OSIRE Tolbert,楊套偉,喬郅鈉,孫楊,徐美娟,張顯,邵明龍,饒志明

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

戊二胺是殺菌劑、藥物、織物柔軟劑、可生物降解的塑料以及添加劑等的主要原料[1-2]。在工業(yè)生產(chǎn)中,戊二胺可作為高分子合成前體物質(zhì),通過聚合反應(yīng)形成新的聚酰胺酯。目前,全球每年對聚酰胺產(chǎn)品需求量逐年上漲,但其主要合成方式依賴于以石油為原料的化工合成[3]。使用廉價且可再生原料(如葡萄糖、L-賴氨酸等)通過微生物法生產(chǎn)戊二胺已成為當(dāng)前研究的熱點[4-5]。先前已經(jīng)設(shè)計了許多天然高L-賴氨酸/氨基酸生產(chǎn)菌株,特別是谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌[6-7]。

氨基酸脫羧酶廣泛應(yīng)用于各種生物胺的合成,氨基酸脫羧酶主要分為2大類：磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)依賴型和丙酮酸依賴型。PLP依賴型酶通常催化多種反應(yīng),其活性位點內(nèi)的賴氨酸殘基高度保守,從而促進(jìn)其與輔因子PLP結(jié)合[8]。賴氨酸脫羧酶是催化L-賴氨酸脫羧生成戊二胺關(guān)鍵酶,其需要PLP作為輔因子。大腸桿菌賴氨酸脫羧酶ldcC通過破壞lysE并通過強(qiáng)合成啟動子H30調(diào)節(jié)其表達(dá),通過整合在谷氨酸棒桿菌PKC染色體上,從而穩(wěn)定表達(dá),經(jīng)分批補(bǔ)料,產(chǎn)量約103.78 g/L戊二胺[9]。WANG等[10]應(yīng)用定向進(jìn)化,易錯PCR誘變和DNA改組來改造H.alvei賴氨酸脫羧酶,在全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化5 h后實現(xiàn)了63.9 g/L尸胺的生產(chǎn),是原始菌株的1.48倍。KOU等[11]通過突變十聚體界面殘基T88S,獲得了一種具有良好熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的大腸桿菌賴氨酸脫羧酶變體。

脫羧酶應(yīng)用廣泛,但是由于反應(yīng)的多樣性,它們的工業(yè)應(yīng)用仍然相對有限。因此,探索具有高效生物催化活性和生化特性(如熱穩(wěn)定性,獨特的底物特異性)的脫羧酶已成為工業(yè)化合物生物合成的研究熱點。目前,L-賴氨酸脫羧酶存在酶活力不高、穩(wěn)定性較差、生物合成體系效率低的問題。本研究中,我們從不同的微生物中篩選并表征了4個L-賴氨酸脫羧酶,由于粘質(zhì)沙雷氏菌來源的新型賴氨酸脫羧酶(SmcadA)具有相對較高的生物催化活性和良好的工業(yè)屬性,對其活性位點附近氨基酸殘基進(jìn)行了定點突變,顯著提高了其催化合成戊二胺的能力,為其工業(yè)化生產(chǎn)戊二胺提供了實驗和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)和質(zhì)粒pMD18T、pET28a由本實驗室保藏。

1.1.2 酶和試劑

BamH I、Hind III限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶等,TaKaRa公司；高保真酶、同源重組酶克隆試劑盒,南京諾維贊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒,上海捷瑞生物工程有限公司；卡那霉素、氨芐青霉素,生工生物工程(上海)股份有限公司；L-Lys,麥克林(北京)股份有限公司；戊二胺標(biāo)準(zhǔn)品及其他分析純試劑,Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0,胰蛋白10.0,NaCl 10.0。

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0,胰蛋白棟10.0,NaCl 10.0,瓊脂粉20。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒提取和引物的設(shè)計

本文中涉及到的引物如表1所示。

表1 本研究使用到的引物Table 1 Primers used in the study

1.2.2 重組菌株的構(gòu)建

分別以粘質(zhì)沙雷氏菌Db11、氧化葡糖桿菌DSM 3504、惡臭假單胞菌KT2440、蠟狀芽孢桿菌ATCC4342和地衣芽孢桿菌DSM13基因組DNA為模板,利用表1中列出的相關(guān)引物擴(kuò)增賴氨酸脫羧酶編碼基因。將擴(kuò)增所得基因連接到事先用相應(yīng)的限制酶消化的pET28a表達(dá)載體上,然后轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,得到重組菌株分別命名為BL21/pET28a-SmcadA、BL21/pET28a-GoLDC、BL21/pET28a-PpLDC、BL21/pET28a-BcLDC和BL21/pET-28a-BlLDC。通過雙酶切和測序驗證轉(zhuǎn)化是否成功。

1.2.3 SmcadA表達(dá)和純化

挑選單菌落并接種于含有25 μg/mL氨芐青霉素的10 mL LB培養(yǎng)基中,在37 ℃、180 r/min下過夜培養(yǎng)。然后將1%的過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至50 mL含25 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,在37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)2 h,然后添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo),在28 ℃、180 r/min培養(yǎng)16 h。發(fā)酵培養(yǎng)后,在4 ℃下以8 000 r/min離心10 min,收集細(xì)胞,然后用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌后超聲處理15 min,然后以10 000 r/min離心20 min收集上清酶液。使用配備GE Life Sciences公司的His-TrapTMHP色譜柱的AKTA Prime系統(tǒng)(瑞典GE Healthcare)純化蛋白。將粗酶(5 mL)以0.5 mL/min的流速上樣到色譜柱上,結(jié)合緩沖液為pH 7.4的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液和0.5 mol/L NaCl組成,然后在1 mL/min流速下以0～0.5 mol/L咪唑線性梯度洗脫。最后,使用pH 7.0的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液通過透析從純化的蛋白中去除過量的咪唑[12]。純化后的酶用于酶活性測定,并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析其純度,剩余樣品用于后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)表征實驗。

1.2.4 催化合成戊二胺

將培養(yǎng)的發(fā)酵液離心,倒去上清液,收集菌體細(xì)胞,用50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)洗滌2次,然后將收集到的細(xì)胞懸浮在50 mmol/L乙酸鈉緩沖液中,并用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)初始pH。反應(yīng)混合物由500 mmol/L乙酸鈉緩沖液、0.5 mol/LL-賴氨酸、1.5 mmol/L PLP和200 μL細(xì)胞(最終OD600 nm=10)組成,并添加優(yōu)化的十六烷基三甲基溴化銨。將反應(yīng)混合物在37～80 ℃下孵育1 h,然后將反應(yīng)混合物在100 ℃加熱5 min終止酶反應(yīng)。最后,將樣品以10 000 r/min離心20 min獲得上清液,以備HPLC分析。

1.2.5 產(chǎn)物分析

對樣品進(jìn)行衍生化和分析,用乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(diethyl ethoxymethylidenemalonate，DEEMM)衍生L-賴氨酸和尸胺,衍生化體系包括：75 μL反應(yīng)混合物樣品、4.5 μL DEEMM、70.5 μL蒸餾水、150 μL 100%甲醇和450 μL 50 mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)。將衍生化后混合物在渦旋混合儀中劇烈混合,然后在70 ℃加熱2 h以去除多余的DEEMM和副產(chǎn)物。隨后,將樣品以10 000 r/min離心5 min后,用0.22 μm膜過濾,然后用HPLC系統(tǒng)(Platisil 5 μm ODS色譜柱,250 mm×4.6 mm)進(jìn)行分析。柱溫度設(shè)定在35 ℃,流動相由100%乙腈(A)和25 mmol/L乙酸鈉水溶液(pH 4.8)(B)組成,流速1 mL/min,溶劑梯度如下：0～2 min,20%～25%A；2～20 min,25%～60%A；20～25 min,60%～20%A。

1.2.6 位點定向誘變

HotSpot Wizard 3(https://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard)是以預(yù)測突變熱點功能和進(jìn)化數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),而在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能上替換氨基酸是由在線工具PredictSNP(http://loschmidt.chemi.muni.cz/predictsnp)[10]和Mutpred2[11](http://mutpred2.mutdb.org)進(jìn)行操作。將SmcadA與同源賴氨酸脫羧酶進(jìn)行序列比對,在DNAMAN上驗證突變殘基。與主流的OE-PCR技術(shù)相比,用改良的組合重疊擴(kuò)展PCR方法對重組蛋白進(jìn)行定點突變是一種快速且準(zhǔn)確對相關(guān)目的基因進(jìn)行點突變的方法。簡單地說,該方法涉及2個標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)：一級反應(yīng)和從一級反應(yīng)中提取的PCR擴(kuò)增物作為二級反應(yīng)模板。第一反應(yīng)包含100 ng DNA模板,超保真DNA聚合酶2×Phanta Max Master mix 25 μL,引物1 μL,并加蒸餾水至50 μL。第一反應(yīng)混合物,正向引物和反向引物見表1。

使用PCR程序如下：95 ℃初始變性5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃聚合1.5 min,72 ℃保持5 min。PCR產(chǎn)物(10 μL)在1%瓊脂糖凝膠上用溴化乙錠染色。以pET28a-SmcadA-F和pET28a-SmcadA-R分別作為正向引物和反向引物進(jìn)行2次PCR反應(yīng),每一個初級PCR產(chǎn)物(200 ng)作為模板。PCR程序的使用是相同的,除了退火步驟涉及10個周期,不同于初級階段。2次PCR結(jié)果在1%瓊脂糖凝膠上用溴化乙腈染色。將突變片段克隆到表達(dá)質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中,測序,核實測序結(jié)果證實構(gòu)建成功。

1.2.7 定點突變及分子動力學(xué)分析

在引物中引入突變堿基,通過2輪PCR將突變位點引入到基因中,將第一輪PCR獲得的2種PCR產(chǎn)物在第二輪PCR反應(yīng)中用作模板,PCR反應(yīng)條件如OSIRE等[12]所述。為了解定點突變對蛋白與底物相互作用的機(jī)制,在Gromacs中對SmcadA及其突變體與底物L(fēng)-賴氨酸進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬[13]。通過添加氫離子和最小化共軛梯度,對蛋白分子(野生型和突變型)和賴氨酸底物結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行了在線(https://www.swissparam.ch)分子對接。分析了主鏈均方根偏差(root mean squared deviation,RMSD)和蛋白質(zhì)殘基均方根波動(root mean squared fluctuation,RMSF)值,并在USCF Chimera軟件和Graphpad Prism 8中評估了潛在的蛋白質(zhì)-底物相互作用,并繪制圖形說明。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌構(gòu)建與表達(dá)

分別以氧化葡糖桿菌DSM3504(GoLDC)、地衣芽孢桿菌DSM13(BlLDC)、惡臭假單胞菌KT2440(Pp LDC)和粘質(zhì)沙雷氏菌W2.3(SmcadA)的基因組為模板,利用表1中的引物,通過PCR擴(kuò)增不同來源的賴氨酸脫羧酶編碼基因,分別克隆到pET28a中,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21。菌落PCR和基因測序驗證重組菌構(gòu)建成功。并在Expasy ProtParam網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(https://web.expasy.org/protparam)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析。

同源的賴氨酸脫羧酶蛋白序列,GoLDC,BlLDC,PpLDC和SmcadA蛋白的理論等電點(pI)為5.69、5.96、6.13和5.92,分子質(zhì)量分別約為51.28 k、55.78 k、81.95 k和81.11 kDa。重組菌誘導(dǎo)表達(dá)16 h后,利用SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況及其分子質(zhì)量。圖1結(jié)果表明,4種來源的賴氨酸脫羧酶均在大腸桿菌BL21中成功表達(dá),BlLDC和GoLDC的分子質(zhì)量為55和50 kDa,而PpLDC和SmcadA的分子質(zhì)量約為75 kDa。

圖1 SDS-PAGE表征蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression analysis on SDS-PAGE a圖：M-蛋白Marker；泳道1,2-E.coli BL21/pET28a-BlLDC細(xì)胞破碎上清液；泳道3,4-E.coli BL21/pET28a-GoLDC細(xì)胞破碎上清液；b圖：M-蛋白Marker；泳道1-E.coli BL21細(xì)胞破碎上清液；泳道2-E.coli BL21/pET28a細(xì)胞破碎上清液；泳道3,4-分別是E.coli BL21/pET28a-PpLDC和E.coli BL21/pET28a-SmcadA細(xì)胞破碎上清液

2.2 賴氨酸脫羧酶酶學(xué)特性

賴氨酸脫羧酶酶活力受pH、溫度、底物和輔因子濃度的影響[14]。因此,為了探究重組賴氨酸脫羧酶將L-賴氨酸轉(zhuǎn)化為戊二胺的最佳條件,考察了其pH在4.0～10.0和溫度在30～80 ℃下的相對酶活力。結(jié)果如圖2所示,GoLDC和PpLDC在pH為9.0時均具有最高活性,SmcadA在pH為6.0時活性最高,而BlLDC在中性pH為7.0時具有最高活性。另外,GoLDC、PpLDC和SmcadA在5.0～9.0的pH范圍內(nèi)均具有較高活性。GoLDC和PpLDC的最適溫度均為30 ℃,SmcadA的最適溫度為40 ℃,而BlLDC的最適溫度為60 ℃。

a-pH；b-溫度圖2 pH和溫度對賴氨酸脫羧酶活性的影響Fig.2 Effects of pH and temperature on the activities of lysine decarboxylase 注：最適條件下比酶活力分別是PpLDC 201.79 U/mg、BlLDC 106.60 U/mg、GoLDC 143.76 U/mg和SmcadA 219.60 U/mg

2.3 全細(xì)胞催化合成戊二胺

反應(yīng)體系包含：全細(xì)胞、500 mmol/L鄰乙酸鈉緩沖液、0.5 mol/LL-賴氨酸和輔因子PLP。然后將混合物在其各自的最佳條件下反應(yīng),每1 h回收細(xì)胞循環(huán)使用,結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知,12 h后,含有來自粘質(zhì)沙雷氏菌(SmcadA)LDC的重組菌株具有最高的賴氨酸轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率為98.1%,PpLDC為87.7%,GoLDC為71.0%,BlLDC為63.7%(圖3-a)。圖3-b結(jié)果還表明,利用固定后的SmcadA重組菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)化,尸胺的產(chǎn)量為159.24 g/L,是未固定的SmcadA(cadA-Alg)的1.29倍(123.44 g/L)。由于SmcadA重組菌株具有很高的生物催化活性,因此對該菌株進(jìn)行了進(jìn)一步的工程設(shè)計和優(yōu)化。

2.4 定點突變

前期研究發(fā)現(xiàn),輔因子PLP通過與蛋白質(zhì)殘基和金屬離子通過氫鍵和范德華力的直接/間接相互作用,改變了結(jié)合位點內(nèi)殘基的構(gòu)象,并改變了輔助因子PLP結(jié)合方向,對SmcadA活性起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[13],這些因此顯著影響其生物催化活性。此外,KANJEE等[15]成功獲得了LDC酶活力明顯提高的單點突變體R206S。

a-GoLDC、BlLDC、PpLDC和SmcadA尸胺的合成情況； b-尸胺在25 h內(nèi)的生物合成情況圖3 尸胺的生物合成和優(yōu)化Fig.3 Cadaverine biosynthesis and optimization

利用在線工具HotSpot Wizard 3.0生成可行的突變熱點。一些氨基酸殘基被預(yù)測參與底物結(jié)合從而影響最終的產(chǎn)物合成。其中Gly348、Ala301、Pro530、Lys325和Val384預(yù)測為穩(wěn)定性熱點。對其進(jìn)行定點突變,篩選尸胺合成效率提高和熱穩(wěn)定性提高的正向突變株。進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析以確定同源相似性,并利用DAMAN分析軟件來評估Gly348預(yù)測的可變區(qū)域的4個脫羧酶之間的進(jìn)化差異。結(jié)果表明,GoLDC和SmcadA含有丙氨酸和甘氨酸殘基,而BlLDC和PpLDC在相同位點具有賴氨酸殘留物(圖4)。

圖4 蛋白質(zhì)同源性分析Fig.4 Protein homology analysis 注：Pseudomonas putida KT2440來源的賴氨酸脫羧酶簡寫為PpLDC；Serratia marcescens W2.3來源的賴氨酸脫羧酶簡寫為SmcadA,Bacillus licheniformis DSM 13來源的賴氨酸脫羧酶簡寫為BlLDC,Gluconobacter oxydans DSM 3504 來源的賴氨酸脫羧酶簡寫為GoLDC

2.4.1 突變體結(jié)構(gòu)解析

本研究中,我們對活性位點內(nèi)的關(guān)鍵殘基Gly348進(jìn)行了定點突變,提高了脫羧活性。在最佳條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,突變菌株Gly348Ala在25 h內(nèi)可轉(zhuǎn)化320 g/L的L-賴氨酸生成218.16 g/L的戊二胺,轉(zhuǎn)化率達(dá)到97.26%,生產(chǎn)效率達(dá)到8.73 g/(L·h)。這與HAN等對底物結(jié)合位點附近的負(fù)電荷殘基進(jìn)行點突變是一致的,他們發(fā)現(xiàn)底物結(jié)合位點對于L-賴氨酸轉(zhuǎn)化生成尸胺具有重要影響。

為了解析突變株Gly348Ala較野生型SmcadA具有更好生物催化性能的原因,利用底物L(fēng)-賴氨酸對這2種蛋白質(zhì)模型進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬。模擬結(jié)果顯示,突變株Gly348Ala中α氨基的賴氨酸與Arg558殘基通過氫鍵相互作用,而原始菌株中,底物與周圍金屬離子直接形成氫鍵(圖5)。此外,賴氨酸殘基的羧基與Glu202形成氫鍵相互作用。除了一系列的交互Arg97和Glu74,先前的報道強(qiáng)調(diào)了Arg在蛋白質(zhì)活性中的關(guān)鍵作用,這是因為強(qiáng)烈的相互作用力破壞活性位點殘基的構(gòu)象[16]。精氨酸胍基側(cè)鏈具有特殊的水化特性,促進(jìn)與活性位點內(nèi)其他殘基的非極性芳香族側(cè)鏈和脂肪族側(cè)鏈相互作用,在我們的模擬中,底物明顯與Leu562、Leu564和Glu75形成范德華力相互作用[17]。

圖5 Gly348Ala突變體的分子動力學(xué)模擬Fig.5 Molecular dynamics simulations of Gly348Ala mutant 注：突變體Gly348Ala中蛋白質(zhì)殘基、底物L(fēng)-賴氨酸和金屬離子之間的相互 作用。青色棒代表氫鍵,紫色球代表金屬離子,綠色球代表水分子(下同)。

另外,由于Arg殘基的柔性性質(zhì),它容易與不同的底物相互作用。如先前報道的酶活性位點內(nèi),Arg558和Arg97通過形成鹽橋從而促進(jìn)酶與底物的相互作用[18]。據(jù)報道在某些PLP依賴性脫羧酶中,高度保守的Glu殘基可通過氫鍵或鹽橋與PLP吡啶環(huán)氮相互作用。結(jié)果表明,Glu202與底物L(fēng)-賴氨酸的羧酸酯基團(tuán)之間存在獨特的氫鍵相互作用,并且這些相互作用可能會增強(qiáng)Gly348Ala突變菌株的生物催化活性。

在野生型SmcadA中,Lys134和Leu129與底物L(fēng)-賴氨酸形成直接鍵(圖5)。賴氨酸殘基在脫羧酶活性方面的作用以前已有報道。賴氨酸負(fù)責(zé)形成希夫堿,促進(jìn)脫羧酶催化反應(yīng)中的轉(zhuǎn)醛縮[19]。TONEY等[20]報道,Lys殘基在質(zhì)子轉(zhuǎn)移中也起重要作用[21]。另一方面,亮氨酸殘基被認(rèn)為是惡臭假單胞菌3,4-二羥基苯基丙氨酸脫羧酶物特異性低的原因。

圖6 野生型SmcadA的分子動力學(xué)模擬Fig.6 Molecular dynamics simulations of SmcadA wildtype

活性位點上疏水殘基原則上可以增強(qiáng)SmcadA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和底物結(jié)合親和力。然而,菌株細(xì)胞的低活性可歸因于酶的低活性,這可能是由于殘基較大的側(cè)鏈導(dǎo)致進(jìn)入活性位點通道受限。如圖7所示,RMSD和RMSF表明,與野生型SmcadA相比,Gly348Ala關(guān)鍵區(qū)域的柔韌性有所提高,這也是該突變體的催化活性提高的原因之一。

a-野生酶及突變酶的RMSD值；b-野生酶及突變酶的RMSF值圖7 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性Fig.7 Protein structure stability

3 結(jié)論與討論

在本研究中,篩選和表征了4種不同微生物來源的賴氨酸脫羧酶,發(fā)現(xiàn)來源于粘質(zhì)沙雷氏菌的SmcadA具有較好的戊二胺合成活性。為了進(jìn)一步提高SmcadA脫羧活性,通過結(jié)構(gòu)分析,確定對活性位點附近的Gly348位點進(jìn)行定點突變,獲得了活性明顯提高的突變體Gly348Ala。為了進(jìn)一步解析Gly348Ala突變脫羧活性提高的機(jī)理,將底物L(fēng)-賴氨酸分別與SmcadA和突變體進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬,結(jié)果表明,突變蛋白中殘基和底物之間的相互作用得到改善。Gly348Ala突變體與Arg558和Glu202形成了2個直接氫鍵,與周圍的金屬離子形成了另外5個氫鍵,而野生型SmcadA只有6個直接氫鍵,其中2個與Leu129和Lys134形成,其余與金屬離子形成。突變菌株Gly348Ala在25 h內(nèi)可轉(zhuǎn)化320 g/L的L-賴氨酸生成218.16 g/L的戊二胺,轉(zhuǎn)化率達(dá)到97.26%,生產(chǎn)效率達(dá)到8.73 g/(L·h),比野生型SmcadA提高了1.37倍。該研究結(jié)果為戊二胺的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供了實驗和理論基礎(chǔ),具有重要的參考價值。接下來,探究通過優(yōu)化底物、輔因子需求以及調(diào)控氧氣供應(yīng),進(jìn)一步提高戊二胺合成效率,將是我們下一步工作的重點。