陳小辛，哈斯高娃，王學峰，張勇偉，娜仁花*

1.內蒙古農業(yè)大學動物科學學院動物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018；2.呼和浩特市菜籃子市場工作站，內蒙古呼和浩特 010020；3.內蒙古草原御驢科技牧業(yè)有限公司，內蒙古呼和浩特 010070

白藜蘆醇（Res）是研究最多的天然多酚之一，是一種自然產生的植物抗毒素，廣泛存在于葡萄、桑葚和花生等70多種植物中。20世紀90年代初根據流行病學數據，有學者發(fā)現法國的冠心病發(fā)病率很低且壽命長的人很多，推測原因可能是由于他們有日常有適量飲用紅酒的習慣。目前，Res因其優(yōu)秀的抗氧化特性，逐漸在牛、羊、豬等家畜精液保存中廣泛應用起來。添加Res可提高膜電位水平，降低活性氧含量。在雄性中，Res通過以下方式調節(jié)生殖功能：①促進雄激素生成。②刺激陰莖勃起。③促進精子發(fā)生，增大射精量。在雌性中，Res可使卵母細胞的質量提升，常常添加在卵母細胞的冷凍保護劑中，主要具有抗氧化和抗凋亡作用。錳存在于所有細菌、植物、人類和畜禽組織體內，是維持正常氨基酸、脂質、蛋白質和碳水化合物代謝所必需的元素。根據醫(yī)學研究所和世界衛(wèi)生組織要求，每日錳攝入的適當劑量為男性和女性分別為2.3、1.8 mg/d，最大劑量11 mg/d被認為是不影響健康的。錳因其較好的抗氧化效果，經常在醫(yī)學研究中出現，但到目前為止，白藜蘆醇和錳在保存精液及改善其品質方面的研究極少。

目前，驢凍精解凍后的精子質量仍被認為低于包括馬在內的其它動物的精子質量，所以人們在稀釋液里添加各類的抗氧化劑以期能提高精液品質，白藜蘆醇和MnCl2在驢精液保存方面研究不多，本次試驗探討Res和MnCl2對驢凍精品質影響，為馬屬動物精液保存奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

種公驢來自內蒙古自治區(qū)呼和浩特市和林格爾縣草原御驢養(yǎng)殖場。采精時間在驢繁殖季節(jié)，預采精2周，試驗開始隔天采精，每次采取等量精液，鮮精活力不低于0.7方可進行后續(xù)試驗。

1.2 主要試劑

白藜蘆醇、MnCl2，羅恩試劑；細胞凋亡檢測盒，BD；精子頂體形態(tài)花生凝集素熒光標記（PNA-FITC）染色試劑盒，哈靈；ROS活性氧檢測試劑盒，US生物熒光試劑專家；SOD試劑盒，Solarbio；GSH-Px試劑盒，雷根生物；CAT試劑盒，雷根生物；瑞氏姬姆薩復合染色液，coolaber；RIPA，碧云天。

1.3 驢冷凍精液制作

1.3.1 溶液配制

離心液配制：按照水50 mL+10%脫脂乳50 mL+乳糖0.15 g+葡萄糖2.5 g+卵黃20 mL精準稱量，進行配制，最后加入卵黃時用磁力攪拌機充分攪拌，封口膜封好置于4 ℃冰箱過夜，第2天離心取上清液備用（5 000 rpm/min離心2次，每次20 min，存放時間不超過24 h）。

冷凍液配制：用燒杯稱取適量離心后的離心液，加入2.6%甘油和不同濃度的Res、MnCl2，磁力攪拌器攪拌20 min以上，現用現配。

1.3.2 精液預處理及初步質檢

鮮精用日本進口過濾紙濾到燒杯，用玻璃棒撥出副性腺分泌的膠狀物，然后觀察顏色嗅氣味，正常顏色呈淡黃色或乳灰色，微腥，完成初步檢測后放在32 ℃的恒溫水浴鍋中待用。

精子形態(tài)無過多明顯異常，其活力不低于0.7，密度不低于1×108，方可進行下一步凍精。

1.3.3 細管凍精制作

向原精液中按1∶1比例加入離心液，然后在比室溫高2 ℃的溫度下靜置2 min，1 300 rpm/min，室溫離心10 min，棄上清液。再按適當比例加入冷凍液，輕輕搖勻，用嘴將冷凍液緩慢吸入0.25 mL的細管中，蘸取封口粉封口，拿4層毛巾包裹好放進4 ℃冰箱平衡110 min，同時將熏蒸架也放入冰箱預冷。提前10 min將液氮倒進泡沫箱預冷，將細管平鋪于熏蒸架上。將其置于液氮面3 cm處，關蓋熏蒸12 min，到時間立即投到液氮里。迅速將細管從液氮罐中拿出，在37 ℃水浴鍋里搖動30 s，拿出時用紙將細管表面的水擦干。

1.4 精子質量評價

1.4.1 精子活力

用精子分析儀進行觀察，捕捉5個視野，計算直線運動精子個數占視野總數的比例，精子總數不得少于500個。

1.4.2 膜完整性檢查

進行低滲腫脹測定，配制低滲液：檸檬酸鈉7.85 g，果糖1.4 g，超純水定容至100 mL，放進37 ℃培養(yǎng)箱預熱。膜完整的精子其尾部呈彎曲狀，反之則為膜不完整精子，精子總數不得少于200個，計算彎尾精子占總數比例，最后再用流氏細胞儀進行結果驗證。

1.4.3 頂體完整性檢查

采用瑞氏-姬姆薩復合染液染色法，取6 μL待測精液置于潔凈載玻片的一端，制成均勻的精液抹片，待抹片自然干燥后滴加2～3滴瑞氏-姬姆薩染液覆蓋整個抹片，染色1～2 min。滴加等量的0.01 M磷酸鹽緩沖液（pH6.4～6.8），緩慢晃動玻片使其與瑞氏-姬姆薩染色液充分混勻，染色10 min。用洗瓶將染色液洗脫，濾紙吸干水分后在1000倍顯微鏡的油鏡下進行觀察。依據精子頂體染色情況看是否完整。

1.4.4 ROS含量

清洗并收集足量細胞，準備ROS探針，探針裝載前按1∶1 000用PBS稀釋DCFH-DA，使其最終濃度為10 μm。裝載探針，用0.5～1 mLPBS重懸細胞（0.5～1×105/mL）。最后用PBS清洗細胞，以充分去除未進去細胞內的DCFH-DA，上流氏細胞儀待檢。選擇FL1或BL1通道，488 nm激發(fā)，測定530 nm的發(fā)射。

1.4.5 抗氧化指標測定

將解凍后精液嚴格按照試劑盒操作說明測定。

1.5 數據分析

使用SPSS26.0進行ANOVA單因素方差分析。

2 結果

2.1 不同濃度Res對解凍后精子活率、膜完整率、頂體完整率以及ROS含量的影響

由表1可知，添加20、40、100 μm Res組的活力顯著高于對照組（p＜0.05），20、40 μm Res組質膜完整率顯著高于對照組（p＜0.05），10、20、40 μm Res組的頂體完整率顯著高于對照組（p＜0.05），添加40 μm Res可以降低ROS含量。

表 1 不同濃度Res對驢精液凍后品質的影響

2.2 不同濃度MnCl2對解凍后精子活率、膜完整率、頂體完整率以及ROS含量的影響

由表2可知，添加2、5 μm MnCl2組的活力、質膜完整率顯著高于對照組（p＜0.05），5 μm MnCl2組的頂體完整率顯著高于對照組（p＜0.05），10 μm MnCl2組的ROS含量顯著低于對照組。

表2不同濃度MnCl2對驢精液凍后品質的影響

2.3 添加不同濃度Res對精子內抗氧化酶活性的影響

由表3可知，添加20、40、100 μm Res組的SOD含量顯著高于對照組（p＜0.05），10、20、40μm Res組的CAT含量顯著高于對照組（p＜0.05），40 μm Res組的GSH-Px含量顯著高于對照組（p＜0.05）。

表3 不同濃度Res對抗氧化酶活性影響

2.4 不同濃度MnCl2對抗氧化酶活性影響

由表4可知，與對照組相比，添加5 μm MnCl2時SOD、CAT含量顯著高于對照組（p＜0.05），避免其遭受氧化損傷，在一定程度上提高驢冷凍-解凍后精液品質。

表4 不同濃度MnCl2對抗氧化酶活性影響

3 討論

Res是一種天然多酚和植物雌激素，具有保護心臟、抗癌、抗菌和舒張血管的作用。此外，白藜蘆醇對改善家畜卵巢和睪丸功能具有潛在的有益作用。一些研究已經證實Res可以調節(jié)動物繁殖，在雌性動物中，它能調節(jié)卵巢功能和類固醇生成，被用于提高卵母細胞的質量和作為配子冷凍保護劑，主要因其強大的抗氧化和抗凋亡的作用。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），是一種蛋白激酶，它存在于每一個細胞中，是生物體代謝的總開關，很多器官細胞內都有AMPK合成，包括脂肪細胞、肝臟、腦部和肌肉細胞。在雄性中Res通過激活AMPK通路進而增強睪丸功能和精子發(fā)生。此外，Res已補充到精液保存液中，提高精子質量，總之Res對改善卵巢和睪丸功能具有潛在的有益作用。CM Assuno等研究發(fā)現在公牛精液稀釋液中添加Res可使解凍后的精子質量提高，且呈劑量依賴性，當添加0.05 μm濃度的Res時，與精子質量相關的變量值更大，且補充Res對體外受精后胚胎發(fā)育到卵裂期和囊胚期的比例沒有影響。Chong-Yang Li發(fā)現其不僅可以保護線粒體功能和頂體完整性，還可以提高體外受精（IVF）后的囊胚率和質量。Chunrong Lv等發(fā)現在精液冷凍劑中添加濃度10 μm或50 μm的Res，可改善解凍后山羊精子質量，這可能是由于其抑制ROS生成而發(fā)生的。在公牛精液補充劑中添加白藜蘆醇會以劑量依賴的方式提高解凍后的精子質量，Eva Tvrdá從新鮮牛精液中洗出精子，將其懸浮在2.9%檸檬酸鈉中，添加不同濃度Res，最終發(fā)現Res可以逆轉ROS介導的牛精子運動能力、活力和細胞內抗氧化能力的損傷的效率，當其濃度在50 μmol/L時，具有顯著的抗氧化作用，可以防止ROS對精子的有害影響，保持雄性生殖細胞的受精潛能，與本試驗結果一致。

抗氧化劑常常被用來減少破壞氧化連鎖反應所生成的氧化應激。一些研究表明，錳抑制氧化應激損傷，可以緩解氧化應激和改善體外條件下的精子活力及質量，還有人發(fā)現Mn2+的補充除提升精子質量外，還可提高精子鞭毛的運動和鞭打速度。Eybl研究表明，Mn2+處理急性鎘中毒對睪丸有明顯的保護作用防止體內氧化損傷。目前錳對雄性生殖方面研究不多，其具體作用位置與作用機制也不太明確，以抗氧化劑添加在冷凍液中的研究更是寥寥無幾。Cheema等人在凍存液中加入Mn2+，發(fā)現其以劑量依賴的方式顯著改善凍牛解凍后的運動能力，最大可添加至150 μm。因此可以推測Mn2+作為抗氧劑對精子在低溫保存過程中的抗氧化作用可能有一定積極影響，保持酶系統(tǒng)正常運行，清除活性自由基或通過降低氧化應激從而能降低細胞凋亡冷凍損傷對牛精子的影響。盡管錳是多種生理過程正常運行所必需的必需微量元素，但長期存在精液中也會使其中毒。本試驗在冷凍液中添加適量MnCl2會改善驢凍后精液品質，說明其抗氧化功能可以在一定程度上緩解精子受活性氧的損害。

4 結論

本試驗證明在冷凍液中添加40 μm的白藜蘆醇、5 μm的MnCl2可以改善驢凍精質量，顯著提升冷凍-解凍后精子活力、質膜完整、頂體完整性，減少ROS含量，提升抗氧化酶活性，這可能與它們的抗氧化特性有關，但白藜蘆醇和MnCl2能否提高德州驢凍精的人工授精效果還有待進一步研究。吉

參考文獻：略