楊光明，彭小勇，雷 艷，胡 弋，薛明英，李 濤，劉良明

(1.陸軍特色醫(yī)學中心野戰(zhàn)外科研究部武器殺傷生物效應評估研究室，重慶 400042；2.陸軍特色醫(yī)學中心野戰(zhàn)外科研究部戰(zhàn)傷休克與輸血研究室/創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶 400042)

缺血缺氧是多種臨床疾病中廣泛存在的病理生理過程，是引起重要組織器官損傷的最常見因素之一。機體供血不足導致的組織缺血缺氧是發(fā)生嚴重創(chuàng)傷失血休克的最主要原因，其不僅會引起組織器官的直接損傷，還可能增加機體對細菌、毒素、炎癥介質等因素的敏感性，在多種繼發(fā)性損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1-2]。因此，深入研究組織細胞缺血缺氧損傷的發(fā)生機理和調節(jié)過程對嚴重創(chuàng)傷失血休克等臨床重癥的治療具有重要意義。

缺血缺氧可導致多種細胞應激反應的激活，如細胞自噬和鐵死亡。自噬通過溶酶體系統(tǒng)對細胞自身組成成分進行降解并循環(huán)利用，在生理和病理狀態(tài)下對細胞命運有著決定作用[3-4]。多項對缺血性疾病的研究顯示，自噬增強可對缺血缺氧狀態(tài)下的心肌細胞和神經元起保護作用，能夠促進細胞存活。然而也有研究表明，自噬可通過自身介導的死亡機制或觸發(fā)細胞凋亡等死亡通路，加重缺血缺氧后的細胞損傷程度，甚至誘導細胞死亡[5-7]。這些不同的結論與自噬自身“雙刃劍”的特點有關，但自噬在缺血缺氧損傷中的作用及其調節(jié)機制仍未完全闡明。鐵死亡是近年來發(fā)現的一種新的細胞死亡模式，其在腫瘤和神經等疾病中的重要作用已得到證實，近年來在出血性和缺血性疾病中也發(fā)現了鐵死亡的參與[8-10]。然而，目前關于鐵死亡的研究尚處于初期階段，鐵死亡的調節(jié)機制和臨床作用尚需進一步探索。

氧化應激與自噬、鐵死亡緊密相關。氧化應激激活的保護性自噬反應和氧化應激引起的自噬性細胞死亡均有報道[11-12]。而鐵死亡以鐵依賴的脂質過氧化損傷為主要特征，其可導致活性氧蓄積、細胞損傷死亡，與氧化應激密切相關。本實驗室前期研究證實，氧化應激在創(chuàng)傷失血休克后血管功能障礙的發(fā)生過程中具有重要作用[13]。但目前尚不清楚在創(chuàng)傷失血休克后缺血缺氧狀態(tài)下，氧化應激與自噬和鐵死亡是否存在聯(lián)系，亦不清楚調控氧化狀態(tài)能否影響細胞自噬狀態(tài)或鐵死亡發(fā)生進而參與血管功能調節(jié)。為此，本研究采用體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)，觀察抗氧化劑依達拉奉(edaravone，EDA)對低氧低糖處理后VSMC自噬和鐵死亡發(fā)生以及細胞反應性的影響；同時采用創(chuàng)傷失血休克大鼠模型，觀察抗氧化劑對休克血管功能的作用，以探討抗氧化干預調節(jié)休克血管功能與低氧低糖VSMC反應性的作用，及其與細胞自噬和鐵死亡的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

清潔級SD大鼠62只，體質量180～220 g，由陸軍特色醫(yī)學中心實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK(軍)2017-0058。細胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，EDA購自TOCRIS公司，兔源性微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體和p62抗體購自Cell Signaling Technology公司，兔源性谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)抗體和溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)抗體購自Abcam公司，小鼠源性β-actin抗體購自Invitrogen公司，山羊抗兔和抗小鼠熒光二抗購自Jackson公司，蛋白酶抑制劑片購自Thermo公司，熒光素標記的牛血清白蛋白(fluorescein isothiocyanate-conjugated bovine serum albumin，FITC-BSA)購自Sigma公司。其他試劑為國產分析純。

1.2 原代大鼠VSMC培養(yǎng)及低氧低糖模型構建

在無菌條件下分離30只大鼠的腸系膜動脈，采用貼塊法進行VSMC原代培養(yǎng)[13]。用含10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞至3～5代，用于后續(xù)實驗。實驗分為4組：正常對照組、低氧低糖組、低氧低糖+EDA 0.1 mmol/L組、低氧低糖+EDA 1 mmol/L組。正常對照組更換新鮮的正常培養(yǎng)基；低氧低糖組細胞用無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基換液，置于低氧培養(yǎng)罐中培養(yǎng)12 h；低氧低糖+EDA組在缺氧前加入不同劑量的EDA。

1.3 Western blot檢測細胞自噬標志物和鐵死亡標志物表達水平

常規(guī)提取細胞蛋白并進行Western blot檢測[13]。取各組樣本用SDS-PAGE進行蛋白電泳，電泳條件為：4 ℃、恒定電壓堆積膠80 V、分離膠100～120 V。然后轉印至PVDF膜上，封閉后分別加入LC3抗體(1∶1 000)、p62抗體(1∶1 000)、GPx4抗體(1∶1 000)、SLC7A11抗體(1∶1 000)或β-actin抗體(1∶2 000)孵育。然后加入熒光標記二抗(1∶20 000)孵育，用雙色紅外成像激光系統(tǒng)(德國LI-COR公司)檢測蛋白條帶，用Quantity One分析軟件測定條帶灰度值。蛋白印跡檢測重復3次。

1.4 細胞收縮反應性檢測

將第3～5代的VSMC接種至Transwell小室，建立雙室細胞培養(yǎng)模型[14]：Transwell小室插入24孔培養(yǎng)板，VSMC接種于上室，在上、下室加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后進行細胞收縮反應性檢測。同上實驗分組并處理后，在上室中加入FITC-BSA 5 mg/mL和去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)10-7mmol/L，30 min后取下室液檢測熒光強度，以FITC-BSA的滲透率變化反映VSMC的收縮反應性。

1.5 創(chuàng)傷失血休克大鼠模型構建及血管反應性檢測

32只大鼠隨機分為對照組、休克組、休克+EDA 100 μmol/L組、休克+EDA 200 μmol/L組，每組8只。采用本實驗室常規(guī)方法建立大鼠創(chuàng)傷失血休克模型[15]：大鼠麻醉后給予右側股骨骨折，然后左側股動脈插管并連接水銀血壓計，放血使血壓降至30 mmHg并維持2 h。模型完成后，開腹取腸系膜上動脈并制備血管環(huán)，采用離體血管張力測定技術檢測血管反應性[13]。將平衡后的血管環(huán)用124 mmol/L高鉀液誘導預收縮，記錄預收縮張力(ΔK+)，并將其作為量化標準。再次平衡后，休克+EDA組加入不同劑量的EDA孵育30 min，然后加入10-9～10-5mmol/L梯度濃度的NE，記錄NE誘導血管環(huán)產生的收縮張力(ΔNE)，用量—效曲線和標準化的最大收縮張力(Emax=ΔNE/ΔK+)評價血管反應性。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 EDA對低氧低糖處理后VSMC自噬水平的影響

低氧低糖處理12 h后，VSMC中自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高、p62蛋白表達水平降低，與正常對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。EDA處理可使低氧低糖細胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低、p62蛋白表達水平升高，與低氧低糖組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05) ，其中1 mmol/L的EDA效果更為顯著(P<0.01)，見圖1。

a：代表性免疫印跡條帶；b：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值；c：p62/β-actin比值 **：與正常對照組比較,P<0.01；#：與低氧低糖組比較,P<0.05;##：與低氧低糖組比較,P<0.01

2.2 EDA對低氧低糖處理后VSMC鐵死亡發(fā)生的影響

低氧低糖處理后，VSMC中鐵死亡標志蛋白GPx4和SLC7A11的表達水平降低，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示鐵死亡發(fā)生。而EDA處理后低氧低糖狀態(tài)下GPx4和SLC7A11的表達水平與低氧低糖組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

a：代表性免疫印跡條帶；b：GPx4/β-actin比值；c：SLC7A11/β-actin比值 *：與正常對照組比較,P<0.05

2.3 EDA對低氧低糖處理后VSMC收縮反應性的影響

低氧低糖處理后VSMC對NE誘導的收縮反應性明顯降低，熒光標記物滲透率顯著低于正常對照組(P<0.01)。EDA處理可使低氧低糖VSMC的收縮反應性明顯升高，低氧低糖+EDA 0.1 mmol/L組和低氧低糖+EDA 1 mmol/L組的熒光滲透率均高于低氧低糖組(P<0.05)，見圖3。

**：與正常對照組比較,P<0.01；#：與低氧低糖組比較,P<0.05;##：與低氧低糖組比較,P<0.01

2.4 EDA對創(chuàng)傷失血休克大鼠血管反應性的影響

創(chuàng)傷失血休克使大鼠血管對NE誘導的收縮反應性明顯降低(P<0.01)。給予EDA處理后，休克血管的收縮反應性明顯升高，使血管對NE的量—效曲線左移、Emax升高，與休克組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

a：量—效曲線；b：Emax **：與對照組比較,P<0.01；#：與休克組比較,P<0.05;##：與休克組比較,P<0.01

3 討論

細胞自噬和鐵死亡是不同于經典細胞凋亡和壞死的新的細胞死亡途徑，它們在形態(tài)特征、生化特點和基因調控等方面都有著明顯不同[16]。細胞自噬作為廣泛存在于真核細胞內的一種基本生命現象，與多種疾病(如癌癥、神經系統(tǒng)疾病、代謝性疾病等)密切相關[3-6]。因此，通過調控自噬來探索疾病治療的新方法成為了當前研究的重點問題。然而自噬與多種致病因素間的相互作用和調節(jié)機制及其與疾病發(fā)生發(fā)展的關系目前尚未明確。對鐵死亡的研究更是處于初期階段，盡管鐵死亡與多種臨床疾病間的關系都得到了證實，但其具體作用和調節(jié)機制仍不清楚，其與血管功能調節(jié)和疾病狀態(tài)下血管功能障礙的相關性也少見報道。

氧化應激是指機體內氧化和抗氧化作用失衡而導致氧化損傷的過程。目前已經證實，氧化應激是多種疾病中器官系統(tǒng)損傷的重要病理機制之一。近年來發(fā)現，氧化應激與自噬之間有緊密的聯(lián)系，如對動脈粥樣硬化、缺血性心腦疾病的研究發(fā)現，氧化應激作為上游刺激因素可誘導保護性的自噬反應，自噬激活后通過清除損傷的蛋白和細胞器降低氧化損傷，從而發(fā)揮細胞保護作用[17]。而Hariharan等[18]報道，缺血/再灌注損傷引起了小鼠心肌氧化應激和自噬，抗氧化劑治療能抑制氧化應激和自噬并減少心肌梗死面積，因此其認為氧化應激介導的過度自噬激活是心肌缺血/再灌注損傷的重要因素。這些氧化應激與自噬相互作用及其對細胞不同影響的研究結果提示，不同的應激水平和強度與不同的疾病病理生理階段可能導致不同的自噬反應和細胞結局。鐵死亡發(fā)生的主要機制是鐵依賴性的脂質氧化應激，其生化特征即表現為鐵和自由基聚集、谷胱甘肽耗竭、GPx4活性降低、脂質過氧化損傷發(fā)生[8-10]。本實驗室前期研究顯示，嚴重創(chuàng)傷失血休克后，缺血缺氧損傷導致的氧化應激反應在創(chuàng)傷后器官功能障礙中起重要作用[13]。但是，創(chuàng)傷失血休克引起的氧化應激反應是否會激活自噬和鐵死亡、參與血管功能障礙的發(fā)生，調節(jié)氧化反應能否通過影響細胞自噬或鐵死亡來發(fā)揮作用，目前尚不清楚。

本實驗通過對原代培養(yǎng)的VSMC給予低氧低糖處理，模擬在體創(chuàng)傷失血休克后缺血缺氧狀態(tài)，觀察抗氧化干預對低氧低糖誘導VSMC自噬和鐵死亡以及細胞收縮功能的影響，結果顯示，低氧低糖處理12 h后，VSMC的自噬水平升高、鐵死亡發(fā)生、細胞收縮反應性降低；抗氧化劑EDA處理可抑制自噬水平的升高、增加細胞收縮反應性，但對鐵死亡標志蛋白水平無明顯影響。隨后本研究采用休克動物模型作功能驗證，結果顯示抗氧化劑EDA處理可改善休克引起的血管收縮功能下降。提示抗氧化干預可抑制低氧低糖誘導的VSMC自噬激活，并對缺氧細胞和休克血管的收縮功能有改善作用。但本實驗中未發(fā)現抗氧化劑EDA處理對鐵死亡相關蛋白水平有明顯作用，其具體原因尚需進一步研究。盡管氧化應激在多種心血管疾病病理生理過程中的重要作用已得到廣泛認識，抗氧化治療也備受關注，但目前抗氧化劑在心血管疾病治療中的效果并不符合預期。因此，仍需對機體氧化損傷的機制作進一步的探索，如氧化反應與自噬間的相互作用機制、參與疾病病理過程的關鍵靶點等，以期為抗氧化措施在臨床疾病治療中的應用、更有效的抗氧化劑的開發(fā)提供研究基礎。