閆志強(qiáng)，翟少欽，張邑帆，陳春林

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

脾虛是以脾虛濕盛為主要病機(jī)的一種常見消化系統(tǒng)疾病，臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、體質(zhì)量減輕、畏寒和倦怠等。目前，脾虛尚無臨床特效藥。西醫(yī)對脾虛的治療以對癥和支持療法為原則，通常采用抗感染、維持水電解質(zhì)和酸堿平衡等方法[1]，但大量使用抗生素會加速細(xì)菌耐藥性，也會造成食品安全問題；中醫(yī)認(rèn)為“脾主運(yùn)化，升清”，提示脾系統(tǒng)與腸道的消化和吸收功能有重要聯(lián)系；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明脾虛與腸道免疫功能異常等關(guān)系密切[2-4]。獸藥制劑女黃扶正散由女貞子、黃芪、枸杞和菟絲子等中藥組成，具有益氣健脾和止痢的功效。前期研究發(fā)現(xiàn)：女黃顆粒對動物機(jī)體具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[5]，但其對腸道組織結(jié)構(gòu)及免疫的影響尚無報道。本研究通過人工復(fù)制脾虛大鼠模型，以女黃扶正發(fā)酵物為治療藥物，測量大鼠腸道絨毛高度、寬度和隱窩深度，同時測定血液細(xì)胞因子和腸組織sIgA 水平，以研究女黃扶正發(fā)酵物對脾虛大鼠腸道結(jié)構(gòu)及免疫的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

SPF 級SD 大鼠80 只，雌雄各半，體質(zhì)量（140±10）g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 試驗(yàn)藥品及其制備

女貞子、黃芪、枸杞、菟絲子和番瀉葉購于市售藥店（重慶華森大藥房），實(shí)驗(yàn)室粉碎后備用。地衣芽胞桿菌、丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

發(fā)酵菌的制備：地衣芽胞桿菌、丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌液態(tài)種子菌分別接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)至108CFU/mL，按比例（m地衣芽胞桿菌∶m丁酸梭菌∶m枯草芽孢桿菌=1∶1∶1）混合即得。

女黃扶正發(fā)酵物制備：黃芪120 g，女貞子90 g，枸杞30 g，菟絲子30 g，經(jīng)烘干、粉碎、過篩和滅菌后加入發(fā)酵罐中，同時將上述發(fā)酵菌按藥物總質(zhì)量5.0%的接種量加入發(fā)酵罐中，與藥物混勻后在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)72 h 即得。

番瀉葉提取液：稱取番瀉葉100 g，加水1 000 mL，煎煮1 h，過濾，藥渣加水800 mL，煎煮2 次，每次1 h，合并3 次煎煮液，濃縮至1.0 g/mL。

IL-2、IL-10、TNF-α 及sIgA 等ELISA 檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 試驗(yàn)動物分組及處理

80 只SD 大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、發(fā)酵菌組和女黃扶正發(fā)酵物組，每組20 只。除空白組外，其余處理組參照文獻(xiàn)[6-7]的方法人工復(fù)制脾虛模型：第 1 階段，復(fù)制脾氣虛證模型（飲食失節(jié)），即大鼠在 6 d 內(nèi)先飽食 1 d，再禁食 2 d，均不禁水；第 2 階段，復(fù)制脾陽虛證模型（苦寒瀉下），即第7 天改“飲食失節(jié)”為“自由采食”，同時按照100 g 體質(zhì)量1.0 mL 的劑量灌服番瀉葉提取液，每天1 次，連續(xù) 14 d?？瞻捉M大鼠于第7 天開始每日灌胃等量蒸餾水，每天1 次，連續(xù)14 d，期間飼喂試驗(yàn)大鼠維持飼料，自由飲食。模型復(fù)制成功后，模型組試驗(yàn)大鼠飼喂試驗(yàn)大鼠維持飼料，發(fā)酵菌組在試驗(yàn)大鼠維持飼料中添加飼料質(zhì)量5%的發(fā)酵菌菌液進(jìn)行飼喂，女黃扶正發(fā)酵物組在試驗(yàn)大鼠維持飼料中添加飼料質(zhì)量1%的女黃扶正發(fā)酵物進(jìn)行飼喂?？瞻捉M大鼠飼喂試驗(yàn)大鼠維持飼料。各組大鼠連續(xù)飼喂27 d，自由采食和飲水。

1.4 大鼠血常規(guī)測定

自試驗(yàn)第47 天21：0 0 開始各組大鼠均禁食12 h，于第48 天09：0 0 用乙醚麻醉大鼠，眼球采血裝于抗凝血采血管中，每組隨機(jī)采集8 只，4 h 內(nèi)使用全自動模塊式血液體液分析儀測定血液中白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白質(zhì)量濃度、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比、嗜堿性粒細(xì)胞百分比和單核細(xì)胞百分比。

1.5 大鼠血清IL-2、IFN-γ、TNF-α 和IL-10 含量測定

自試驗(yàn)第47 天21：0 0 開始各組大鼠均禁食12 h，于第48 天09：0 0 用乙醚麻醉大鼠，眼球采血裝于促凝血采血管中，分離血清，每組隨機(jī)采集10 只，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清IL-2、IFN-γ、TNF-α 和IL-10 含量，測定步驟嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒的說明進(jìn)行。

1.6 免疫器官指數(shù)測定

于試驗(yàn)第48 天09：0 0 對各組大鼠進(jìn)行稱量，然后解剖大鼠，迅速開腹切除大鼠胸腺及脾臟，剝離附著在胸腺及脾臟表面的筋膜及脂肪組織，稱量每只大鼠的脾臟和胸腺質(zhì)量，計(jì)算大鼠免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)=脾（胸腺）質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）。

1.7 小腸組織形態(tài)學(xué)觀察

無菌采集大鼠十二指腸、空腸和回腸，用PBS 溶液清除腸內(nèi)容物，用4%多聚甲醛溶液固定，腸道組織經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片、蘇木精—伊紅染色和封片后在顯微鏡下觀察并拍照。采用Image Pro Plus 6.0 軟件測量腸道組織絨毛高度、絨毛寬度和隱窩深度。

1.8 腸組織sIgA 測定

解剖大鼠，取小腸，縱行剪開并除凈腸腔內(nèi)容物，刮取其黏膜組織，用PBS 緩沖液溶解并離心后取上清液，用酶聯(lián)免疫吸附法測定上清液中sIgA 含量，測定步驟嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明進(jìn)行。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 女黃扶正發(fā)酵物對脾虛大鼠臨床表現(xiàn)的影響

試驗(yàn)前各組試驗(yàn)大鼠臨床表現(xiàn)無明顯差異。復(fù)制模型20 d 后，除空白組大鼠外，其余試驗(yàn)動物表現(xiàn)食少納呆、便溏、反應(yīng)遲鈍、毛色晦暗甚至膽怯，其狀態(tài)與文獻(xiàn)描述[8]一致，表明模型復(fù)制成功。給藥結(jié)束后，女黃扶正發(fā)酵物組和發(fā)酵菌組試驗(yàn)大鼠精神狀態(tài)良好，大便成形，采食飲水正常，被毛光亮，其中以女黃扶正發(fā)酵物組效果最好。

2.2 女黃扶正發(fā)酵物對脾虛大鼠血常規(guī)的影響

由表1 可知：女黃扶正發(fā)酵物組和發(fā)酵菌組大鼠白細(xì)胞數(shù)增加，與模型組相比差異顯著（P＜0.05），但與空白組相比差異不顯著（P＞0.05）；模型組大鼠中性粒細(xì)胞百分比顯著高于其他組（P＜0.05）；模型組大鼠淋巴細(xì)胞百分比低于其余各組，但差異不顯著（P＞0.05）。各個試驗(yàn)組間的血紅蛋白質(zhì)量濃度、紅細(xì)胞和血小板數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。

表1 女黃扶正發(fā)酵物對脾虛大鼠血常規(guī)的影響Tab.1 Effect of fermented Nyuhuang Fuzheng on the blood routine of rats with spleen deficiency

2.3 女黃扶正發(fā)酵物對脾虛大鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表2 可知：模型組大鼠脾臟和胸腺指數(shù)顯著低于空白組（P＜0.05）；女黃扶正發(fā)酵物組大鼠脾臟和胸腺指數(shù)顯著高于模型組（P＜0.05）。

表2 女黃扶正發(fā)酵物對脾虛大鼠免疫器官指數(shù)的影響Tab.2 Effect of fermented Nyuhuang Fuzheng on the immune organ index of spleen deficiency rats

2.4 女黃扶正發(fā)酵物對脾虛大鼠腸道組織形態(tài)的影響

由圖1 可知：各個試驗(yàn)組十二指腸和空腸隱窩深度之間無顯著差異（P＞0.05），發(fā)酵菌組和女黃扶正發(fā)酵物組回腸隱窩深度降低，與模型組相比差異極顯著（P＜0.01）；女黃扶正發(fā)酵物組十二指腸和回腸絨毛高度升高，與模型組相比差異極顯著（P＜0.01），發(fā)酵菌組和女黃扶正發(fā)酵物組空腸絨毛高度升高，與模型組相比差異顯著（P＜0.05）；女黃扶正發(fā)酵物組十二指腸絨毛寬度增大，與模型組相比差異極顯著（P＜0.01），發(fā)酵菌組和女黃扶正發(fā)酵物組的空腸和回腸絨毛寬度與模型組之間無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 女黃扶正發(fā)酵物對脾虛大鼠腸道組織形態(tài)的影響Fig.1 The effect of fermented Nyuhuang Fuzheng on the intestinal tissue morphology of rats with spleen deficiency

2.5 女黃扶正發(fā)酵物對脾虛大鼠血清細(xì)胞因子及腸組織sIgA 水平的影響

由表3 可知：女黃扶正發(fā)酵物組血清IL-2 含量升高，與模型組相比差異顯著（P＜0.05），但與空白組無顯著差異（P＞0.05）；發(fā)酵菌組和女黃扶正發(fā)酵物組血清IFN-γ、TNF-α 和IL-10 含量升高，與模型組相比差異極顯著（P＜0.01），女黃扶正發(fā)酵物組血清IFN-γ、TNF-α 和IL-10 含量與空白組無顯著差異（P＞0.05）；女黃扶正發(fā)酵物組腸黏膜sIgA 含量升高，與模型組相比差異極顯著（P＜0.01），與空白組相比無顯著差異（P＞0.05），發(fā)酵菌組與模型組之間無顯著差異（P＞0.05）。

表3 女黃扶正發(fā)酵物對脾虛大鼠血清細(xì)胞因子及腸組織sIgA 水平的影響Tab.3 Effects of fermented Nyuhuang Fuzheng on the serumcytokines and intestinal sIgA levels in rats with spleen deficiency

3 討論

脾虛多因飲食失節(jié)、過度勞累和久病耗損脾氣所致，脾虛時，機(jī)體水濕運(yùn)化無力，出現(xiàn)大便溏薄、形體消瘦和精神不良等臨床癥狀[9-10]。研究表明：脾虛與腸道消化吸收及免疫功能異常關(guān)系密切[11-12]，脾虛時機(jī)體免疫功能下降，腸道免疫功能受到抑制，抵抗病原菌和抗損傷能力下降，導(dǎo)致腸道損傷。白細(xì)胞是一類可通過變形而穿過毛細(xì)血管壁、集中到病菌入侵部位，將病菌包圍、吞噬和殺滅的免疫細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)：黃芪多糖對白細(xì)胞減少癥具有一定的治療作用[13]。本研究表明：與空白組相比，模型組大鼠白細(xì)胞數(shù)顯著降低，表明脾虛時大鼠機(jī)體免疫功能下降，給喂女黃扶正發(fā)酵物后大鼠白細(xì)胞數(shù)顯著增多，提示女黃扶正發(fā)酵物可通過調(diào)節(jié)機(jī)體白細(xì)胞數(shù)進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，這可能與本復(fù)方中黃芪的發(fā)酵產(chǎn)物作用于機(jī)體免疫細(xì)胞有關(guān)。

胸腺和脾臟是機(jī)體最重要的免疫器官，組織內(nèi)含有大量免疫細(xì)胞，如T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，參與體液免疫和細(xì)胞免疫。據(jù)報道，女貞子水煎劑可顯著提高雞脾臟和胸腺指數(shù)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠免疫器官指數(shù)顯著低于空白組，女黃扶正發(fā)酵物組和發(fā)酵菌組大鼠免疫器官指數(shù)高于或顯著高于脾虛模型組，表明脾虛可導(dǎo)致大鼠免疫功能下降，而女黃扶正發(fā)酵物可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫器官指數(shù)進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，這可能與女貞子的發(fā)酵產(chǎn)物作用于機(jī)體免疫器官有關(guān)。

腸絨毛是腸上皮和固有層共同向腸腔突出形成的一些細(xì)小突起，是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要組織，其結(jié)構(gòu)是否完整直接影響腸道功能的發(fā)揮，腸絨毛高度可反應(yīng)腸隱窩細(xì)胞的有絲分裂活動，腸絨毛高度增加，腸的吸收面積增大[15]。隱窩深度則反映了細(xì)胞生成率，隱窩變淺表明細(xì)胞成熟率上升，吸收功能增強(qiáng)[16]，腸黏膜能得到快速修復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)：脾虛大鼠腸組織黏膜不同程度地受到損傷，女黃扶正發(fā)酵物增加腸絨毛高度、降低脾虛大鼠隱窩深度進(jìn)而改善脾虛大鼠腸道微絨毛形態(tài)和固有層的損傷，促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，這可能是女黃扶正發(fā)酵物治療脾虛大鼠的主要機(jī)制之一。

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成和分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，通過結(jié)合相應(yīng)受體調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和效應(yīng)，調(diào)控免疫應(yīng)答。IL-2、TNF-α和IFN-γ 等細(xì)胞因子由Th1 細(xì)胞分泌，主要參與機(jī)體細(xì)胞免疫。IL-2 可促進(jìn)T 細(xì)胞的殺傷作用，間接反映T 淋巴細(xì)胞活化程度和自身清除衰老細(xì)胞的能力；血液IL-10 水平則可反映機(jī)體炎癥程度，其含量越低，炎癥越嚴(yán)重[17]。本研究發(fā)現(xiàn)：脾虛大鼠血液IL-2、IFN-γ 和IL-10 水平降低，經(jīng)發(fā)酵菌和女黃扶正發(fā)酵物治療后其含量升高，表明發(fā)酵菌和女黃扶正發(fā)酵物對脾虛大鼠免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。

腸道黏膜免疫系統(tǒng)的功能主要由腸分泌型免疫球蛋白（sIgA）和相關(guān)淋巴組織組成[18]。sIgA 是腸道含量最多、存在于外分泌液中重要的免疫球蛋白，可維持正常腸黏膜，防止胃腸道疾病。本研究發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠腸組織sIgA 水平顯著低于空白組，說明脾虛可導(dǎo)致大鼠腸道免疫降低，經(jīng)女黃扶正發(fā)酵物和發(fā)酵菌治療后，脾虛大鼠腸組織sIgA 水平升高，提示發(fā)酵菌和女黃扶正發(fā)酵物可通過提高脾虛大鼠腸組織的sIgA 水平增強(qiáng)腸道的局部免疫功能。

4 結(jié)論

女黃扶正發(fā)酵物可通過調(diào)節(jié)免疫器官指數(shù)、血清IL-2、IL-10、IFN-γ 及腸黏膜sIgA 水平進(jìn)而調(diào)節(jié)脾虛大鼠的免疫功能，并改善和修復(fù)脾虛大鼠受損腸黏膜，恢復(fù)腸道黏膜免疫。