周穎，滕靜，李曉丹，劉亮，肖軍霞

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109）

復(fù)凝聚反應(yīng)是指兩種帶相反電荷的生物大分子通過靜電吸引相互作用產(chǎn)生沉淀的一種自發(fā)現(xiàn)象[1-2]，目前在食品領(lǐng)域研究最多的復(fù)凝聚體系是多糖/蛋白質(zhì)體系和多糖/多糖體系，已報道的有黃原膠/殼聚糖[3]、阿拉伯膠/殼聚糖（gum arabic/chitosan，GA/CTS）[4]、海藻酸鈉（sodium alginate，SAL）/殼聚糖[5-6]和 O-羧甲基殼聚糖（O-carboxymethyl chitosan，O-CMC）/GA等。王津等[7]分別對GA/CTS和GA/O-CMC復(fù)凝聚體系包埋5-氟尿嘧啶和殺蟲劑啶蟲脒的最佳工藝、微膠囊穩(wěn)定性和芯材釋放性能進行了初步研究。Espinosa-Andrews等[8]對GA/CTS復(fù)凝聚體系在食品領(lǐng)域的應(yīng)用進行了較為系統(tǒng)的研究，確定了復(fù)凝聚相中兩種大分子的組成對復(fù)凝聚反應(yīng)的影響，并對復(fù)凝聚相的表面結(jié)構(gòu)和流變學(xué)性質(zhì)進行了系統(tǒng)研究。孫燕婷等[9]確定了GA和CTS復(fù)凝聚反應(yīng)的最佳工藝，在一定條件下制備的GA/CTS復(fù)凝聚相具有較好的腸道靶向釋放性能，可以作為水包油型乳液的微囊化壁材。但目前尚未見到SAL對O-CMC/GA復(fù)凝聚反應(yīng)及復(fù)凝聚相性質(zhì)影響的研究。

本研究主要探討添加SAL對O-CMC/GA復(fù)凝聚反應(yīng)及復(fù)凝聚相性質(zhì)的影響，同時采用差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和動態(tài)流變儀等手段對制備的復(fù)凝聚相進行表征，以確定添加SAL對復(fù)凝聚相功能性質(zhì)的影響。本研究對于開發(fā)新型功能的多糖/多糖復(fù)凝聚體系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CTS（脫乙酰度 95.2%、黏度 500 mPa·s、食品級）：濰坊海之源有限公司；SAL（CP）、GA（食品級）、氫氧化鈉（AR）：上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯乙酸（AR）：天津巴斯夫有限公司；鹽酸、無水乙醇、異丙醇（AR）：萊陽市康德化工有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

UV-2000紫外可見分光光度計：上海尤尼科儀器有限公司；Mar-90恒溫磁力攪拌器：上海亞榮生化儀器廠；SPS401F萬分之一分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DL-5-B低速大容量離心機：上海安亭儀器設(shè)備廠；ZDG-0.25真空冷凍干燥機：煙臺冰輪股份有限公司；NicoletIR200傅里葉變換紅外光譜儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；200PC差示掃描量熱儀：德國耐施儀器公司；JSM-7500F掃描電子顯微鏡：日本電子株式會社；Delta320 pH計：瑞士梅特勒托利多公司；MCR102動態(tài)流變儀：奧地利安東帕有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)凝聚相的制備

根據(jù)Chen等[10]的方法制備O-CMC，通過滴定法確定其取代度為0.35。稱取不同質(zhì)量比的GA和SAL，將其分別溶于去離子水中定容至100 mL，然后等體積混合攪拌均勻，制成不同濃度的GA-SAL溶液，置于4℃冰箱中保存待用。將一定濃度的O-CMC溶液與GA-SAL溶液混合，調(diào)節(jié)pH值，于特定溫度下反應(yīng)1h，4 000r/min離心20 min得到O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相。

1.3.2 復(fù)凝聚反應(yīng)的檢測

1.3.2.1 濁度

復(fù)凝聚反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入1 cm的比色皿中，迅速在600 nm處測定吸光度，以去離子水作為對照。

1.3.2.2 復(fù)凝聚相產(chǎn)率

待復(fù)凝聚反應(yīng)完成后，4 000 r/min離心20 min，收集復(fù)凝聚相，于50℃下干燥至恒重，按下式計算復(fù)凝聚相產(chǎn)率。

1.3.3 復(fù)凝聚反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.3.3.1 pH值對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響

將1%的O-CMC溶液與5%的GA-SAL溶液（其中GA與SAL的質(zhì)量比為99∶1）等體積混合，使混合液的總固形物濃度達到3%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分別調(diào)節(jié)混合液的pH值至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 和 6.5，25 ℃下反應(yīng) 1 h，測定反應(yīng)體系的濁度和復(fù)凝聚相產(chǎn)率。

1.3.3.2 溫度對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響

將1%的O-CMC溶液與5%的GA-SAL溶液（其中GA與SAL的質(zhì)量比為99∶1）等體積混合，使混合液的總固形物濃度達到3%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分別調(diào)節(jié)混合液的pH值至3.0，分別置于4、25、35、45、55 ℃下反應(yīng) 1 h，測定反應(yīng)體系的濁度和復(fù)凝聚相產(chǎn)率。

1.3.3.3 O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比對兩者復(fù)凝聚反應(yīng)的影響

將1%的O-CMC溶液分別與1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的GA-SAL混合溶液（其中GA與SAL的質(zhì)量比為99∶1）等體積混合，此時O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比分別為 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 和 1∶5。用 0.1 mol/L 的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.0，25℃下反應(yīng)1 h，測定反應(yīng)體系的濁度和復(fù)凝聚相產(chǎn)率。

1.3.3.4 SAL含量對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響

將一定量的SAL與GA分別溶于去離子水后混合使其總濃度達到4%，GA與SAL的質(zhì)量比分別為99∶1、74∶1、49∶1 和 24∶1。將上述 GA-SAL 溶液與 1%O-CMC溶液等體積混合，使混合液總固形物濃度達到2.5%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.0，25℃下反應(yīng)1 h，測定反應(yīng)體系的濁度和復(fù)凝聚相產(chǎn)率。

1.3.4 復(fù)凝聚相的表征

將1%的O-CMC溶液與4%的GA-SAL混合溶液（其中GA與SAL的質(zhì)量比為74∶1）等體積混合。采用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分別調(diào)節(jié)混合液的pH值至 3.0、4.5、6.0，25℃下反應(yīng) 1 h，4 000 r/min 離心20 min，收集復(fù)凝聚相進行表征。

1.3.4.1 DSC分析

對 O-CMC、GA、SAL及 O-CMC/GA-SAL 復(fù)凝聚相凍干粉進行DSC分析。取5 mg樣品，分別加入到DSC樣品盒中，以空白盒為參照，試樣在氮氣保護下，以5℃/min的速率從30℃加熱到300℃，通過計算機記錄加熱過程中的差熱曲線。

1.3.4.2 SEM分析

對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相凍干樣品進行SEM分析。掃描電鏡樣品制備方法：在樣品臺上貼一層雙面膠，分別將不同條件下的復(fù)凝聚相放置于樣品臺上，然后在樣品上噴金供SEM觀察，電壓為2kV。

1.3.4.3 流變學(xué)特性

對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的流變學(xué)性質(zhì)進行研究。將樣品置于校正好的動態(tài)流變儀平臺上，在（30±0.2）℃下，用錐板（1°）對樣品在黏彈性范圍內(nèi)進行頻率掃描和觸變測試，板間距離d=0.1 mm。

1.4 統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。采用SPSS統(tǒng)計軟件（SPSS Statistics 17.0.1）進行t檢驗和方差分析，當(dāng)p＜0.05時差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)凝聚反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 pH值對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響

pH值會影響聚電解質(zhì)之間的電荷平衡，是影響復(fù)凝聚反應(yīng)的一個重要因素。pH值對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響見圖1。

圖1 pH值對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of pH on the complex coacervation of O-CMC/GASAL

由圖1可知，pH值對O-CMC與GA-SAL之間的復(fù)凝聚反應(yīng)有重要影響。復(fù)凝聚相產(chǎn)率隨著pH值的增加呈先升高后降低的趨勢，在pH值為3.0時達到最大值57.30%，說明在此pH值下O-CMC與GA-SAL的復(fù)凝聚反應(yīng)程度最大。這一結(jié)果及變化規(guī)律與OCMC/GA復(fù)凝聚反應(yīng)體系一致，即在pH3.0時兩者之間的復(fù)凝聚反應(yīng)最強[11]，反應(yīng)體系中添加一定量的SAL對O-CMC/GA的最適復(fù)凝聚反應(yīng)pH值沒有影響。由圖1可知，反應(yīng)體系的濁度在pH5.0達到最大值，但在pH3.0較小，這與復(fù)凝聚相產(chǎn)率的結(jié)果不一致。這可能是由于在pH3.0時復(fù)凝聚反應(yīng)非常充分，所形成的復(fù)凝聚相聚焦程度高、粒徑大，導(dǎo)致它們在短時間內(nèi)發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)并沉淀，從而使測得的上清濁度偏低。另外，從圖1還可以看出，O-CMC、GA及SAL在試驗所選擇的濃度下于600 nm下均無光吸收，因此在隨后的研究中均不再測定這3種聚電解質(zhì)的吸光度。

2.1.2 溫度對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響

除了靜電吸引之外，聚電解質(zhì)之間的氫鍵和疏水性相互作用在復(fù)凝聚相的形成中也起著重要作用。高溫有利于疏水性相互作用，而低溫則可以促進氫鍵相互作用[12]。溫度對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響見圖2。

圖2 溫度對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of temperature on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL

由圖2可知，溫度對O-CMC/GA-SAL之間的復(fù)凝聚反應(yīng)有重要影響，4℃下復(fù)凝聚相的產(chǎn)率最高，為63.2%；此后隨著反應(yīng)溫度的升高，復(fù)凝聚相產(chǎn)率隨之下降。反應(yīng)體系的濁度則在25℃時最高，此后隨著反應(yīng)溫度的降低或升高均呈現(xiàn)降低的趨勢。結(jié)果表明低溫有利于O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的發(fā)生，說明氫鍵可能在復(fù)凝聚相的形成中起到了重要作用。由于25℃時產(chǎn)率僅比4℃下低5.8%，且25℃下進行復(fù)凝聚反應(yīng)簡單易行，因此選擇25℃為復(fù)凝聚反應(yīng)溫度進行后續(xù)研究。

2.1.3 O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比對兩者復(fù)凝聚反應(yīng)的影響

聚電解質(zhì)之間的配比對于溶液中的靜電平衡有重要影響，因此就pH3.0下O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比對兩者復(fù)凝聚反應(yīng)的影響進行研究，結(jié)果見圖3。

圖3 O-CMC/GA-SAL質(zhì)量比對兩者復(fù)凝聚反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of biopolymer ratio on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL

由圖3可知，O-CMC/GA-SAL質(zhì)量比對兩者的復(fù)凝聚反應(yīng)有重要影響，過大或過小均不利于復(fù)凝聚反應(yīng)的發(fā)生。隨著兩者混合比例的增加，復(fù)凝聚相產(chǎn)率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，當(dāng)兩者質(zhì)量比為1∶4時復(fù)凝聚產(chǎn)率最大，達到了71.8%；而反應(yīng)體系的濁度在兩者質(zhì)量比為1∶2時達到最大，在1∶4時較小，其原因可能為當(dāng)O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比為1∶3和1∶4時，反應(yīng)體系復(fù)凝聚相的聚集程度最大，迅速形成沉淀，導(dǎo)致測定的濁度降低；當(dāng)兩者的混合比例隨之增加或降低時，由于復(fù)凝聚相聚集程度降低，大部分復(fù)合物呈懸浮狀態(tài)，雖然復(fù)凝聚相的產(chǎn)率有所降低，但是測得的濁度仍然較高。當(dāng)兩者的質(zhì)量比為1∶1時，由于復(fù)凝聚相產(chǎn)率過低，兩者的相互作用程度較弱，形成的復(fù)凝聚相較少，導(dǎo)致濁度最低。因此選擇O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比為1∶4進行后續(xù)試驗。

2.1.4 SAL含量對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響

GA-SAL復(fù)合物中SAL含量對復(fù)凝聚反應(yīng)的影響見圖4。

圖4 SAL含量對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of SAL content on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL

由圖4可知，隨著GA-SAL復(fù)合物中SAL所占比例的降低，復(fù)凝聚相產(chǎn)率呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢且在質(zhì)量比為74∶1時達到最大；當(dāng)質(zhì)量比為99∶1時復(fù)凝聚相產(chǎn)率不再顯著變化。這是由于復(fù)凝聚反應(yīng)的最適pH值為3.0，該pH值低于SAL中古羅糖醛酸和甘露糖醛酸的解離常數(shù)（3.20和3.38）[13]，因此SAL攜帶的負(fù)電荷含量較少甚至不帶電荷而無法參與復(fù)凝聚反應(yīng)，導(dǎo)致復(fù)凝聚相產(chǎn)率隨著SAL含量的增加而降低。添加不同量SAL時所得復(fù)凝聚相的濁度無顯著性差異。當(dāng)GA與SAL復(fù)合物的質(zhì)量為99∶1時，復(fù)凝聚相產(chǎn)率最高為70.4%?？紤]到GA與SAL質(zhì)量比為99∶1和74∶1時復(fù)凝聚相產(chǎn)率的差異不顯著，采用質(zhì)量比74∶1進行后續(xù)研究。

2.2 復(fù)凝聚相的表征

2.2.1 DSC分析

O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的DSC分析結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同pH值下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的DSC圖譜Fig.5 DSC patterns of O-CMC/GA-SAL complex coacervates separated in different pH

由圖5可知，所有的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相均出現(xiàn)了兩個吸熱峰和一個放熱峰。第一個吸熱峰可歸因于水分的蒸發(fā)，第二個吸熱峰是由于破壞基團之間的靜電相互作用和復(fù)凝聚相的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)需要吸收能量引起的[14-15]，而放熱峰是由于O-CMC分解所致[16]。

O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相峰值溫度見表1。

表1 O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相峰值溫度Table 1 Peak temperatures of O-CMC/GA-SAL coacervats in DSC thermogram

由表1可知，O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相第一吸熱峰溫度隨著pH值增大而降低，這可能是由于復(fù)凝聚相在制備過程中，隨著pH值的升高，羧基和水分子的氫鍵作用力隨之降低，使得第一吸熱峰溫度隨著pH值增加而降低。O-CMC、GA、SAL均沒有出現(xiàn)第二吸熱峰，但是三者發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)后在220℃左右均出現(xiàn)了吸熱峰，該吸熱峰是由于靜電相互作用被破壞所致，因此DSC分析證實了三者之間發(fā)生了復(fù)凝聚反應(yīng)。pH6.0時所得復(fù)凝聚相的放熱峰溫度（276.96℃）明顯高于其它兩個pH值，說明O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的熱穩(wěn)定性隨著pH值的增加而提高。

2.2.2 SEM分析

當(dāng)SAL含量占聚陰離子總量的1/75時，在pH3.0、4.5、6.0條件下制備所得O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的微觀結(jié)構(gòu)分別如圖6所示。

圖6 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的掃描電鏡圖Fig.6 SEM micrographs of O-CMC/GA-SAL coacervates separated in pH3.0，pH4.5 and pH6.0

由圖6可知，在3個pH值下制備的O-CMC/GASAL復(fù)凝聚相均具有明顯的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且隨著復(fù)凝聚反應(yīng)pH值的上升，O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密度有所增加，且孔穴的孔徑逐漸減小。通過與未添加SAL的O-CMC/GA復(fù)凝聚相相比[17]，添加SAL后復(fù)凝聚相的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加規(guī)則，孔徑分布更加均勻，說明此時的復(fù)凝聚相更適合用于敏感成分的包埋。

2.2.3 流變學(xué)特性

2.2.3.1 O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的觸變特性

O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的觸變特性見圖7。

圖7 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的觸變特性Fig.7 Thixotropic properties of O-CMC/GA-SAL coacervates prepared at pH3.0，pH4.5 and pH6.0

由圖7可知，在不同pH值條件下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相均為假塑性流體[18]，即隨著剪切速率的增加，黏度迅速降低，說明復(fù)凝聚相具有剪切變稀特性；當(dāng)剪切應(yīng)力撤銷時，復(fù)凝聚相的結(jié)構(gòu)重新排列，下行線始終低于上行線，黏度僅部分恢復(fù)[19]。說明復(fù)凝聚相在受到外力時，復(fù)凝聚相的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重新排列，形成了新結(jié)構(gòu)，并且新結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性低于之前的結(jié)構(gòu)。

反應(yīng)pH值對復(fù)凝聚相的觸變特性具有一定影響。pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的起始黏度明顯大于pH3.0下制備的復(fù)凝聚相，這可能是由于O-CMC和GA之間的復(fù)凝聚反應(yīng)逐漸增強所致。當(dāng)pH4.5及pH6.0條件下所得的復(fù)凝聚相的黏度在剪切力逐漸降低時均極低，在剪切力的作用下其結(jié)構(gòu)被破壞，當(dāng)外力撤銷時無法恢復(fù)到初始黏度。

2.2.3.2 O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的黏彈性

在不同pH值下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的黏彈特性見圖8。

圖8 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的黏彈特性Fig.8 Viscoelastic properties of O-CMC/GA-SAL coacervates separated in pH3.0，pH4.5 and pH6.0

由圖8可知，O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相在剪切頻率逐漸增加的過程中儲能模量始終大于損失模量，表現(xiàn)出類似固體彈性行為[20]。不同pH值下形成的復(fù)凝聚相黏彈性有所差異。在剪切頻率增加過程中，在pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的儲能模量和損失模量明顯大于pH3.0下制備的復(fù)凝聚相。這表明可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值來獲得具有特定黏彈性的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相。

3 結(jié)論

通過探討SAL對O-CMC/GA復(fù)凝聚反應(yīng)及復(fù)凝聚相性質(zhì)的影響，以確定添加SAL對復(fù)凝聚相功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，與O-CMC/GA體系相比，添加SAL對其最適反應(yīng)條件無顯著影響，即最適反應(yīng)條件為pH3.0、O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比1∶4、反應(yīng)溫度25℃、反應(yīng)時間1 h。SAL的含量對O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的微觀結(jié)構(gòu)有一定影響，隨著SAL含量的增加，復(fù)凝聚相的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密；含SAL的O-CMC/GA復(fù)凝聚相均為假塑性流體，且主要表現(xiàn)出固體彈性性質(zhì)，這對于開發(fā)多糖/多糖復(fù)凝聚體系新功能具有重要意義。