江 東，徐長亮，沈衛(wèi)星，程海波

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心 國家中醫(yī)藥管理局名醫(yī)驗(yàn)方評價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種高發(fā)于30～40歲年齡的慢性、特發(fā)性的炎癥性腸病，可導(dǎo)致直腸并蔓延至結(jié)腸的黏膜炎癥甚至潰瘍，其發(fā)病率在全球范圍呈上升趨勢[1-2]。UC具有高復(fù)發(fā)、高致殘率的特點(diǎn)，雖然炎癥有一定的自限性，但慢性炎性可引起細(xì)胞DNA損傷及修復(fù)程序的錯(cuò)亂，導(dǎo)致正常細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致癌變[3-4]。因此，UC被認(rèn)為是結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)重要的癌前病變，隨著UC患病時(shí)間的積累，大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)也逐漸增加，30年病程引發(fā)大腸癌風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)18%[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療UC的主要藥物治療有5-ASA化合物、類固醇類、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、英夫利昔單抗等，約20%～30%患者甚至需要手術(shù)治療[6-7]，盡管積極治療仍易反復(fù)發(fā)作，且有明顯的不良反應(yīng)和局限性[8]。中醫(yī)藥包含豐富的藥物資源，研究發(fā)現(xiàn)大量中藥及相關(guān)化合物可發(fā)揮防治潰瘍性結(jié)腸炎的作用，且不良反應(yīng)極少，有望成為替代治療[9-10]。本團(tuán)隊(duì)在國醫(yī)大師周仲瑛教授倡導(dǎo)的“癌毒病機(jī)”理論指導(dǎo)下，提煉擬定了防治結(jié)直腸癌癌前病變的中藥復(fù)方——參白解毒方(Shenbai Jiedu decoction，SBJDF)，并已在臨床開展大樣本多中心的療效評價(jià)研究。在前期臨床研究基礎(chǔ)上，參白解毒方對炎癥性腸病具有顯著療效，本研究主要從細(xì)胞周期的角度探討參白解毒方對潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與制備：參白解毒方由苦參、白花蛇舌草、黨參、白術(shù)等藥物組成，中藥飲片均購于江蘇亞邦中藥材飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)鄒立思教授鑒定為道地藥材。制備方法：中藥浸泡后10倍水煎煮第1次，8倍水煎煮第2次，各2 h，減壓濃縮至適當(dāng)體積最終成1.2 g/ml濃度的濾液，醇沉后抽濾，旋去乙醇，抽濾濃縮至2 mg/ml，-80 ℃冰箱冷凍1 d，凍干1～2 d，常溫保存?zhèn)溆?，放入帶有無水硅膠的干燥器中備用。

1.1.2 主要試劑與儀器：Dextran sulfate sodium salt(MP公司，批號：02160110-CF)；胎牛血清(Gibco公司，批號：10099-141C)；DMEM培養(yǎng)基(上海源培生物科技有限公司，批號：B200705)；細(xì)胞分裂液(Biosharp公司，批號：3227440)；MTT(Sigma公司，批號：MKCK3153)；CyclinA2(abcam公司，批號：GR11520-18)；CDK1(abcam公司，批號GR304868-3)；GAPDH抗體(美國CST公司，批號：5174)；細(xì)胞周期與凋亡試劑盒(Invitrogen公司，批號：1999470)；kFluor488-EdU法細(xì)胞增殖檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。XB224型電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Countstar公司)；SL16型低速離心機(jī)(賽默飛世爾公司)；HERAcell 150i型二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾公司)；PowerPacTMBasic型電泳儀(Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon公司)；TS-317型3D脫色搖床(其林貝爾儀器制造有限公司)；CytoFlex型流式細(xì)胞儀(BECKMAN公司)；SPARK 10M型酶標(biāo)儀(TECAN公司)；渦旋混合器(WiseMix公司)；Ti型倒置熒光顯微鏡(尼康公司)。

1.1.3 細(xì)胞株：人正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞(Normal human fetal colonic mucosa cells，F(xiàn)HC)由名醫(yī)驗(yàn)方評價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將FHC細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為飽和濕度、37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖：收集FHC人正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞以5×104ml密度接種于96孔板，每孔100 μl，置于5% CO2孵化箱中培養(yǎng)24 h。取細(xì)胞棄去細(xì)胞上清，分別設(shè)立：空白組、1.0%、1.5%、2.0%使用葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium salt，DSS)造模組，給藥后造模組培養(yǎng)基中DSS溶液終濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)過程中注意去上清應(yīng)盡快加樣，避免細(xì)胞干燥死亡，各時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)5% CO2孵化箱中培養(yǎng)4 h。取出細(xì)胞，吸去上清，加入200 μl DMSO，搖床振蕩10 min充分溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度值，分析結(jié)果。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察： 取對數(shù)生長期的FHC細(xì)胞，PBS小心漂洗細(xì)胞，加入胰酶后置于37 ℃孵箱消化，待消化完成加入培養(yǎng)基并離心，去上清，加入培養(yǎng)基接種在培養(yǎng)皿。分別設(shè)空白組、模型組(2% DSS)、參白解毒方低劑量組(2% DSS和0.4 mg/ml SBJDF)、參白解毒方中劑量組(2% DSS 和 0.8 mg/ml SBJDF)、參白解毒方高劑量組(2%DSS和1.2 mg/ml SBJDF)。按分組給藥后5% CO2孵化箱中培養(yǎng)48 h，取出細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4 5-乙炔基-2’-脫氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU)檢測FHC細(xì)胞增殖能力：取對數(shù)生長期FHC細(xì)胞，以適宜密度接種于48孔板，分組同1.2.3，給藥后培養(yǎng)48 h。取細(xì)胞給10 μmol 的EdU熒光探針，37 ℃敷育2 h，去除培養(yǎng)基，加入PBS清洗3次，每次3 min，加入4%的多聚甲醛室溫固定20～30 min，PBS洗3次，每次3 min，加入Triton通透15 min，PBS洗3次，每次3 min，加入Click-iT反應(yīng)工作液避光敷育20 min，PBS洗3次，每次3 min，DNA復(fù)染，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 Western blot：取對數(shù)生長期的FHC細(xì)胞，分組同1.2.3，給藥后培養(yǎng)48 h，RIPA蛋白裂解法提取各組細(xì)胞蛋白，冰上裂解10 min，裂解置于4 ℃離心機(jī)12000 r/min 離心15 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。調(diào)整各組蛋白樣本為相同濃度后，加入loading buffer并置于95 ℃金屬浴鍋蛋白變性10 min，分別加入SDS-PAGE膠泳道，以恒壓80 V，30 min，再以120 V電泳至指示劑脫離分離膠底部，以恒流300 mA，90 min將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，取出PVDF膜用5%的脫脂奶粉4 ℃隔夜封閉，PBST清洗后加入一抗，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜后加室溫孵育二抗2 h，PBST清洗后顯色曝光，結(jié)果使用Image J計(jì)算條帶灰度值。

1.2.6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期：將對數(shù)生長期的FHC細(xì)胞以3×105ml培養(yǎng)在6孔板中，每孔2 ml，待細(xì)胞合適密度時(shí)，同1.2.3分組給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。胰酶消化細(xì)胞，以2000 r/min，1 min收集細(xì)胞，棄上清，PBS洗滌兩次，用預(yù)冷的70%乙醇重懸細(xì)胞后4 ℃過夜，次日在4 ℃離心機(jī)中以2000 r/min，2 min去除乙醇，PBS洗滌后加入0.5 ml FxCycle PI/RNase染液體，充分混勻，避光染色30 min 后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，參數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析和t檢驗(yàn)比較組間差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 經(jīng)DSS處理后FHC細(xì)胞活力的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表1。經(jīng)1.0%、1.5%、2.0%DSS刺激48 h后，F(xiàn)HC人正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力隨著DSS濃度的增加而下降，呈濃度依賴性。其中2% DSS處理后48 h細(xì)胞活力抑制率為(52.34±5.31)%。

表1 DSS溶液對FHC細(xì)胞活力的影響(n=5)

2.2 DSS對FHC細(xì)胞周期分布的影響 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示(圖1)：與A組比，隨著刺激FHC細(xì)胞的DSS濃度增加，G0/G1期細(xì)胞數(shù)逐漸增多，其中2% DSS造模組與空白組相比，G0/G1期細(xì)胞明顯增加，S期減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。提示DSS干預(yù)下能誘導(dǎo)FHC細(xì)胞形成G0/G1期阻滯，因此選擇2% DSS進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

A ：空白組；B：1.0% DSS造模組；C：1.5% DSS造模組；D： 2.0% DSS造模組。與空白組比較，*P<0.01

2.3 參白解毒方對FHC細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 結(jié)果顯示(圖2)：空白組細(xì)胞數(shù)量最多，排列有序，形狀正常，貼壁良好；模型組FHC細(xì)胞出現(xiàn)排列疏松、形狀不規(guī)則、細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞膜皺縮并脫落；與模型組相比，隨著參白解毒方的濃度逐步增加，細(xì)胞數(shù)量增加，形態(tài)異常情況減少。

圖2 參白解毒方對經(jīng)DSS處理后FHC細(xì)胞形態(tài)影響(EdU染色，×100)

2.4 參白解毒方對經(jīng)DSS處理后FHC細(xì)胞增殖的影響 EdU與胸腺嘧啶脫氧核糖苷類似，可以摻入細(xì)胞新合成的DNA中，其與相關(guān)試劑反應(yīng)，通過發(fā)出的熒光檢測摻入DNA的EdU。EdU實(shí)驗(yàn)可檢測細(xì)胞DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)：與空白組相比，模型組細(xì)胞EdU陽性細(xì)胞率明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，與DSS阻滯細(xì)胞周期結(jié)果相符；參白解毒方給藥后，隨著參白解毒方濃度增加，EdU陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，呈濃度依賴性；與模型組相比，參白解毒方中劑量組、高劑量組百分比上升，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，表明參白解毒方可以減輕DSS細(xì)胞毒性，恢復(fù)細(xì)胞增殖能力。

與空白組比較，*P<0.01；與造模組比較，#P<0.01

2.5 參白解毒方對經(jīng)DSS處理后FHC細(xì)胞周期的影響 通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測結(jié)果顯示(圖4)：與空白組相比，模型組G0/G1期細(xì)胞明顯增加，S期減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；在2% DSS刺激細(xì)胞同時(shí)給予參白解毒方，G0/G1期細(xì)胞明顯減少，S期增加，呈濃度依賴性，參白解毒方高劑量組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示參白解毒方減少了DSS誘導(dǎo)FHC細(xì)胞形成的G0/G1期阻滯。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5)：與空白組相比，模型組細(xì)胞周期蛋白Cyclin A2、CDK1表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；參白解毒方給藥后，經(jīng)DSS刺激的FHC細(xì)胞周期蛋白Cyclin A2、CDK1表達(dá)上調(diào)，并呈濃度依賴性，其中參白解毒方高劑量組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示參白解毒方可能通過調(diào)控細(xì)胞周期減輕DSS誘導(dǎo)的FHC細(xì)胞損傷。

A：空白組；B：模型組；C：SBJDF低劑量組；D：SBJDF中劑量組；E：SBJDF高劑量組。與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎屬于中醫(yī)學(xué)腸澼、痢疾、便血等范疇，病位在腸，與脾、腎、肝、肺臟腑相關(guān)。初起可因情志不暢、脾胃虛弱、飲食不節(jié)、感受外邪等病因引起脾胃損傷[11-12]；日久則濕熱毒邪內(nèi)蘊(yùn)，逐漸氣血凝滯，壅而化膿，下迫腸道，引起膿血便，甚或反復(fù)發(fā)作、遷延不愈而形成癌毒，最終發(fā)展為腸蕈。中醫(yī)藥治療UC具有減輕患者痛苦、減少復(fù)發(fā)及不良反應(yīng)等優(yōu)勢，運(yùn)用中醫(yī)藥治UC成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)[13-14]。本團(tuán)隊(duì)以“癌毒病機(jī)”為理論核心，中醫(yī)“治未病”思維為指導(dǎo)，擬定了預(yù)防結(jié)直腸癌癌前病變的中藥復(fù)方——參白解毒方。

DSS具有破壞正常腸黏膜屏障，增強(qiáng)腸黏膜通透性的作用，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞炎癥，常用來建立潰瘍性結(jié)腸炎的體內(nèi)、體外模型[15-16]。本研究中，通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2% DSS具有明顯的細(xì)胞毒性，降低了FHC細(xì)胞的活力。EdU與腺苷結(jié)構(gòu)類似，在S期細(xì)胞DNA開始復(fù)制時(shí)摻入DNA序列中，從而檢測細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DSS減少FHC細(xì)胞中的EdU陽性細(xì)胞數(shù)，而在參白解毒方干預(yù)后，EdU陽性數(shù)量增加，參白解毒方給藥后減輕了DSS的細(xì)胞毒性，提高細(xì)胞增殖能力，表明參白解毒方對潰瘍性結(jié)直腸炎腸黏膜上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。

細(xì)胞周期包括四個(gè)階段，分別為G0/G1期、S期、G2期、M期，與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)[17]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinases，CDKs)通過與細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)結(jié)合而激活，發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)CyclinA2能夠與CDK2和CDK1結(jié)合，增加S期DNA復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞越過G1/S與G2/M期轉(zhuǎn)折點(diǎn)[19-20]。通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)FHC細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖；參白解毒方干預(yù)后，逆轉(zhuǎn)了FHC細(xì)胞的周期阻滯；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DSS刺激后下調(diào)細(xì)胞CDK1、CyclinA2周期蛋白表達(dá)，參白解毒方可逆轉(zhuǎn)上述趨勢。

綜上所述，參白解毒方可以通過維持細(xì)胞周期穩(wěn)態(tài)發(fā)揮保護(hù)潰瘍性結(jié)直腸炎黏膜細(xì)胞的作用，但其對正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞周期的具體作用機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。