郭世鑫,張小娜,姚孟琦,馬文瑞,賈士儒,李紅*,董建輝,姜欣

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300222) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)

醬香型白酒是中國傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)白酒的代表,其中的典型代表茅臺(tái)酒更是馳名中外,具有醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體醇厚、回味悠長、空杯留香持久等特點(diǎn)[1]。醬香型白酒的釀造工藝“2次投糧,9次蒸煮,8次發(fā)酵,7次取酒”及“高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒以及生產(chǎn)周期長、貯存期長、用曲量大”等特殊工藝是形成醬香型白酒典型風(fēng)格的重要原因[2-4]。醬香酒工藝分為坤沙、碎沙、翻沙和竄沙工藝。坤沙工藝是醬香酒工藝最好的一種,也是傳統(tǒng)的醬香酒釀造工藝[5-6],使用大約80%完整的高粱進(jìn)行釀造。碎沙工藝是指高粱全部粉碎后再進(jìn)行堆積發(fā)酵后蒸餾取酒。翻沙工藝是用坤沙工藝最后一輪發(fā)酵蒸餾取酒后的酒糟,加入一些粉碎的高粱和大曲,進(jìn)行發(fā)酵蒸餾出酒。竄沙工藝是用坤沙工藝完成后丟棄的酒糟,加入食用酒精,然后進(jìn)行蒸餾取酒,市場上嚴(yán)厲打擊這種工藝生產(chǎn)的酒[7-10]。

紫外可見光譜儀器(ultraviolet-visible spectrophotometer,UV-Vis)屬于常用光譜設(shè)備,儀器便攜廉價(jià)、測試簡單快速,基于這一設(shè)備的白酒品牌判別方法開發(fā)較易于推廣使用,因而具有較高的現(xiàn)場測試的應(yīng)用價(jià)值,可以滿足現(xiàn)場執(zhí)法的需求。近年來,紫外光譜法在白酒品牌快速鑒別中已有應(yīng)用[11]。白酒的揮發(fā)性風(fēng)味化合物具有成分復(fù)雜、含量低的特性,應(yīng)選擇合適的分析技術(shù)進(jìn)行組合,主要分析儀器有GC-MS、二維氣相色譜-質(zhì)譜(two-dimensional GC-MS,GC/GC-MS)；通常使用離子色譜法、高效液相色譜法、超高效液相色譜法和核磁共振法等對非揮發(fā)性組分進(jìn)行檢測[12]。

隨著醬香酒市場的擴(kuò)大,人們在辨別傳統(tǒng)坤沙酒和碎沙、翻沙、竄沙酒,尤其是辨別竄沙酒,主要靠白酒品評專家實(shí)現(xiàn)人工鑒別。本研究旨在通過紫外光譜法結(jié)合GC-MS、離子色譜(ion chromatography,IC)分析辨別坤沙醬香酒與其他工藝的醬香酒,并聚類分析輪次酒與成品酒。紫外光譜的吸光度值通過應(yīng)用相似度和主成分分析(principal component analysis,PCA)區(qū)別坤沙工藝醬香酒和其他工藝的醬香酒,并找出與成品酒成分相近的輪次酒。揮發(fā)性物質(zhì)含量應(yīng)用PCA和偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)進(jìn)一步區(qū)別坤沙工藝醬香酒和其他工藝的醬香酒,明確與成品酒香氣相近的輪次酒,并識別重要的標(biāo)記揮發(fā)性化合物。之后,對標(biāo)記揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定和定量,然后進(jìn)行層次聚類分析以聚類不同工藝類型的醬香型白酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣取自茅臺(tái)鎮(zhèn)某知名酒廠,相關(guān)信息見表1。

表1 白酒酒樣信息Table 1 Information of the Baijiu samples

1.2 儀器與設(shè)備

50 mL容量瓶,河北中儀偉創(chuàng)試驗(yàn)儀器有限公司；UV-1780型紫外分光光度計(jì),島津企業(yè)管理(中國)有限公司；Clarus 600型GC-MS聯(lián)用儀,美國PerkinElmer公司；固相微萃取進(jìn)樣器、固相微萃取柱(50/30 μm,DVB/CAR/PDMS),美國Supelco公司；ICS-3000型離子色譜儀：配有EluGen Cartridge 淋洗液自動(dòng)發(fā)生器、電導(dǎo)檢測器和Chrromeleon 6.80色譜工作站、Ionpac AS11-HC型分離柱(250 mm×4 mm)、Ionpac AG11-HC型保護(hù)柱(50 mm×4 mm),美國Dionex公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紫外光譜實(shí)驗(yàn)方法

用蒸餾水做空白對照液,取5 mL的酒樣于50 mL容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度線,然后移取適量樣品在石英比色皿中在200～400 nm下進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.2 GC-MS對微量風(fēng)味成分的定量分析

將分析酒樣用超純水降度至10%,移取一定量稀釋后的酒樣于20 mL的頂空瓶中,加入NaCl飽和,然后加入內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,放入磁力攪拌轉(zhuǎn),密封。插入萃取頭,纖維頭置于距離酒樣表面約20 mm的上部空間,攪拌約l5 min,在50 ℃水浴溫度下萃取,先預(yù)熱15 min,萃取30 min后,取出手柄,直接進(jìn)樣分析。

1.3.3 離子色譜法對有機(jī)酸類的定量測量

將樣品稀釋50倍直接進(jìn)樣,可直接定量含量較高且保留時(shí)間靠前的部分有機(jī)酸(如乳酸、乙酸等)；將一定量的酒樣氮吹至少量,用超純水定容至一定體積,最終濃縮4倍進(jìn)樣檢測,可以定量含量較低且保留時(shí)間靠后的有機(jī)酸(如二元酸)。

1.3.4 GC-MS、離子色譜分析條件

氣相色譜條件：DB-WAX ETR型色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫箱升溫程序：初始溫度35 ℃,恒溫2 min,以4 ℃/min升至230 ℃,保持7 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃,載氣為He,流速為1.0 mL/min,不分流。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(electron impact,EI)離子源,電子能量70 eV,傳輸線溫度240 ℃,離子源溫度240 ℃,質(zhì)量掃描m/z55～500。

離子色譜條件：淋洗液流速1.0 mL/min；電導(dǎo)檢測器檢測；進(jìn)樣量25 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SIMCA 14、Origin、Microsoft Excel 2019、IBM SPSS Statistics 26.0和TBtools進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同工藝醬香酒的紫外光譜分析

如圖1所示,醬香酒制曲釀酒工藝、釀酒原料與其他香型白酒差異較大,其中實(shí)驗(yàn)用醬香型3、4、5、6輪次酒、成品酒和翻沙酒的吸光度值超出了儀器檢測范圍,這些酒除了翻沙酒都是坤沙工藝酒。從紫外光譜曲線看,碎沙工藝酒和竄沙工藝酒是容易區(qū)分于坤沙酒的,翻沙酒不容易區(qū)分[13]。

圖1 不同輪次、工藝醬香酒的紫外光譜圖Fig.1 UV spectroscopy of Maotai-flavor Baijiu with different batches and processes

在醬香酒中除含有酯類、有機(jī)酸、高級醇類等香味物質(zhì)外,糠醛也是一類重要的香味成分?？啡┦且粺o色油狀的液體,化學(xué)性質(zhì)活潑,易進(jìn)行氧化、縮合等反應(yīng),與空氣接觸會(huì)快速變成黃色,具有苦杏仁味?？啡┦欠枷阕宓娜?結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)共輒雙鍵,使得π→π*躍遷能量降低。當(dāng)200～400 nm波長的紫外光照射酒樣時(shí),糠醛中不飽和鍵中的π電子吸收光波能量后躍遷到π*反鍵軌道上,形成吸收光譜,其在276 nm處有較強(qiáng)的特征吸收[14-15]。在曲線中可以明顯看到有1個(gè)明顯的吸收峰,假設(shè)超出檢測限的吸光度A值是4,根據(jù)對應(yīng)關(guān)系依次命名為F,對應(yīng)的波長λ和吸光度值A(chǔ)如表2 所示。醬香白酒中的糠醛主要是通過釀酒輔料帶入的,如麩皮、高粱殼、稻殼、玉米芯等填充輔料。不同產(chǎn)地、輪次、工藝的醬香型白酒因釀酒原料、氣候溫度、生產(chǎn)條件、發(fā)酵時(shí)間等不同,其糠醛含量必然存在差異。醬香型白酒的糠醛含量高于其他香型的白酒,它是區(qū)分醬香型白酒與其他香型白酒的重要依據(jù)之一[16]。

表2 最大吸光度值及對應(yīng)波長Table 2 The maximum absorbance value and corresponding wavelength

PCA是1種基于最大統(tǒng)計(jì)學(xué)距離投影的降維方法,方法是將每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)僅投影到最初的幾個(gè)主要成分上,以獲得較低維的數(shù)據(jù),同時(shí)保留盡可能多的數(shù)據(jù)變化。設(shè)超出儀器檢測的吸光值為4,選取200～400 nm波段的吸光度值進(jìn)行PCA可得,PC1為70.65%,PC2為27.336%,PC3為0.916%,前3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到98.902%,能有效代表紫外光譜中所包含的吸光度值的信息,達(dá)到識別不同工藝、不同輪次醬香型白酒的目的。圖2為以PC1和PC2為軸的白酒散點(diǎn)分布圖,竄沙、碎沙、翻沙工藝的酒分布在圖上方,相距范圍較遠(yuǎn),與坤沙工藝酒區(qū)別大；1、2、7輪次酒分布在左下角,分布范圍較近,與成品酒的距離較遠(yuǎn)；成品酒與3、4、5、6輪次酒分布在右下角,說明在勾兌中使用的輪次酒3、4、5、6輪次酒多于1、2、7輪次酒,可初步用于醬香酒勾兌[17]。

圖2 酒樣吸光度值主成分分析Fig.2 Principal component analysis of absorbance of Baijiu

2.2 不同工藝醬香酒揮發(fā)性物質(zhì)分析

2.2.1 揮發(fā)性物質(zhì)及主成分分析

經(jīng)過GC-MS數(shù)據(jù)庫對比分析,定性不同工藝醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì),其中坤沙工藝53種,翻沙工藝50種,碎沙工藝49種,竄沙工藝31種。將定性出的4種不同工藝的醬香型白酒揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行種類分析,見圖3。醬香型坤沙工藝酒的揮發(fā)性物質(zhì)種類居于翻沙、碎沙、竄沙工藝酒之上,說明醬香酒的獨(dú)特風(fēng)味是與傳統(tǒng)的獨(dú)特的“四高”坤沙工藝分不開的。傳統(tǒng)坤沙工藝的高溫發(fā)酵、高溫餾酒促進(jìn)了揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生及餾出,使傳統(tǒng)坤沙工藝的醬香酒揮發(fā)性物質(zhì)種類更多[18-19]。

圖3 不同工藝類型醬香型白酒揮發(fā)性物質(zhì)組成差異Fig.3 Composition differences of volatile compounds in Maotai-flavor Baijiu of different technological types

PCA可以較好地應(yīng)用于醬香型白酒不同工藝、不同輪次的分析(圖4)。圖4對揮發(fā)性成分的PCA與紫外吸光度值PCA(圖2)還是存在較大差異。由圖4可知,醬香白酒不同輪次、工藝主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為49.90%,有效描述了揮發(fā)性香氣物質(zhì)和不同工藝、不同輪次醬香型白酒之間的復(fù)雜關(guān)系。PCA可用于區(qū)分竄沙與坤沙工藝,翻沙與成品酒位置接近,說明風(fēng)味物質(zhì)相近,難以區(qū)分；碎沙與3、4、5輪次酒位置相近,難以區(qū)分。

圖4 酒樣中揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析Fig.4 Principal components analysis of volatile compounds in Baijiu samples

在同一95%置信區(qū)域(Hotelling T2 test)的坤沙工藝與竄沙工藝醬香酒,能較好的分開,具有非常直觀的可視化區(qū)分效果,聚類趨勢明顯,可推測出竄沙工藝與坤沙工藝的醬香型白酒的香氣與其揮發(fā)性物質(zhì)組成有直接聯(lián)系。

2.2.2 醬香酒不同工藝揮發(fā)性物質(zhì)差異分析

把12個(gè)白酒揮發(fā)性物質(zhì)觀察值,由PLS-DA進(jìn)行的監(jiān)督多變量統(tǒng)計(jì)分析,以識別特定的標(biāo)記化。如圖5-a所示,不同工藝的的醬香酒樣本在PLS-DA得分圖上明顯分開,輪次酒和成品酒位置相近,翻沙、碎沙、竄沙雖然相距較遠(yuǎn),但都與坤沙酒明顯分開,都位右上角。此外,還進(jìn)行了置換檢驗(yàn)(n=200),以評估判別模型是否過度擬合數(shù)據(jù)。排列測試通過改變分類變量(Y)的排序順序來隨機(jī)重新排列實(shí)驗(yàn),并隨機(jī)分配最多200次的Q2Y。模型良好擬合的推薦值被描述為R2Y截距=0.3和Q2Y截距<0.05[20-21]。其中,本實(shí)驗(yàn)置換檢驗(yàn)的Q2Y截距值為0.966,表明模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行過度擬合?；陬A(yù)測值的可變重要性(variable importance in projection val-ues,VIP)(>1.5),確定了5種揮發(fā)性化合物作為潛在的標(biāo)記化合物,為苯甲醛、三甲基吡嗪、己酸乙酯、乙酸和異丁醇。其中,苯甲醛VIP最高(1.91),其他潛在標(biāo)記的VIP介于1.51～1.84(圖5-a)。

a-坤沙和非坤沙白酒樣品的PLS-DA圖；b-置換測試的執(zhí)行；c-5個(gè)合格標(biāo)記化合物的VIP圖5 重要的標(biāo)記化合物定性定量分析Fig.5 Identification and quantitation of marker compounds

將標(biāo)記的不同工藝醬香型白酒5種差異性揮發(fā)性化合物列于表3中進(jìn)行分析。醬香型白酒的傳統(tǒng)的坤沙釀造工藝是最具特色的白酒釀造工藝,是醬香型白酒形成獨(dú)特風(fēng)味的關(guān)鍵。在釀造過程的高溫堆積和高溫發(fā)酵中的微生物代謝,產(chǎn)生多種對酒體香氣有貢獻(xiàn)的揮發(fā)性物質(zhì)和一些苦味物質(zhì)。異丁醇是1種會(huì)帶給酒體苦味的物質(zhì),由表3可知,在坤沙工藝的醬香型酒中的相對含量是非坤沙工藝醬香型酒的1.94倍[22]。不同工藝的醬香型白酒乙酸含量差別較大,坤沙工藝醬香型白酒中乙酸的相對含量是非坤沙工藝醬香型白酒的1.74倍。

表3 不同工藝醬香型白酒標(biāo)記的揮發(fā)性物質(zhì)差異分析Table 3 Analysis on the difference of volatile compounds marked by Maotai-flavor Baijiu with different processes

為了表明定量標(biāo)記化合物之間的關(guān)聯(lián),使用來自坤沙和非坤沙的醬香酒樣品中定量化合物的濃度來制備熱圖(圖6),顏色(從淺到深)指示相對強(qiáng)度從低到高變化。從聚類來看,竄沙工藝與碎沙工藝的醬香酒聚類為一類,翻沙工藝醬香酒是難以與坤沙酒分開,這與醬香型不同工藝酒揮發(fā)性物質(zhì)PCA的結(jié)果一致。熱圖中可以看出碎沙、竄沙酒中苯甲醛和己酸乙酯是明顯高于其他酒,與其他坤沙、翻沙工藝酒的風(fēng)味差異也更加明顯[23]。

圖6 不同工藝醬香型白酒揮發(fā)性物質(zhì)差異分析熱圖Fig.6 Heatmap of differences analysis of volatile compounds in Maotai-flavor Baijiu with different processes

3 結(jié)論

研究了12種坤沙工藝的醬香型白酒和翻沙、碎沙、竄沙醬香型白酒的紫外吸收光譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,通過紫外可見吸收光譜的峰形、峰高及最大吸收波長,可對12種進(jìn)行了良好區(qū)分,光譜曲線相似度表明不同工藝、輪次的醬香型白酒在采樣點(diǎn)各種組分特征吸收光譜的疊加使得紫外可見吸收光譜表現(xiàn)更加豐富。測定的酒樣在各自酒區(qū)分的基礎(chǔ)上同工藝不同酒類可以區(qū)分(包括輪次酒與成品酒區(qū)分、輪次酒與輪次酒區(qū)分)。設(shè)超出檢測限的吸光值為4,醬香型白酒的3、4、5、6輪次酒之間,成品酒之間,成品酒2號與4、5輪次酒之間波形和峰高相似度較高。結(jié)合PCA對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,利用紫外可見吸收光譜法結(jié)合PCA可區(qū)分12種不同工藝醬香型白酒,并可初步判定成品酒與3、4、5、6輪次酒風(fēng)味組成相似,可用于指導(dǎo)輪次酒勾兌。紫外可見吸收光譜法對不同工藝、輪次的醬香型白酒有一定的區(qū)分能力。

通過紫外可見吸收光譜對其進(jìn)行區(qū)分有一定局限性。采用GC-MS與IC對醬香型酒樣中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測分析,坤沙工藝53種,翻沙工藝50種,碎沙工藝49種,竄沙工藝31種。通過對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行PCA,發(fā)現(xiàn)竄沙的工藝醬香酒與坤沙的工藝醬香酒聚類趨勢明顯,能根據(jù)酒種的揮發(fā)性香氣物質(zhì)將坤沙與竄沙這2種工藝的醬香型白酒區(qū)分。除竄沙工藝的其他醬香型酒樣PCA聚類離散成2大類,碎沙工藝與3、4、5輪次酒成分相聚較近,成品酒與翻沙工藝、6輪次醬香酒相聚較近,翻沙與碎沙工藝不容易區(qū)分,且6輪次酒與成品酒相聚較近,可用于指導(dǎo)輪次酒勾兌。PLS-DA模型中,所有測試樣本都被正確地歸入2組。確定重要差異標(biāo)記物(VIP>1.5),然后定量為苯甲醛、三甲基吡嗪、己酸乙酯、乙酸和異丁醇。定量結(jié)果和熱圖分析表明,翻沙工藝被聚類分在了坤沙工藝內(nèi),表明翻沙工藝醬香難以與坤沙酒分開。碎沙工藝和竄沙工藝醬香酒的苯甲醛和己酸乙酯含量明顯多于其他酒樣,香味風(fēng)格也與其他酒樣差別較大。醬香型白酒的不同釀造工藝的區(qū)別導(dǎo)致了酒體中揮發(fā)性物質(zhì)的差異,從而形成了不同工藝、不同輪次醬香型白酒的不同風(fēng)格特點(diǎn)。