000)孵育。然后加入熒光標(biāo)記二抗(1∶20 000)孵育，用雙色紅外成像激光系統(tǒng)(德國LI-COR公司)檢測蛋白條帶，用Quantity One分析軟件測定條帶灰度值。蛋白印跡檢測重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞收縮反應(yīng)性檢測

將第3～5代的VSMC接種至Transwell小室，建立雙室細(xì)胞培養(yǎng)模型[14]：Transwell小室插入24孔培養(yǎng)板，VSMC接種于上室，在上、下室加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)胞收縮反應(yīng)性檢測。同上實(shí)驗(yàn)分組并處理后，在上室中加入FITC-BSA 5 mg/mL和去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)10-7mmol/L，30 min后取下室液檢測熒光強(qiáng)度，以FITC-BSA的滲透率變化反映VSMC的收縮反應(yīng)性。

1.5 創(chuàng)傷失血休克大鼠模型構(gòu)建及血管反應(yīng)性檢測

32只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、休克組、休克+EDA 100 μmol/L組、休克+EDA 200 μmol/L組，每組8只。采用本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法建立大鼠創(chuàng)傷失血休克模型[15]：大鼠麻醉后給予右側(cè)股骨骨折，然后左側(cè)股動(dòng)脈插管并連接水銀血壓計(jì)，放血使血壓降至30 mmHg并維持2 h。模型完成后，開腹取腸系膜上動(dòng)脈并制備血管環(huán)，采用離體血管張力測定技術(shù)檢測血管反應(yīng)性[13]。將平衡后的血管環(huán)用124 mmol/L高鉀液誘導(dǎo)預(yù)收縮，記錄預(yù)收縮張力(ΔK+)，并將其作為量化標(biāo)準(zhǔn)。再次平衡后，休克+EDA組加入不同劑量的EDA孵育30 min，然后加入10-9～10-5mmol/L梯度濃度的NE，記錄NE誘導(dǎo)血管環(huán)產(chǎn)生的收縮張力(ΔNE)，用量—效曲線和標(biāo)準(zhǔn)化的最大收縮張力(Emax=ΔNE/ΔK+)評(píng)價(jià)血管反應(yīng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EDA對(duì)低氧低糖處理后VSMC自噬水平的影響

低氧低糖處理12 h后，VSMC中自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高、p62蛋白表達(dá)水平降低，與正常對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。EDA處理可使低氧低糖細(xì)胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低、p62蛋白表達(dá)水平升高，與低氧低糖組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，其中1 mmol/L的EDA效果更為顯著(P<0.01)，見圖1。

a：代表性免疫印跡條帶；b：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值；c：p62/β-actin比值 **：與正常對(duì)照組比較,P<0.01；#：與低氧低糖組比較,P<0.05;##：與低氧低糖組比較,P<0.01

2.2 EDA對(duì)低氧低糖處理后VSMC鐵死亡發(fā)生的影響

低氧低糖處理后，VSMC中鐵死亡標(biāo)志蛋白GPx4和SLC7A11的表達(dá)水平降低，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示鐵死亡發(fā)生。而EDA處理后低氧低糖狀態(tài)下GPx4和SLC7A11的表達(dá)水平與低氧低糖組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

a：代表性免疫印跡條帶；b：GPx4/β-actin比值；c：SLC7A11/β-actin比值 *：與正常對(duì)照組比較,P<0.05

2.3 EDA對(duì)低氧低糖處理后VSMC收縮反應(yīng)性的影響

低氧低糖處理后VSMC對(duì)NE誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)性明顯降低，熒光標(biāo)記物滲透率顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01)。EDA處理可使低氧低糖VSMC的收縮反應(yīng)性明顯升高，低氧低糖+EDA 0.1 mmol/L組和低氧低糖+EDA 1 mmol/L組的熒光滲透率均高于低氧低糖組(P<0.05)，見圖3。

**：與正常對(duì)照組比較,P<0.01；#：與低氧低糖組比較,P<0.05;##：與低氧低糖組比較,P<0.01

2.4 EDA對(duì)創(chuàng)傷失血休克大鼠血管反應(yīng)性的影響

創(chuàng)傷失血休克使大鼠血管對(duì)NE誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)性明顯降低(P<0.01)。給予EDA處理后，休克血管的收縮反應(yīng)性明顯升高，使血管對(duì)NE的量—效曲線左移、Emax升高，與休克組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

a：量—效曲線；b：Emax **：與對(duì)照組比較,P<0.01；#：與休克組比較,P<0.05;##：與休克組比較,P<0.01

3 討論

細(xì)胞自噬和鐵死亡是不同于經(jīng)典細(xì)胞凋亡和壞死的新的細(xì)胞死亡途徑，它們?cè)谛螒B(tài)特征、生化特點(diǎn)和基因調(diào)控等方面都有著明顯不同[16]。細(xì)胞自噬作為廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種基本生命現(xiàn)象，與多種疾病(如癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病等)密切相關(guān)[3-6]。因此，通過調(diào)控自噬來探索疾病治療的新方法成為了當(dāng)前研究的重點(diǎn)問題。然而自噬與多種致病因素間的相互作用和調(diào)節(jié)機(jī)制及其與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前尚未明確。對(duì)鐵死亡的研究更是處于初期階段，盡管鐵死亡與多種臨床疾病間的關(guān)系都得到了證實(shí)，但其具體作用和調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚，其與血管功能調(diào)節(jié)和疾病狀態(tài)下血管功能障礙的相關(guān)性也少見報(bào)道。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化作用失衡而導(dǎo)致氧化損傷的過程。目前已經(jīng)證實(shí)，氧化應(yīng)激是多種疾病中器官系統(tǒng)損傷的重要病理機(jī)制之一。近年來發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與自噬之間有緊密的聯(lián)系，如對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性心腦疾病的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激作為上游刺激因素可誘導(dǎo)保護(hù)性的自噬反應(yīng)，自噬激活后通過清除損傷的蛋白和細(xì)胞器降低氧化損傷，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[17]。而Hariharan等[18]報(bào)道，缺血/再灌注損傷引起了小鼠心肌氧化應(yīng)激和自噬，抗氧化劑治療能抑制氧化應(yīng)激和自噬并減少心肌梗死面積，因此其認(rèn)為氧化應(yīng)激介導(dǎo)的過度自噬激活是心肌缺血/再灌注損傷的重要因素。這些氧化應(yīng)激與自噬相互作用及其對(duì)細(xì)胞不同影響的研究結(jié)果提示，不同的應(yīng)激水平和強(qiáng)度與不同的疾病病理生理階段可能導(dǎo)致不同的自噬反應(yīng)和細(xì)胞結(jié)局。鐵死亡發(fā)生的主要機(jī)制是鐵依賴性的脂質(zhì)氧化應(yīng)激，其生化特征即表現(xiàn)為鐵和自由基聚集、谷胱甘肽耗竭、GPx4活性降低、脂質(zhì)過氧化損傷發(fā)生[8-10]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示，嚴(yán)重創(chuàng)傷失血休克后，缺血缺氧損傷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)在創(chuàng)傷后器官功能障礙中起重要作用[13]。但是，創(chuàng)傷失血休克引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)是否會(huì)激活自噬和鐵死亡、參與血管功能障礙的發(fā)生，調(diào)節(jié)氧化反應(yīng)能否通過影響細(xì)胞自噬或鐵死亡來發(fā)揮作用，目前尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)原代培養(yǎng)的VSMC給予低氧低糖處理，模擬在體創(chuàng)傷失血休克后缺血缺氧狀態(tài)，觀察抗氧化干預(yù)對(duì)低氧低糖誘導(dǎo)VSMC自噬和鐵死亡以及細(xì)胞收縮功能的影響，結(jié)果顯示，低氧低糖處理12 h后，VSMC的自噬水平升高、鐵死亡發(fā)生、細(xì)胞收縮反應(yīng)性降低；抗氧化劑EDA處理可抑制自噬水平的升高、增加細(xì)胞收縮反應(yīng)性，但對(duì)鐵死亡標(biāo)志蛋白水平無明顯影響。隨后本研究采用休克動(dòng)物模型作功能驗(yàn)證，結(jié)果顯示抗氧化劑EDA處理可改善休克引起的血管收縮功能下降。提示抗氧化干預(yù)可抑制低氧低糖誘導(dǎo)的VSMC自噬激活，并對(duì)缺氧細(xì)胞和休克血管的收縮功能有改善作用。但本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)抗氧化劑EDA處理對(duì)鐵死亡相關(guān)蛋白水平有明顯作用，其具體原因尚需進(jìn)一步研究。盡管氧化應(yīng)激在多種心血管疾病病理生理過程中的重要作用已得到廣泛認(rèn)識(shí)，抗氧化治療也備受關(guān)注，但目前抗氧化劑在心血管疾病治療中的效果并不符合預(yù)期。因此，仍需對(duì)機(jī)體氧化損傷的機(jī)制作進(jìn)一步的探索，如氧化反應(yīng)與自噬間的相互作用機(jī)制、參與疾病病理過程的關(guān)鍵靶點(diǎn)等，以期為抗氧化措施在臨床疾病治療中的應(yīng)用、更有效的抗氧化劑的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。