劉伯承，王 慧，劉俊琦，杜麗飛，劉彬揚(yáng)，楊 俊※

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410131；2.湖南省長沙市芙蓉區(qū)大同第三小學(xué)，湖南長沙410125）

發(fā)展和壯大生態(tài)健康養(yǎng)殖是我國農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化建設(shè)的重要基礎(chǔ)。近年來，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)不斷深入改革和完善，區(qū)域化、集中化、規(guī)?；蔀楫?dāng)前養(yǎng)殖發(fā)展的新形式，同時(shí)生物安全法也在新的形式下即將落地，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了新的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。要建立健全綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖模式，打造無疫區(qū)生態(tài)養(yǎng)殖，做好消毒滅源是其關(guān)鍵抓手。過硫酸氫鉀復(fù)合物是由過硫酸氫鉀（KHSO5）、硫酸氫鉀（KHSO4）和硫酸鉀（K2SO4）組成的固體物質(zhì)[1]，通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白及其通透性發(fā)揮殺菌作用，具有活性高、穩(wěn)定、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[2]。目前，在獸藥中作為一種廣譜、高效、安全殺毒劑被廣泛應(yīng)用[3]。然而，養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中環(huán)境因素復(fù)雜，加上基礎(chǔ)人員對(duì)不同消毒劑特點(diǎn)認(rèn)識(shí)不到位，導(dǎo)致盲用、濫用的現(xiàn)象，因此，應(yīng)根據(jù)不同的環(huán)境和使用目的來合理選擇使用消毒劑，使其提高殺菌效率。本研究以奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌為受試株，通過懸菌液定量殺滅試驗(yàn)研究了不同梯度濃度，不同時(shí)間及溫度作用下過硫酸氫鉀復(fù)合粉的殺滅效率，以期為防控奶牛乳房炎及養(yǎng)殖生產(chǎn)中消毒劑的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

潔凈工作臺(tái)，購自力康精密科技（上海）有限公司；水浴恒溫?fù)u床，購自常州國宇儀器制造有限公司；漩渦混合器，購自常州越新儀器制造有限公司；血瓊脂培養(yǎng)基，購自貝瑞特生物科技有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基，購自杭州百思生物科技有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自青島海博生物科技有限公司；過硫酸氫鉀復(fù)合粉，購自佛山市某制藥有限公司，批號(hào)：獸藥字190373276，含有效氯不少于10%；硫代硫酸鈉，購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；PBS緩沖液，購自長沙市博儀生物科技有限公司。

1.2 受試菌株

金色葡萄球菌為湖南省畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)獸藥實(shí)驗(yàn)室經(jīng)鑒定保存的菌株。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 懸菌液和消毒液的制備

懸菌液的制備：無菌挑取單個(gè)菌落置5mL LB肉湯的試管中，水浴恒溫培養(yǎng)14h后做細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)，用滅菌水調(diào)整菌落數(shù)濃度至1×107～5×107CUF/mL4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制：取10g PBS緩沖液（干粉），溶于800 mL去離子水中，定容至1000 mL，調(diào)整pH 7.2～7.4，121℃高壓蒸汽滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

中和劑的配制：取硫代硫酸鈉1200 mg加入400 mL PBS中，121℃高壓蒸汽滅菌后4℃保備用。

消毒劑的配制：臨用前取1g過硫酸氫鉀復(fù)合粉置400mL PBS稀釋液中。

1.3.2 中和劑鑒定試驗(yàn)

以上述調(diào)整好的懸菌液為受試菌液，參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》[4]消毒劑殺微生物試驗(yàn)中和劑鑒定試驗(yàn)規(guī)定進(jìn)行操作及結(jié)果判定。設(shè)a、b、c、d、e、f共6組，a組：消毒劑＋菌懸液，用于驗(yàn)證消毒劑的殺菌效果；b組：（消毒劑＋菌懸液）＋中和劑，用于驗(yàn)證消毒劑在殺滅細(xì)菌后能否被完全中和；c組：中和劑＋菌懸液，用于驗(yàn)證中和劑對(duì)細(xì)菌的生長是否有抑制作用；d組：（消毒劑＋中和劑）＋菌懸液，用于驗(yàn)證中和產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌的生長是否有抑制作用；e組：稀釋液＋菌懸液，為陽性照組；f組：稀釋液＋中和劑，為陰性對(duì)照組。

具體操作：取0.5 mL調(diào)整好的懸菌液加入至4.5 mL消毒劑（2.5 mg/L）的試管中，室溫下作用5 min；取0.5 mL混合液加入至4.5 mL中和劑（3 g/L硫代硫酸鈉）的試管中，作用10 min；c、d、e組做1000倍稀釋，取100 μL涂布到STA平板上（做兩個(gè)平行板），37℃培養(yǎng)18～24 h，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)菌菌落數(shù)，結(jié)果取平均值。

1.3.3 不同溫度和作用時(shí)間下懸菌液定量殺滅試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)A組（1min）、B組（5min）、C組（10min）、D組（陽性對(duì)照）、E組（陰性對(duì)照）。每組分別在4℃、20℃、30℃環(huán)境溫度下取0.5mL濃度為1×107～5×107CUF/mL懸菌液加入至含4.5mL的消毒液（KHSO4）試管中，作用規(guī)定時(shí)間后取0.5mL混合液加入至4.5mL中和劑中，作用10 min后取100μL至STA平皿涂板，37℃培養(yǎng)20 h，同時(shí)設(shè)置以PBS替代消毒液為陽性對(duì)照組，以同批STA平板為陰性對(duì)照；每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 中和劑鑒定試驗(yàn)

根據(jù)2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》中和劑判斷標(biāo)準(zhǔn)，從表1可以看出，a組無菌生長，b組菌落數(shù)明顯減少，c、d、e組菌落數(shù)比較接近，誤差率＜15%，f組無菌落生長。說明硫代硫酸鈉對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合粉有較好的中和效果，符合本實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 不同溫度和作用時(shí)間下懸菌液定量殺滅試驗(yàn)

3種不同濃度（1:400、1:800、1:1600）過硫酸氫鉀復(fù)合粉在5 min和4℃、20℃、30℃作用條下對(duì)金色葡萄球菌的殺滅達(dá)100%，而在1 min和4℃條件作用下分別為98.6%、95.5%、92%；1 min時(shí)間作用下，同一濃度的殺滅率隨著溫度的上升有所提高，說明時(shí)間對(duì)殺滅效果的影響較明顯，溫度從4℃升高至30℃有利于殺滅效果（見表2）。

表2 過硫酸氫鉀復(fù)合粉對(duì)金黃色葡萄菌的殺滅率

3 討論

目前，畜禽業(yè)常用的化學(xué)消毒劑主要有鹵素類（氯制劑、溴制劑、碘制劑）、氧化劑類、酸堿類、酚類、醛類、表面活性劑、醇類等[5]。各種消毒劑因其特點(diǎn)發(fā)揮不同的消毒效果，因此合理使用消毒劑對(duì)疫病防控及消毒滅源至關(guān)重要。同時(shí)，鑒于傳統(tǒng)消毒劑在一些安全性和抗性方面的缺點(diǎn)，新一代低毒高效適用廣泛復(fù)合消毒劑的研發(fā)受到關(guān)注，過硫酸氫鉀復(fù)合粉作為新一代高效安全消毒劑的代表，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)被廣泛使用。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種不同濃度過硫酸氫鉀復(fù)合粉在5 min和4℃、20℃、30℃作用條下對(duì)金色葡萄球菌的殺滅達(dá)100%，說明時(shí)間對(duì)懸菌液的作用影響顯著。在不同濃度組，溫度從4℃升高至30℃時(shí)過硫酸氫鉀復(fù)合粉對(duì)金黃色葡萄球菌殺滅效率均有提高，且在低濃度組中殺滅率的提高比高濃度組更為明顯，與王娟等[6]研究結(jié)果相近；在生產(chǎn)實(shí)踐中消毒劑對(duì)不同菌屬殺滅效果也有差異，劉元元等[7]研究發(fā)現(xiàn)在畜禽舍現(xiàn)場表面過硫酸氫鉀復(fù)合粉對(duì)革蘭氏陰性菌的殺滅效果明顯優(yōu)于革蘭氏陽性菌，且在1∶400濃度下作用10min對(duì)金色葡萄球菌的殺滅率為89.73%。

過硫酸氫鉀復(fù)合粉對(duì)病毒類微生物也表現(xiàn)出較好殺滅效果，我國在非洲豬瘟發(fā)生后，過硫酸氫鉀復(fù)合粉成為豬場防控消毒的常用消毒劑。楊瑞梅等[8]在研究豬場非洲豬瘟消毒中發(fā)現(xiàn)，過硫酸氫鉀復(fù)合粉消毒后舍內(nèi)環(huán)境細(xì)菌數(shù)從300 cuf/m2降至50 cuf/m2，ASFV（非洲豬瘟病毒）熒光定量檢測全部為陰性。殺菌作用明顯；張交兒等[9]研究發(fā)現(xiàn)，濃度為1000 mg/L的過硫酸氫鉀復(fù)合粉溶液作用5 min，可有效滅活懸液內(nèi)ASFV；在秦濤等[10-11]對(duì)4種消毒劑對(duì)H5N6亞型流感病毒、H7N9亞型流感病毒的殺滅效果研究中，過硫酸氫鉀復(fù)合物在推薦使用量下對(duì)H5N6、H7N9亞型流感病毒無殺滅作用，需使用0.2%（W/V）溶液作用10 min才有殺滅效果，但相比其他成分消毒劑依然表現(xiàn)出了濃度低、作用時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)。

大量研究證明，過硫酸氫鉀復(fù)合物活性好、穩(wěn)定、低毒、使用方便，可用于各種環(huán)境、器具、進(jìn)出場人員及舍內(nèi)帶豬消毒，但現(xiàn)場使用中建議根據(jù)不同環(huán)境和季節(jié)調(diào)整濃度和作用時(shí)間，可提高對(duì)病原微生物的有效殺滅率。