白登彥，王 冠，張海軍，朱 濤，趙志鵬，呂立桃

(1.甘肅省第二人民醫(yī)院,甘肅 蘭州 730099；2.西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730015；3.開封市人民醫(yī)院骨一科，河南 開封475001)

神經(jīng)根型頸椎病(Cervical spondylotic radiculopathy，CSR)是目前最常見頸椎疾病之一，其臨床表現(xiàn)為頸部的神經(jīng)性疼痛，伴隨炎性反應(yīng)，其發(fā)病主要由椎間盤退行性功能改變引起的分子生物學(xué)反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)[1]，炎癥反應(yīng)是引起CSR疼痛的主要原因。炎癥反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/絲氧酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)是炎性反應(yīng)的主要信號通路[2]。當(dāng)AKT被PDK2磷酸化為p-AKT后，激活PKB/AKT，進(jìn)而激活A(yù)KT通過磷酸化含有絲氨酸殘基的底物Bax 和Bcl-2等因子，促進(jìn)產(chǎn)生抗凋亡的分子生物學(xué)效應(yīng)[3-5]。研究認(rèn)為[6]，PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與脊神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)。其中Bax 和Bcl-2的含量變化與CSR發(fā)病存在密切關(guān)系。CSR在祖國醫(yī)學(xué)中屬于“項(xiàng)痹”，中醫(yī)藥在臨床治療CSR方面優(yōu)勢明顯，芍藥甘草湯出自張仲景所著的《傷寒雜病論》，研究[7]顯示其治療CSR的效果明顯，但作用機(jī)制尚不明確。本研究通過建立CSR模型大鼠，并用芍藥甘草湯濃縮液灌胃干預(yù)的方法，探究CSR模型大鼠在芍藥甘草湯干預(yù)下PI3K/AKT信號通路的調(diào)控作用，并分析其對Bax及Bcl-2的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar大鼠90只，20周齡，體重(200±20)g，雌雄各半，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物質(zhì)量合格證號SCXK(甘)2020-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，雌雄分開飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)造模。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器 芍藥甘草湯方藥購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，藥物組成：白芍、甘草各15 g。3MA 試劑，購自通化茂祥制藥有限公司，批號H20200112。Bax(批號：AC2020002)、Bcl-2(批號：E2020010)試劑盒，均購自上海信帆生物。兔抗大鼠PI3K抗體，購自武漢艾美捷科技有限公司，批號A50003)；兔抗大鼠AKT，購自武漢益普生物科技有限公司(批號：A30008)；山羊抗兔單抗，購自武漢艾美捷科技有限公司(批號：A21021)；BCA蛋白試劑盒，購自美國Thermo公司(批號：23220)。酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 動物分組與處理 按照隨機(jī)數(shù)字法將90只大鼠分為空白組、模型組、對照組、芍藥甘草湯治療低、中、高劑量組共六組，每組15只。除空白組外，其余大鼠按照參考文獻(xiàn)[8]制備CSR大鼠模型。俯臥位固定大鼠，頸部剃毛清潔后消毒，暴露脊椎，顯微外科鑷將消毒后的尼龍魚線放置在C6-7～T1神經(jīng)根下，縫合。各造模組大鼠1周后進(jìn)行步態(tài)障礙評分評價(jià)造模情況。本實(shí)驗(yàn)中造模組大鼠均造模成功。造模后開始灌胃治療，空白組大鼠及模型組大鼠給予生理鹽水1 ml/只灌胃，對照組給予1 ml 3MA(15 mg/kg生理鹽水稀釋)灌胃，芍藥甘草湯低、中、高劑量組大鼠分別按照劑量8、12、16 g/kg給予灌胃，1次/d，共持續(xù)14 d。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 大鼠步態(tài)評分測定：參照文獻(xiàn)[9]步態(tài)方法評估大鼠造模情況。大鼠步態(tài)正常，左前肢無畸形，為1分；出現(xiàn)行走時(shí)跛行，左前肢足畸形內(nèi)收蜷縮，輕微持重或不持重為2分；出現(xiàn)抬起、走動時(shí)不著臺面，左前肢足顯著內(nèi)收蜷縮畸形，為3分。記錄并評分。

1.4.2 樣品取材：灌胃結(jié)束24 h后，按照7.5 μl/g烏拉坦麻醉處死大鼠，取頸部脊髓及神經(jīng)根組織樣品2份，1份置多聚甲醛固定，另1份-80 ℃冰箱中保存待檢。

1.4.3 ELISA法檢測組織中Bax和Bcl-2含量變化：按照ELISA試劑說明書操作步驟，檢測各組大鼠組織中Bax和Bcl-2含量變化。

1.4.4 HE法檢測組織病理學(xué)變化：將提取的組織固定后分別石蠟包埋和組織切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀測各組大鼠組織病理學(xué)變化。

1.4.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測PI3K、AKT蛋白表達(dá)：各組大鼠組織中分別加入RIPA裂解緩沖液，分別提取組織中的總蛋白，參照BCA蛋白試劑盒說明檢測不同組大鼠脊髓組織中蛋白的含量。SDS-PAGE等量分離蛋白質(zhì)，并于PDVF膜上4 ℃條件添加一抗孵育過夜。洗滌后添加二抗(1∶200)常溫下進(jìn)行2 h孵育。ECL試劑顯影后應(yīng)用軟件Quantity One測定蛋白含量的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠治療前后步態(tài)積分比較 見表1。與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠在造模后步態(tài)積分均出現(xiàn)升高(P<0.05)，說明CSR模型造模成功。治療14 d后，各給藥組與同期模型組比較，步態(tài)積分均出現(xiàn)不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨著芍藥甘草湯劑量增加治療效果更佳(P<0.01)。

表1 各組大鼠治療前后步態(tài)積分比較(分)

2.2 各組大鼠組織病理學(xué)比較 空白組大鼠的組織細(xì)胞排列整齊，界限清晰，無炎癥浸潤；模型組大鼠組織細(xì)胞間隙錯(cuò)亂，出現(xiàn)炎性浸潤；各藥物組大鼠組織炎性變化逐漸改善(圖1)。

2.3 各組大鼠組織中Bax及Bcl-2含量比較 見表2。與空白組大鼠比較，模型組大鼠的Bax升高，Bcl-2含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，各給藥組Bax含量降低，Bcl-2含量升高(P<0.05)，且芍藥甘草湯隨劑量增加治療效果更加明顯(P<0.01)。

2.4 各組大鼠組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)比較 見表3。與空白組大鼠比較，模型組大鼠組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，各給藥組PI3K、p-AKT蛋白含量表達(dá)升高(P<0.05)，且芍藥甘草湯的治療效果隨劑量增加更加明顯(P<0.01)，見圖2。

表3 各組大鼠組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)比較

A：空白組；B：模型組；C：對照組；D：芍藥甘草湯低劑量組；E：芍藥甘草湯中劑量組；F：芍藥甘草湯高劑量組

3 討 論

CSR發(fā)病與體內(nèi)炎性反應(yīng)、代謝異常、細(xì)胞過度自噬凋亡相關(guān)[10]。祖國醫(yī)學(xué)并無CSR病名的記載，可將CSR歸屬為“ 痿病”“痹證” “項(xiàng)強(qiáng)”等范疇，發(fā)病多與頸項(xiàng)部氣血運(yùn)行不利，而產(chǎn)生的頸部疼痛等表現(xiàn)，根本病因是血虛寒凝，治療原則當(dāng)溫經(jīng)活血、溫陽通脈、散寒化濕[11]。芍藥甘草湯始見于《傷寒雜病論》，方含白芍、甘草，是治療疼痛的代表方。白芍味苦、酸，性微寒，既能養(yǎng)血和營，柔肝鎮(zhèn)痛，平抑肝陽，又可養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗。甘草補(bǔ)中益氣，緩急止痛。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果顯示[12]，白芍的主要成分為白芍總苷、山柰酚及β谷甾醇，能夠調(diào)節(jié)免疫、改善線粒體功能，有修復(fù)受損的纖維環(huán)，減輕組織水腫壓迫，發(fā)揮抗炎止痛的效果。甘草的主要活性成分為槲皮素、芒柄花素和甘草多糖等，能夠清除活性氧自由基、激活白細(xì)胞介素、抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)、提高免疫功能[13]。實(shí)驗(yàn)表明[14]，甘草的消炎療效優(yōu)于白芍，白芍的鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于甘草，兩藥物按比例進(jìn)行搭配，效果大于單一藥物的功效，并且藥物濃度越高，抗炎鎮(zhèn)痛的療效越好。

PI3K是細(xì)胞內(nèi)特殊的磷脂酰肌醇激酶，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性，G2可被受體酪氨酸激酶或蛋白耦聯(lián)受體激活，再通過第二信使Bax和Bcl-2，在細(xì)胞的增殖、凋亡等過程中起重要的作用[15]。Bax和Bcl-2是 PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的2個(gè)關(guān)鍵因子，他們同屬Bcl-2家族，參與細(xì)胞凋亡的重要生物學(xué)因子。其中Bax是促細(xì)胞凋亡的因子，而Bcl-2屬于抗細(xì)胞凋亡的因子。研究指出[16]，在線粒體的作用下，Bcl-2家族通過對線粒體的介導(dǎo)而對細(xì)胞凋亡過程起調(diào)控作用。Bax對細(xì)胞凋亡的調(diào)控可能通過誘發(fā)線粒體膜上供凋亡蛋白通過的離子通道開放和精確改變線粒體膜的通透性而釋放CytC；而Bcl-2通過抑制Bax的表達(dá)，抑制細(xì)胞色素C與半胱氨酸蛋白酶激活而起到的抗凋亡作用。研究表明[17-19]，在免疫因子誘導(dǎo)的CSR發(fā)病過程中，固有免疫發(fā)揮著重要的作用。CSR發(fā)病時(shí)，組織內(nèi)發(fā)生多種特異性免疫反應(yīng)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[17]，Bcl-2在CSR模型大鼠組織中的表達(dá)要高于未造模組。Bcl-2過度表達(dá)會影響細(xì)胞正常狀態(tài)下基質(zhì)的分解和合成動態(tài)代謝平衡，加速細(xì)胞分解代謝以及自噬凋亡過程，加速關(guān)節(jié)退變和炎癥病變。

臨床上芍藥甘草湯對CSR治療效果良好，但該方的具體作用機(jī)制并不清楚[20]。本次研究表明，在造模后大鼠步態(tài)障礙積分升高，組織病理學(xué)顯示，造模后大鼠組織內(nèi)炎性病變明顯，提示CSR大鼠造模成功。經(jīng)治療，各治療組CSR大鼠血清中Bax及Bcl-2含量出現(xiàn)變化，而空白組及模型組無明顯變化；組織病理學(xué)結(jié)果也顯示各治療組脊髓神經(jīng)根組織炎性病變減輕，這說明芍藥甘草湯可能通過調(diào)節(jié)Bax及Bcl-2，抑制CSR大鼠機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)。

PI3K/AKT信號通路在正常關(guān)節(jié)組織和神經(jīng)組織中活性較低，當(dāng)組織出現(xiàn)特異性免疫反應(yīng)時(shí)，信號通路中多種蛋白表達(dá)含量出現(xiàn)明顯變化[21-22]。本文結(jié)果也顯示，CSR造模成功后，大鼠出現(xiàn)頸椎關(guān)節(jié)組織炎性反應(yīng)，PI3K/AKT信號通路蛋白表達(dá)減少，這說明PI3K、AKT蛋白參與CSR的免疫反應(yīng)，也進(jìn)一步說明PI3K受體調(diào)控的免疫反應(yīng)機(jī)制與CSR發(fā)病的相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn)，給藥組CSR大鼠在芍藥甘草湯治療后PI3K、AKT、Bax表達(dá)出現(xiàn)降低，Bcl-2含量增高，這說明芍藥甘草湯可有效降低CSR模型大鼠脊髓組織中PI3K、AKT蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控了Bax和Bcl-2等細(xì)胞因子，影響細(xì)胞凋亡，進(jìn)而控制CSR的疾病進(jìn)展。

綜上所述，PI3K/AKT信號通路可能通過靶向調(diào)控Bax和Bcl-2等細(xì)胞因子影響CSR發(fā)病過程，這也為我們以后治療CSR提供了一個(gè)新方向。