蘭國湘，金思琪，嚴達偉，魯紹雄，崔藝佳，李國美，李海蓮，董新星

（1.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201；2.云南省宣威市畜禽改良工作站，云南 宣威 655400）

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是1 組可以被多種細胞外信號激活的絲氨酸和蘇氨酸激酶[1]，參與細胞內(nèi)反應，識別并響應細胞外刺激[2]。MAPK 信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、c-Jun N 末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kinase，JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）3 條途徑[3]。絲裂原活化蛋白激酶10（mitogen-activated protein kinase10，MAPK10）基因?qū)貸NK 亞群，在哺乳動物的腦和心臟等組織中表達[4-6]，編碼c-Jun 氨基末端激酶3（c-Jun amino-terminal kinase 3，JNK3）[7]，MAPK10

又被稱為JNK3，與JNK1基因和JNK2基因共同構(gòu)成JNK 信號通路。JNK 信號通路能夠使胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）的絲氨酸（Ser307）發(fā)生磷酸化[8]，干擾胰島素信號抑制骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的成脂分化，對脂肪細胞分化起負調(diào)控作用[9]。VERNIA 等[10]以小鼠為模型研究發(fā)現(xiàn)：JNK3基因可通過激活下丘腦神經(jīng)元，促進瘦素受體表達進而抑制脂肪生成，當中樞抑制JNK3基因表達時，可增加熱量攝入，加劇肥胖和胰島素抵抗。目前，MAPK10基因的研究主要集中于人類疾病，如MAPK10基因可促進亞坤酸鈉誘導的皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡[11]、對神經(jīng)退行性疾病[12]及前列腺癌等疾病有調(diào)控作用[13]，但未見豬MAPK10基因序列的分析及表達報道，該基因?qū)ωi的脂肪沉積是否有影響還未知。

麗江豬來源于麗江古代野豬，經(jīng)長期進化和封閉繁育而成，至今已有1 300 多年歷史，2015 年通過國家鑒定，具有四肢高、體軀長、沉脂能力強、肌內(nèi)脂肪含量高、肉質(zhì)優(yōu)良和肉味鮮美等特點，能適應高原山區(qū)冷涼氣候及放養(yǎng)環(huán)境，是麗江市山區(qū)和半山區(qū)農(nóng)民養(yǎng)豬的當家品種[14]。本研究以麗江豬為材料，對MAPK10基因進行分離鑒定、序列分析及組織表達量檢測，為研究MAPK10基因在豬脂肪沉積中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

用于基因分離的樣品采自云南麗江姚園農(nóng)莊有限責任公司的90 頭麗江豬耳組織樣，采后裝入離心管（裝有75%乙醇）。選取相同條件下育肥至體質(zhì)量約100 kg 的麗江豬和大白豬各6 頭（公、母各半）進行屠宰，采集麗江豬的耳、腦、肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟和背脂組織樣以及背最長肌，采集大白豬的背脂，快速置于液氮中運回，-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成

以GenBank 中豬MAPK10基因序列（登錄號：NC_010450.4）為模板，用Primer premier 5.0 軟件設計引物（表1），分別擴增MAPK10基因的14 個外顯子，引物由北京擎科（昆明）生物技術(shù)有限公司合成。

表1 MAPK10 基因 PCR 引物Tab.1 PCR primers for MAPK10 gene

1.2.2 基因組DNA 提取與麗江豬MAPK10基因擴增

采用動物基因組DNA 提取試劑盒（TSINGKE，中國武漢），按照說明書方法從背脂組織樣品中提取DNA，以其為模板進行PCR 擴增。PCR 擴增體系（總體積25 μL）為：ddH2O 18 μL，含Mg2+的10×Buffer 2.5 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，5 U/μLTaq聚合酶0.5 μL，50 ng/μL DNA 模板1.0 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（各引物退火溫度見表1），72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；于72 ℃后延伸8 min，4 ℃終止反應。PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)檢測后的PCR 擴增產(chǎn)物送至北京擎科（昆明）生物技術(shù)有限公司進行序列測定，經(jīng)序列比對拼接，獲得麗江豬MAPK10基因序列。

1.2.3 生物信息學分析

參考盛丹等[15]的方法對麗江豬MAPK10基因序列進行生物信息學分析。開放閱讀框（ORF）采用NCBI 中的OFR Finder 應用程序預測；蛋白理化性質(zhì)采用ProtParam 在線軟件（https://web.expasy.org/protparam/）預測；親/疏水性采用Protscale 程 序（https://web.expasy.org/protscale/）分 析；信號肽采用SignaIP 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測；跨膜區(qū)采用TMHMM Serverv.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析；亞細胞定位采用在線軟件PsortⅡ（http://www.psort.org/psortb/）預測；卷曲結(jié)構(gòu)采用COILS Server（https://embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html）預測；磷酸化位點采用NetPhos3.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測；糖基化位點采用NetNGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預測；二級結(jié)構(gòu)采用SOPMA 程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測；三級結(jié)構(gòu)采用Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預測；用MegAlign 軟件對牛（NM_001083728.3）、雞（NM_001318224.3）、狗（XM_854 836.5）、山羊（XM_013964774.2）、人（NM_001318067.1）、豬（XM_021100770.1）、猴（XM_015138737.1）、鼠（NM_001081567.2）和綿羊（XM_012180302.2）的MAPK10基因序列進行同源性分析，并采用MEGA 6.0 構(gòu)建進化樹；采用CpG Plot 在線軟件（http://www.bioon.com.cn/doc/showarticle.asp?newsid=1115）預測CpG Plot。

1.2.4 麗江豬不同組織MAPK10基因相對表達量檢測

取麗江豬肝臟、心臟和背脂等9 種組織以及大白豬背脂，用Trizol 法提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin基因為內(nèi)參，實時熒光定量PCR 檢測MAPK10基因在麗江豬不同組織及大白豬背脂的表達情況，對兩豬種背脂表達量進行對比，所用引物見表2。PCR 擴增體系（總體積25 μL）為：2×qPCR Mix 12.5 μL，上、下游引物2.0 μL，cDNA 模 板2.5 μL，RNase-free 水8.0 μL。PCR 擴增程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)，由60 ℃升至95 ℃進行熔解反應。用2t-ΔΔC計算方法對所得PCR 的原始數(shù)據(jù)進行分析，計算不同組織中MAPK10基因相對表達量，以P＜0.05 為差異顯著性判斷標準。

表2 MAPK10 基因熒光定量PCR 引物Tab.2 MAPK10 gene fluorescence quantitative PCR primer

1.2.5 MAPK10 蛋白的Western-blotting 鑒定

參照徐開蓮等[16]的方法進行Western-blotting，以兔抗JNK3 單克隆抗體（購自abcam，貨號：ab124956）為一抗孵育2 h，以HRP 標記的山羊抗兔IgG 為二抗孵育2 h，DAB 顯色拍照并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MAPK10 基因編碼區(qū)序列的開放閱讀框（ORF）預測

預測獲得1 281 bp 的ORF（表3），編碼426 個氨基酸，起始于第1 個堿基，終止于第1 281 個堿基，與測序所得的MAPK10基因序列一致（圖1）。

圖1 麗江豬MAPK10 基因核苷酸及其編碼氨基酸序列Fig.1 Nucleotides and amino acid sequence of MAPK10 in Lijiang pig

表3 MAPK10 基因編碼區(qū)序列ORFTab.3 ORF of MAPK10 gene coding region sequence

2.2 MAPK10 蛋白理化性質(zhì)和親/疏水性分析

麗江豬MAPK10 蛋白由426 個氨基酸組成，分子質(zhì)量48.127 ku，亮氨酸（Leu）占比最高（9.4%），色氨酸（Trp）占比最低（0.9%）（表4）；親/疏水性分析顯示：多肽鏈第89 位氨基酸（亮氨酸）親水分數(shù)最大（2.067），第343 位氨基酸（天冬氨酸）親水分數(shù)最小（-2.811）（圖2），總平均親水性-0.305（表5），屬于親水蛋白；MAPK10 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為43.06，屬于不穩(wěn)定蛋白。

圖2 麗江豬MAPK10 蛋白質(zhì)親/疏水性分析Fig.2 The hydrophilicity or hydrophobicity of MAPK10 in Lijiang pig

表4 麗江豬MAPK10 蛋白的氨基酸組成Tab.4 Amino acid composition of MAPK10 protein in Lijiang pig

表5 麗江豬MAPK10 蛋白的基本理化性質(zhì)Tab.5 Basic physicochemical properties of MAPK10 protein in Lijiang pig

2.3 MAPK10 蛋白信號肽預測

信號肽預測顯示：麗江豬MAPK10 蛋白不存在信號肽，該蛋白屬于非分泌型蛋白。

2.4 MAPK10 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測與分析

蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測分析顯示：麗江豬MAPK 10 蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

2.5 MAPK10 蛋白亞細胞定位

由表6 可知：麗江豬MAPK10 蛋白主要分布在細胞核，部分分布在細胞質(zhì)及其他細胞器，可推斷麗江豬MAPK10 蛋白在細胞核中發(fā)揮作用。

表6 麗江豬MAPK10 蛋白亞細胞定位Tab.6 Location of MAPK10 protein in Lijiang pig

2.6 MAPK10 蛋白卷曲螺旋預測

麗江豬MAPK10 蛋白的卷曲結(jié)構(gòu)預測顯示：麗江豬MAPK10 蛋白無卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.7 MAPK10 蛋白糖基化位點、磷酸化位點預測

麗江豬MAPK10 蛋白有2 個糖基化位點，分別位于第63 和第384 氨基酸處（圖3）；其磷酸化位點見圖4，當潛在磷酸化位點的閾值為0.5時，麗江豬MAPK10 蛋白存在44 個潛在磷酸化位點，包含27 個絲氨酸位點、12 個蘇氨酸位點和5 個色氨酸位點。

圖3 麗江豬MAPK10 蛋白的糖基化位點預測結(jié)果Fig.3 Prediction results of MAPK10 glycosylation sites in Lijiang pig

圖4 麗江豬MAPK10 蛋白的磷酸化位點預測結(jié)果Fig.4 The predicted results of MAPK10 protein phosphorylation sites in Lijiang pig

2.8 MAPK10 蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

麗江豬MAPK10 蛋白的二級結(jié)構(gòu)（圖5）顯示：麗江豬MAPK10 蛋白α-螺旋區(qū)有179 個氨基酸（占42.02%），β-轉(zhuǎn)角區(qū)有17 個氨基酸（占3.99%），無規(guī)卷曲區(qū)有171 個氨基酸（占40.14%），延伸鏈區(qū)有59 個氨基酸（占13.85%）。

圖5 麗江豬MAPK10 蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure of MAPK10 protein in Lijiang pig

2.9 MAPK10 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

麗江豬MAPK10 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型（圖6）顯示：該蛋白經(jīng)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)，通過側(cè)鏈基團的相互作用進一步卷曲、折疊，借助次級鍵的相互作用形成三級結(jié)構(gòu)。

圖6 麗江豬MAPK10 蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.6 The tertiary structure of MAPK10 protein in Lijiang pig

2.10 MAPK10 基因同源性比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

MAPK10基因同源性比對結(jié)果（圖7）顯示：豬MAPK10基因序列與牛、雞、狗、山羊、人、猴、鼠和綿羊的同源性分別為93.5%、85.6%、91.2%、93.2%、95.3%、90.5%、92.6%和93.0%；系統(tǒng)進化樹顯示：麗江豬與人、山羊、綿羊、牛的親緣關系較近（圖8）。

圖7 麗江豬與8 個物種MAPK10 基因同源性分析Fig.7 Homology analysis of MAPK10 gene between Lijiang pig and eight kinds of species

圖8 基于9 個物種MAPK10 基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree constructed based on MAPK10 gene of nine species

2.11 MAPK10 基因CpG Plot 預測

麗江豬MAPK10基因的CpG island 預測結(jié)果顯示：麗江豬MAPK10基因沒有CpG island。

2.12 MAPK10 基因組織表達分析

由圖9 可知：MAPK10基因在麗江豬9 種組織中均有表達，表達量從高到低依次為腦、胰臟、腎臟、背最長肌、背脂、肝臟、脾臟、心臟和肺臟，MAPK10基因在麗江豬背脂中的mRNA表達量極顯著低于大白豬（P＜0.01，圖10）。

圖9 MAPK10 基因在麗江豬不同組織中的mRNA 表達量Fig.9 The mRNA expression of MAPK10 gene in different tissues of Lijiang pig

圖10 MAPK10 基因在麗江豬和大白豬背脂中的mRNA 表達量Fig.10 The mRNA expression of MAPK10 gene in Lijiang pig and Large White pig

2.13 MAPK10 蛋白表達分析

Western-blotting 分析結(jié)果（圖11）顯示：MAPK10 蛋白在麗江豬中的表達量低于大白豬（P＞0.05），該結(jié)果與mRNA 表達趨勢一致。

圖11 麗江豬和大白豬背脂中MAPK10 蛋白的表達情況對比Fig.11 Comparison of MAPK10 protein expression in back fat of Lijiang pig and Large White pig

3 討論

MAPK10基因在人[17]、鼠[18]、牛[19]和魚[20]中已被克隆。陳麗莉等[20]對MAPK10基因進行克隆，發(fā)現(xiàn)MAPK10基因在脊椎動物中有較高的保守性。本研究中MAPK10基因序列與牛、雞、狗、山羊、人、猴、鼠和綿羊的同源性分別為93.5%、85.6%、91.2%、93.2%、95.3%、90.5%、92.6%和93.0%，與陳麗莉等[20]的研究結(jié)果一致。

本研究通過熒光定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)：MAPK10基因在麗江豬腦、胰臟、腎臟、背最長肌和背脂等組織中均有表達，且在腦和胰臟中的表達量高于其他組織，推測MAPK10基因廣泛作用于能量和脂肪代謝等生理過程。大腦控制著代謝和神經(jīng)內(nèi)分泌，瘦素作用于下丘腦發(fā)揮降低食欲和增加能量消耗的作用。胰臟包括胰腺和胰島，胰腺分泌胰液流經(jīng)胰管到十二指腸，其中含胰脂肪酶，胰脂肪酶將中性脂肪分解成甘油和脂肪酸，使膳食脂肪充分被消化和吸收[21]。胰腺的胰島β 細胞是體內(nèi)胰島素的分泌細胞，MAPK10基因在胰島β 細胞中具有抗凋亡活性[22]，通過維持胰島素受體底物2（IRS2）和蛋白激酶B（Akt）信號通路的激活而發(fā)揮作用，當MAPK10基因表達時，胰島β 細胞分泌胰島素，磷酸化的Akt 信號通路激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信號通路而抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1 的活化[23-25]，減少機體脂肪酸、磷脂及甘油三酯的生物合成[26]，減少脂肪形成。另外，MAPK10（JNK3）基因能夠響應代謝應激的能量平衡穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制[10]，當MAPK10基因被瘦素激活時，調(diào)節(jié)刺鼠相關肽（agouti-related peptide，AgRP）神經(jīng)元的興奮性傳遞[27]，介導了MAPK10基因在高脂飲食小鼠AgRP神經(jīng)元中的作用，通過調(diào)節(jié)葡萄糖耐受性，降低血糖濃度，進而減少脂肪細胞肥大[10]。由此推測，MAPK10基因可能是通過招募細胞因子，讓細胞因子與靶細胞膜表面的受體結(jié)合將信號傳遞到細胞內(nèi)部，在細胞內(nèi)通過IRS2 和Akt 信號通路的激活并進一步激活AMPK 信號通路，抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1 活化，響應能量平衡穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，減少脂肪生成。

MAPK10基因除了在細胞核的特異性定位和關鍵轉(zhuǎn)錄因子等方面有影響外，也對胰島素分泌細胞表達基因的轉(zhuǎn)錄起作用[28]。ABDELLI 等[22,28]發(fā)現(xiàn)：MAPK10基因主要定位于β 細胞核，其沉默后會導致胰島素受體底物2 表達并降低Akt 蛋白磷酸化的激活程度，減少與脂蛋白分泌和甘油三酯合成相關基因的表達，從而減少脂肪沉積[29]。炎癥因子白細胞介素-5（IL-15）通過激活MAPK信號通路抑制脂肪細胞增殖[30]，其蛋白分子誘導脂肪細胞凋亡[31]，直接影響脂肪生成關鍵因子的活性，可能進一步抑制脂肪細胞增殖。本研究中，MAPK10基因編碼的蛋白在脂肪型麗江豬背脂中的表達量比瘦肉型大白豬低，這可能是導致麗江豬背部脂肪沉積增加和背膘變厚的原因之一，但具體的調(diào)控機制尚需進一步試驗驗證。

4 結(jié)論

本研究成功分離了麗江豬MAPK10基因編碼區(qū)，包含1 281 bp，編碼426 個氨基酸；MAPK10蛋白屬于酸性親水蛋白，無CpG island 和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，亞細胞定位主要在細胞核，與人、牛和綿羊的親緣關系較近；MAPK10基因在麗江豬背脂的表達量極顯著低于瘦肉型豬種大白豬，且在腦和胰臟中的表達量高于其他組織；MAPK10 蛋白在麗江豬背脂表達量低于瘦肉型豬種大白豬，推斷該基因可能有減少豬脂肪沉積的作用。