伍勇，鄒蝶，盧倩，程馳，夏珊，馮媛媛，邱成書(shū)，薛飛龍，張曉娟，劉紅玲

（成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，特色園藝生物資源開(kāi)發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130）

原花青素是一類(lèi)具有特殊生物活性的黃酮類(lèi)化合物[1]，由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素單體聚合而成，其中低聚原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基能力[2]。多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和系統(tǒng)研究論證了原花青素的安全性，也發(fā)現(xiàn)原花青素能抑制紅細(xì)胞膜過(guò)氧化、預(yù)防心腦血管等疾病[3]，還具有抗衰老、抗癌、保護(hù)肝腎等功能[4]。因此原花青素被廣泛用于食品、藥品以及化妝品等領(lǐng)域。大量的研究表明[5-6]，葡萄加工副產(chǎn)物葡萄籽可作為原花青素的來(lái)源，葡萄籽原花青素具有抗氧化、清除自由基的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。赤霞珠作為最受歡迎的釀酒葡萄品種，巨峰作為新興的廣受歡迎的葡萄品種，在四川擁有90%以上的種植面積，兩種葡萄籽原花青素都具有潛在研究?jī)r(jià)值。

對(duì)原花青素復(fù)雜的生物學(xué)活性深入研究發(fā)現(xiàn)，原花青素的生理活性差異除了受單體組成的差異影響，也因原花青素聚合度高低而改變，因此，原花青素的提取、純化工藝對(duì)其功能發(fā)揮和工業(yè)利用顯得尤為重要。李彩霞等[7]在赤霞珠原花青素的研究中確定了最佳提取工藝為料液比1∶40（g/mL），硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，超聲時(shí)間50 min。毛建利等[8]優(yōu)化原花青素提取工藝，優(yōu)化工藝為提取溫度 81 ℃、料液比 1∶40（g/mL）、乙醇濃度56%、提取時(shí)間20 h，提取率為5.61%。而有關(guān)巨峰葡萄籽原花青素的提取工藝還未見(jiàn)報(bào)道。葡萄籽中原花青素的分離純化方法有溶劑萃取分離法、大孔吸附樹(shù)脂法、靜態(tài)膜過(guò)濾法等。溶劑萃取法的工藝路線(xiàn)較為復(fù)雜，有機(jī)溶劑回收難，且產(chǎn)品純度不高。靜態(tài)膜過(guò)濾法由于過(guò)濾技術(shù)的局限，難以有效去除產(chǎn)品中的大分子雜質(zhì)[9]。大孔樹(shù)脂吸附洗脫法具有選擇性好、吸附容量大、機(jī)械強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物工業(yè)化的提取分離中得到廣泛應(yīng)用[10]。馬小琴等[11]通過(guò)大孔樹(shù)脂對(duì)原花青素的吸附率、解吸附率等的影響研究，發(fā)現(xiàn)HPD-400型大孔樹(shù)脂對(duì)原花青素的分離純化具有較高效率。范明霞等[12]比較了7種大孔樹(shù)脂對(duì)原花青素的分離純化效果，表明HPD-400大孔樹(shù)脂具有較好效果。有關(guān)葡萄籽原花青素的提取工藝已開(kāi)展大量研究，但有關(guān)巨峰葡萄籽原花青素提取與純化工藝的研究薄弱，影響其應(yīng)用開(kāi)發(fā)。根據(jù)早期研究中原花青素的聚合物分子特點(diǎn)與HPD-400樹(shù)脂的吸附特征相似，上樣流速、洗脫劑濃度、洗脫劑pH值等[13]都影響最終原花青素純化效果，因此選擇HPD-400樹(shù)脂作為純化吸附材料，并探究相關(guān)因素對(duì)提取純度的影響。

巨峰葡萄是近年來(lái)四川地區(qū)新興種植品種，大量加工副產(chǎn)物葡萄籽有待開(kāi)發(fā)利用。因此，本研究考察吸附時(shí)間、提取液pH值、上樣流速、乙醇濃度、洗脫液pH值對(duì)原花青素分離純化效果的影響，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化與驗(yàn)證，優(yōu)化巨峰葡萄籽原花青素純化工藝，并以赤霞珠葡萄籽作為參照，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行分析，為其抗氧化產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

巨峰葡萄籽：市售；赤霞珠葡萄籽：上海海瑞生物試劑有限公司。

HPD-400大孔吸附樹(shù)脂：山東東鴻化工有限公司；果膠酶（＞50 000 U/g）：上海瑞永生物科技有限公司；纖維素酶（＞40 000 U/g）：新疆沃德生物科技有限公司；香蘭素（分析純）：上海笛柏生物科技有限公司；原花青素B1（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；沒(méi)食子酸（分析純）、福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要設(shè)備

標(biāo)口砂芯層析柱（外徑30mm×300mm）、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HH數(shù)顯三用恒溫水箱：江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；HC-2064離心機(jī)：上海浦東天本離心機(jī)械有限公司；KYNS-100C恒溫培養(yǎng)搖床：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；UV754紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝

將葡萄籽洗凈后放入恒溫干燥箱50℃烘干至恒重，粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩備用。稱(chēng)取100 g巨峰葡萄籽樣品，用500 mL石油醚浸泡12 h，抽濾、干燥制得脫脂葡萄籽。以1∶25（g/mL）的料液比加入80%乙醇，調(diào)節(jié)溶液的pH 5.0，加入0.8 mg/g的復(fù)合酶[果膠酶∶纖維素酶=1∶3（質(zhì)量比）]，酶解溫度 40℃條件下酶解 30min，再在35℃下超聲35min，取出后放入離心機(jī)3500r/min離心10 min，取其上清液，即為原花青素的提取液，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

HPD-400大孔樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹，純水沖洗至無(wú)白色渾濁液，再用5%HCl溶液浸泡3 h后用蒸餾水洗至pH值為中性，5%NaOH溶液浸泡3 h后用蒸餾水洗至中性后備用[12]。

影響最終原花青素純度的因素共5個(gè)，包括影響HPD-400大孔樹(shù)脂對(duì)提取液中原花青素吸附因素：吸附時(shí)間、提取液pH值、上樣流速；影響原花青素洗脫的因素：乙醇濃度、洗脫液pH值。具體操作如下。

1）準(zhǔn)確稱(chēng)取5份預(yù)處理大孔樹(shù)脂各2.000 g，放入5個(gè)100 mL錐形瓶中，分別加入20 mL原花青素提取液，并用保鮮膜封住瓶口，pH 7.0下，在25℃，100 r/min轉(zhuǎn)速條件下振蕩 10 h，在吸附時(shí)間 2、4、6、8、10 h 條件下，參照原花青素檢測(cè)方法在500 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸附后溶液吸光值，計(jì)算原花青素濃度和吸附率。

2）按照1）中步驟和條件，一定吸附時(shí)間下，改變提取液 pH 值分別為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 進(jìn)行樹(shù)脂吸附，檢測(cè)吸附后溶液吸光值，計(jì)算原花青素濃度和吸附率。

3）按照2）中最優(yōu)的提取液pH值，上樣總量為20 mL，并以 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min 的流速上樣，按照一定的吸附時(shí)間收集溶液，計(jì)算原花青素濃度和吸附率。

4）按照上述最優(yōu)吸附時(shí)間、提取液pH值、上樣流速，分別稱(chēng)取2.000 g葡萄籽于5個(gè)100 mL錐形瓶中，加入20 mL濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%乙醇洗脫液，于25℃，100 r/min轉(zhuǎn)速振蕩8 h后，參照原花青素檢測(cè)方法在500 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)洗脫后溶液吸光值，計(jì)算原花青素濃度和洗脫率。

5）按照4）步驟和條件，選擇最適乙醇濃度，調(diào)節(jié)其 pH 值分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 進(jìn)行原花青素洗脫，計(jì)算原花青素濃度和洗脫率。

1.2.3 正交試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)中選擇了吸附時(shí)間、提取液pH值、上樣流速、乙醇濃度、洗脫液pH值5個(gè)因素，綜合試驗(yàn)結(jié)果與純化的時(shí)間效率，確定L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平，并利用軟件DX-8設(shè)計(jì)，開(kāi)展正交試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)，確定最優(yōu)純化工藝條件。正交因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal factor horizontal design

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 原花青素濃度及含量的測(cè)定

參考草醛法進(jìn)行測(cè)定[14]，將1%的香草醛溶液和8%的鹽酸溶液按照1∶1（體積比）配為顯色劑，制備0.1、0.3、0.5 、0.7、0.9 mg/mL 的原花青素標(biāo)準(zhǔn)液，分別取標(biāo)準(zhǔn)液2 mL，加入10 mL的顯色劑，搖勻，30℃下避光保溫30 min，在500 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 原花青素測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 The standard curve of the original anthocyanins

取2 mL待測(cè)溶液，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品原花青素濃度，樣品的原花青素含量計(jì)算公式如下。

式中：W1為原花青素含量，%；C1為原花青素濃度，mg/mL；V1為提取液體積，mL；m1為粗提物凍干后質(zhì)量，mg。

1.2.4.2 多酚濃度及含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]的方法，配制0.1 mg/mL沒(méi)食子酸溶液，稀釋成 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 不同梯度，從中分別取0.5 mL沒(méi)食子酸依次加入0.2 mg/mL福林酚試劑1 mL、20%Na2CO3溶液1.5 mL，40℃水浴30 min，在波長(zhǎng)760 nm下測(cè)定吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所得線(xiàn)性回歸方程為 Y=7.74X-0.004 3（0＜X＜0.10），R2=0.9965。

取0.5 mL待測(cè)樣，按照上述測(cè)定方法檢測(cè)計(jì)算多酚濃度，多酚含量計(jì)算公式如下。

式中：W2為多酚含量，%；C2為多酚濃度，mg/mL；V2為提取液體積，mL；m1為粗提物凍干后質(zhì)量，mg。

1.2.4.3 DPPH自由基清除率測(cè)定

配制 DPPH 標(biāo)準(zhǔn)液濃度為 2、4、6、8、10、12 mg/L，各稱(chēng)取樣液0.1 mL，加入上述DPPH標(biāo)準(zhǔn)液3.9 mL，立即搖勻，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光值，記為Ai，空白對(duì)照組以甲醇代替樣品測(cè)定吸光值，記為A0，并以抗壞血酸（VC）作為對(duì)照組。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

DPPH自由基清除率/%=[（A0-Ai）/A0]×100

1.2.4.4 還原力測(cè)定

稱(chēng)量純化后的提取物，以水作為溶劑配制成濃度為 20、40、60、80、100、150 mg/L 的溶液，取 1 mL 依次加入1%鐵氰化鉀溶液2.5mL和pH6.6、濃度為0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液2.5mL，立即混勻，置于50℃恒溫水浴保溫20 min后，加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻后3 000 r/min下離心10 min，吸取2.5 mL上清液，依次加入0.1%三氯化鐵0.5 mL，蒸餾水2.5 mL，在700 nm下檢測(cè)吸光值，并以抗壞血酸作為對(duì)照組。

1.2.4.5 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]的方法稍作改變，提前配制濃度 10、20、30、40、50、60 mg/L 待測(cè)液，取 50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）4.5 mL，加入 2 mL 蒸餾水，混勻后置于37℃水浴20 min，加入0.5 mL待測(cè)溶液，隨后立即加入0.5 mL已預(yù)熱至37℃的25 mmol/L鄰苯三酚溶液，37℃水浴反應(yīng)6 min，最后加入1.0 mL 10 mmol/L的HCl緩沖溶液終止反應(yīng)。取反應(yīng)液用蒸餾水稀釋后在波長(zhǎng)325 nm處測(cè)定吸光值，超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下。

超氧陰離子自由基清除率/%=[1-（Ai-Ai0）/A0]×100

式中：Ai為待測(cè)樣吸光值；A0為蒸餾水空白對(duì)照的吸光值；Ai0為蒸餾水替代鄰苯三酚參與反應(yīng)體系的吸光值。

1.2.4.6 原花青素純度測(cè)定

將HPD-400大孔樹(shù)脂吸附純化后的提取物，濃縮、冷凍干燥至恒重，用分析天平稱(chēng)量樣品質(zhì)量，并根據(jù)下面公式計(jì)算所得原花青素的純度[17-19]。

原花青素純度/%=C1×V1/M

式中：C1為原花青素提取液濃度，mg/mL；V1為所配制待測(cè)液體積，mL，M為純化后產(chǎn)物質(zhì)量，mg。

1.2.5 吸附率與洗脫率計(jì)算

吸附率與洗脫率計(jì)算公式如下。

吸附率/%=[（C1-C2）/C1]×100

式中：C1為吸附前溶液中原花青素濃度，mg/mL；C2為吸附后溶液中原花青素濃度，mg/mL。

洗脫率/%=[Cd×Vd/（C0-Cr）×VA]×100

式中：C0為原花青素提取液的初始濃度，mg/mL；Cr為吸附后錐形瓶中原花青素的濃度，mg/mL；Cd為解吸液中的原花青素的濃度，mg/mL；Vd為解吸時(shí)所用的溶劑體積，mL；VA為初始加入的樣液體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用軟件DX-8對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和結(jié)果分析，利用EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 20進(jìn)行多酚、原花青素含量One-way單因素方差顯著性分析，利用GraphPad Prism 8進(jìn)行圖形制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 吸附時(shí)間對(duì)原花青素濃度和吸附率的影響

吸附時(shí)間對(duì)原花青素濃度和吸附率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 吸附時(shí)間對(duì)原花青素濃度和吸附率的影響Fig.2 Influence of adsorption time on the concentration and adsorption rate of procyanidins

由圖2可知，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，原花青素吸附率逐漸上升，8 h以后趨于平緩。而吸附后溶液的原花青素濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，同樣在8 h趨于平緩，原花青素的吸附率和吸附后溶液濃度變化表現(xiàn)出相關(guān)性。在吸附時(shí)間為8 h時(shí)，原花青素的吸附率較大，考慮時(shí)間成本，選取最佳吸附時(shí)間為8 h。

2.1.2 提取液pH值對(duì)原花青素濃度和吸附率的影響

提取液pH值對(duì)原花青素濃度和吸附率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取液pH值對(duì)原花青素濃度和吸附率的影響Fig.3 Influence of pH value of extraction solution on concentration and adsorption rate of procyanidins

由圖3可知，提取液pH值在4.0～5.5時(shí)，原花青素濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，pH值為5.5～6.0時(shí)，其濃度呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢(shì)；結(jié)合原花青素吸附率，在提取液pH值為5.5時(shí)，其吸附率最高為84.26%。因此，最佳提取液pH值為5.5。

HPD-400大孔樹(shù)脂具有中極性，對(duì)離子態(tài)的物質(zhì)幾乎不吸附，只對(duì)分子態(tài)物質(zhì)吸附[20]，溶液中pH值往往影響化合物的溶液形態(tài)，進(jìn)而影響樹(shù)脂的吸附率。在試驗(yàn)中，在選取的pH值范圍內(nèi)，吸附率的變動(dòng)范圍為30.26%～84.26%，其波動(dòng)之大，表明原花青素的吸附受提取液pH值影響較大；在原花青素提取液pH值為5.5時(shí)，吸附率最高達(dá)到84.26%。分析其可能原因?yàn)樵趐H 5.5的弱酸性條件下，原花青素溶解度低，并以分子的形式存在，滿(mǎn)足形成氫鍵的條件而易被大孔樹(shù)脂吸附。

2.1.3 上樣流速對(duì)原花青素濃度和吸附率的影響

上樣流速對(duì)原花青素濃度和吸附率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 上樣流速對(duì)原花青素濃度和吸附率的影響Fig.4 Effect of loading flow rate on procyanidins concentration and adsorption rate

由圖4可知，隨著上樣流速的增加，原花青素濃度出現(xiàn)先上升然后下降的波動(dòng)趨勢(shì)，樹(shù)脂對(duì)原花青素的吸附率隨流速增加而呈現(xiàn)總體下降的趨勢(shì)，僅在流速大于3.0 mL/min后略有回升。上樣流速1.0 mL/min時(shí)，吸附率最高。因此選擇最佳的上樣流速為1.0 mL/min。

2.1.4 乙醇濃度對(duì)原花青素濃度和洗脫率的影響

乙醇濃度對(duì)原花青素濃度和洗脫率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 乙醇濃度對(duì)原花青素濃度和洗脫率的影響Fig.5 Effects of ethanol concentration on concentration and elution rate of procyanidins

由圖5可知，乙醇濃度在20%～40%時(shí)，原花青素濃度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而乙醇濃度在40%～60%時(shí)，原花青素的濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。洗脫率的趨勢(shì)與原花青素濃度的變化趨勢(shì)一致。綜合分析，乙醇濃度為40%時(shí)，原花青素濃度最大，洗脫率最高為81.41%。因此選擇乙醇濃度為40%。

2.1.5 洗脫液pH值對(duì)原花青素濃度和洗脫率的影響

洗脫液pH值對(duì)原花青素濃度和洗脫率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 洗脫液pH值對(duì)原花青素濃度和洗脫率的影響Fig.6 Influence of pH value of eluent on concentration and elution rate of procyanidins

由圖6可知，在洗脫液pH值為5.0～7.0時(shí)，原花青素濃度呈現(xiàn)快速上升的趨勢(shì)；pH值為7.0～9.0時(shí)，原花青素的濃度呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢(shì)。即pH 7.0時(shí)，原花青素的濃度達(dá)到最高，結(jié)合洗脫率的結(jié)果，選擇洗脫液pH值為7.0。

2.2 正交試驗(yàn)與驗(yàn)證

單因素試驗(yàn)中選擇了吸附時(shí)間、提取液pH值、上樣流速、乙醇濃度、洗脫液pH值5個(gè)因素，綜合試驗(yàn)結(jié)果，確定選擇A上樣流速、B乙醇濃度、C提取液pH值、D洗脫液pH值進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results

各因素對(duì)原花青素純度的影響主次順序?yàn)锳＞D＞C＞B，其最佳純化工藝為A2B3C1D3，即上樣流速1.0mL/min，乙醇濃度50%，提取液pH5.0，洗脫液pH7.5，在此條件下進(jìn)行3次平行測(cè)試驗(yàn)證，原花青素平均純度94.17%，因?yàn)槟Ｐ皖A(yù)測(cè)的方案和正交列表的中最優(yōu)組94.5%非常接近，但上樣流速較小，可導(dǎo)致最終原花青素濃度下降，綜合考慮原花青素的提取濃度與純度，所以選擇上樣流速1.0 mL/min。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 兩種葡萄籽中生物活性物質(zhì)分析

兩種葡萄籽中生物活性物質(zhì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 兩種葡萄籽中生物活性物質(zhì)分析Table 3 Analysis of bioactive substances in two grape seeds

赤霞珠葡萄籽中多酚含量22.72%顯著高于巨峰（P＜0.05），但其中原花青素含量差異不顯著。經(jīng)過(guò)純化后，巨峰的純度略高于赤霞珠，但兩者差異未達(dá)到顯著水平。

2.3.2 不同樣品抗氧化活性分析

以VC作為對(duì)照，兩種葡萄籽原花青素純化物的抗氧化活性分析結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 樣品濃度與DPPH自由基清除率、還原性、超氧陰離子自由基清除率的關(guān)系Fig.7 Relationship between DPPH radical，superoxide anion scavenging and reducibility of sample concentration

由圖7可知，在樣品濃度為2 mg/L～12 mg/L內(nèi)，DPPH自由基清除率隨樣品濃度升高逐漸增強(qiáng)。在樣品濃度在20 mg/L～150 mg/L內(nèi)，樣品濃度與樣品還原性呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系，隨著濃度增高還原性增強(qiáng)，兩種葡萄籽產(chǎn)物的還原性高于VC對(duì)照。樣品濃度在10 mg/L～50 mg/L，3種樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率也隨濃度增加而上升，在50 mg/L～60 mg/L時(shí)趨于平緩。本試驗(yàn)中兩種葡萄籽原花青素均具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

3種樣品自由基半數(shù)清除濃度（IC50）與半數(shù)還原性效應(yīng)濃度（EC50）見(jiàn)表 4。

表4 樣品對(duì)自由基半數(shù)清除濃度（IC50）與半數(shù)還原性效應(yīng)濃度（EC50）Table 4 Sample 50% scavenging concentration of free radical（IC50）and 50% reducing effect concentration（EC50）

由表4可知，DPPH自由基清除能力依次為赤霞珠＞巨峰＞VC，VC的半數(shù)還原性效應(yīng)濃度最高。還原性大小順序?yàn)槌嘞贾椋揪薹澹綱C。超氧陰離子自由基清除能力的大小關(guān)系為VC＞赤霞珠＞巨峰。

相較于VC的結(jié)構(gòu)，原花青素具有較多的酚羥基，因此能更好地阻止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，達(dá)到清除自由基目的[21]，本試驗(yàn)中兩種葡萄籽原花青素的DPPH自由基的清除能力優(yōu)于VC，這與毛雪等[22]對(duì)原花青素抗氧化活性的研究結(jié)果一致。影響還原作用的因素有相對(duì)分子質(zhì)量和空間阻位[23]，赤霞珠的還原性高于巨峰，可推測(cè)巨峰與赤霞珠所分離的原花青素分子量存在差異，赤霞珠相較巨峰分子空間相對(duì)阻位小，表現(xiàn)更高還原性。兩種原花青素純化樣品的半數(shù)效應(yīng)濃度均低于VC的84.734 mg/L，表現(xiàn)較強(qiáng)的生物活性。綜合來(lái)看，兩種葡萄籽原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基能力，因此具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用的潛力。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)影響大孔樹(shù)脂HPD-400吸附、洗脫的因素進(jìn)行正交優(yōu)化與驗(yàn)證，優(yōu)化巨峰葡萄籽原花青素純化工藝，并以赤霞珠葡萄籽作為參照，對(duì)其原花青素純化與抗氧化活性分析。結(jié)果表明，最優(yōu)工藝為提取液pH 5.0，上樣流速1.0 mL/min，乙醇濃度50%，洗脫液pH 7.5，獲得原花青素純度為94.17%。純化后的原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，表現(xiàn)出良好的抗氧化性，具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用的潛力。