陳小辛，哈斯高娃，王學(xué)峰，張勇偉，娜仁花*

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.呼和浩特市菜籃子市場(chǎng)工作站，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；3.內(nèi)蒙古草原御驢科技牧業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010070

白藜蘆醇（Res）是研究最多的天然多酚之一，是一種自然產(chǎn)生的植物抗毒素，廣泛存在于葡萄、桑葚和花生等70多種植物中。20世紀(jì)90年代初根據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)法國(guó)的冠心病發(fā)病率很低且壽命長(zhǎng)的人很多，推測(cè)原因可能是由于他們有日常有適量飲用紅酒的習(xí)慣。目前，Res因其優(yōu)秀的抗氧化特性，逐漸在牛、羊、豬等家畜精液保存中廣泛應(yīng)用起來(lái)。添加Res可提高膜電位水平，降低活性氧含量。在雄性中，Res通過(guò)以下方式調(diào)節(jié)生殖功能：①促進(jìn)雄激素生成。②刺激陰莖勃起。③促進(jìn)精子發(fā)生，增大射精量。在雌性中，Res可使卵母細(xì)胞的質(zhì)量提升，常常添加在卵母細(xì)胞的冷凍保護(hù)劑中，主要具有抗氧化和抗凋亡作用。錳存在于所有細(xì)菌、植物、人類和畜禽組織體內(nèi)，是維持正常氨基酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物代謝所必需的元素。根據(jù)醫(yī)學(xué)研究所和世界衛(wèi)生組織要求，每日錳攝入的適當(dāng)劑量為男性和女性分別為2.3、1.8 mg/d，最大劑量11 mg/d被認(rèn)為是不影響健康的。錳因其較好的抗氧化效果，經(jīng)常在醫(yī)學(xué)研究中出現(xiàn)，但到目前為止，白藜蘆醇和錳在保存精液及改善其品質(zhì)方面的研究極少。

目前，驢凍精解凍后的精子質(zhì)量仍被認(rèn)為低于包括馬在內(nèi)的其它動(dòng)物的精子質(zhì)量，所以人們?cè)谙♂屢豪锾砑痈黝惖目寡趸瘎┮云谀芴岣呔浩焚|(zhì)，白藜蘆醇和MnCl2在驢精液保存方面研究不多，本次試驗(yàn)探討Res和MnCl2對(duì)驢凍精品質(zhì)影響，為馬屬動(dòng)物精液保存奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

種公驢來(lái)自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市和林格爾縣草原御驢養(yǎng)殖場(chǎng)。采精時(shí)間在驢繁殖季節(jié)，預(yù)采精2周，試驗(yàn)開(kāi)始隔天采精，每次采取等量精液，鮮精活力不低于0.7方可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 主要試劑

白藜蘆醇、MnCl2，羅恩試劑；細(xì)胞凋亡檢測(cè)盒，BD；精子頂體形態(tài)花生凝集素?zé)晒鈽?biāo)記（PNA-FITC）染色試劑盒，哈靈；ROS活性氧檢測(cè)試劑盒，US生物熒光試劑專家；SOD試劑盒，Solarbio；GSH-Px試劑盒，雷根生物；CAT試劑盒，雷根生物；瑞氏姬姆薩復(fù)合染色液，coolaber；RIPA，碧云天。

1.3 驢冷凍精液制作

1.3.1 溶液配制

離心液配制：按照水50 mL+10%脫脂乳50 mL+乳糖0.15 g+葡萄糖2.5 g+卵黃20 mL精準(zhǔn)稱量，進(jìn)行配制，最后加入卵黃時(shí)用磁力攪拌機(jī)充分?jǐn)嚢瑁饪谀し夂弥糜? ℃冰箱過(guò)夜，第2天離心取上清液備用（5 000 rpm/min離心2次，每次20 min，存放時(shí)間不超過(guò)24 h）。

冷凍液配制：用燒杯稱取適量離心后的離心液，加入2.6%甘油和不同濃度的Res、MnCl2，磁力攪拌器攪拌20 min以上，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 精液預(yù)處理及初步質(zhì)檢

鮮精用日本進(jìn)口過(guò)濾紙濾到燒杯，用玻璃棒撥出副性腺分泌的膠狀物，然后觀察顏色嗅氣味，正常顏色呈淡黃色或乳灰色，微腥，完成初步檢測(cè)后放在32 ℃的恒溫水浴鍋中待用。

精子形態(tài)無(wú)過(guò)多明顯異常，其活力不低于0.7，密度不低于1×108，方可進(jìn)行下一步凍精。

1.3.3 細(xì)管凍精制作

向原精液中按1∶1比例加入離心液，然后在比室溫高2 ℃的溫度下靜置2 min，1 300 rpm/min，室溫離心10 min，棄上清液。再按適當(dāng)比例加入冷凍液，輕輕搖勻，用嘴將冷凍液緩慢吸入0.25 mL的細(xì)管中，蘸取封口粉封口，拿4層毛巾包裹好放進(jìn)4 ℃冰箱平衡110 min，同時(shí)將熏蒸架也放入冰箱預(yù)冷。提前10 min將液氮倒進(jìn)泡沫箱預(yù)冷，將細(xì)管平鋪于熏蒸架上。將其置于液氮面3 cm處，關(guān)蓋熏蒸12 min，到時(shí)間立即投到液氮里。迅速將細(xì)管從液氮罐中拿出，在37 ℃水浴鍋里搖動(dòng)30 s，拿出時(shí)用紙將細(xì)管表面的水擦干。

1.4 精子質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.4.1 精子活力

用精子分析儀進(jìn)行觀察，捕捉5個(gè)視野，計(jì)算直線運(yùn)動(dòng)精子個(gè)數(shù)占視野總數(shù)的比例，精子總數(shù)不得少于500個(gè)。

1.4.2 膜完整性檢查

進(jìn)行低滲腫脹測(cè)定，配制低滲液：檸檬酸鈉7.85 g，果糖1.4 g，超純水定容至100 mL，放進(jìn)37 ℃培養(yǎng)箱預(yù)熱。膜完整的精子其尾部呈彎曲狀，反之則為膜不完整精子，精子總數(shù)不得少于200個(gè)，計(jì)算彎尾精子占總數(shù)比例，最后再用流氏細(xì)胞儀進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。

1.4.3 頂體完整性檢查

采用瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液染色法，取6 μL待測(cè)精液置于潔凈載玻片的一端，制成均勻的精液抹片，待抹片自然干燥后滴加2～3滴瑞氏-姬姆薩染液覆蓋整個(gè)抹片，染色1～2 min。滴加等量的0.01 M磷酸鹽緩沖液（pH6.4～6.8），緩慢晃動(dòng)玻片使其與瑞氏-姬姆薩染色液充分混勻，染色10 min。用洗瓶將染色液洗脫，濾紙吸干水分后在1000倍顯微鏡的油鏡下進(jìn)行觀察。依據(jù)精子頂體染色情況看是否完整。

1.4.4 ROS含量

清洗并收集足量細(xì)胞，準(zhǔn)備ROS探針，探針裝載前按1∶1 000用PBS稀釋DCFH-DA，使其最終濃度為10 μm。裝載探針，用0.5～1 mLPBS重懸細(xì)胞（0.5～1×105/mL）。最后用PBS清洗細(xì)胞，以充分去除未進(jìn)去細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，上流氏細(xì)胞儀待檢。選擇FL1或BL1通道，488 nm激發(fā)，測(cè)定530 nm的發(fā)射。

1.4.5 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

將解凍后精液嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS26.0進(jìn)行ANOVA單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Res對(duì)解凍后精子活率、膜完整率、頂體完整率以及ROS含量的影響

由表1可知，添加20、40、100 μm Res組的活力顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），20、40 μm Res組質(zhì)膜完整率顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），10、20、40 μm Res組的頂體完整率顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），添加40 μm Res可以降低ROS含量。

表 1 不同濃度Res對(duì)驢精液凍后品質(zhì)的影響

2.2 不同濃度MnCl2對(duì)解凍后精子活率、膜完整率、頂體完整率以及ROS含量的影響

由表2可知，添加2、5 μm MnCl2組的活力、質(zhì)膜完整率顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），5 μm MnCl2組的頂體完整率顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），10 μm MnCl2組的ROS含量顯著低于對(duì)照組。

表2不同濃度MnCl2對(duì)驢精液凍后品質(zhì)的影響

2.3 添加不同濃度Res對(duì)精子內(nèi)抗氧化酶活性的影響

由表3可知，添加20、40、100 μm Res組的SOD含量顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），10、20、40μm Res組的CAT含量顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），40 μm Res組的GSH-Px含量顯著高于對(duì)照組（p＜0.05）。

表3 不同濃度Res對(duì)抗氧化酶活性影響

2.4 不同濃度MnCl2對(duì)抗氧化酶活性影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，添加5 μm MnCl2時(shí)SOD、CAT含量顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），避免其遭受氧化損傷，在一定程度上提高驢冷凍-解凍后精液品質(zhì)。

表4 不同濃度MnCl2對(duì)抗氧化酶活性影響

3 討論

Res是一種天然多酚和植物雌激素，具有保護(hù)心臟、抗癌、抗菌和舒張血管的作用。此外，白藜蘆醇對(duì)改善家畜卵巢和睪丸功能具有潛在的有益作用。一些研究已經(jīng)證實(shí)Res可以調(diào)節(jié)動(dòng)物繁殖，在雌性動(dòng)物中，它能調(diào)節(jié)卵巢功能和類固醇生成，被用于提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量和作為配子冷凍保護(hù)劑，主要因其強(qiáng)大的抗氧化和抗凋亡的作用。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），是一種蛋白激酶，它存在于每一個(gè)細(xì)胞中，是生物體代謝的總開(kāi)關(guān)，很多器官細(xì)胞內(nèi)都有AMPK合成，包括脂肪細(xì)胞、肝臟、腦部和肌肉細(xì)胞。在雄性中Res通過(guò)激活A(yù)MPK通路進(jìn)而增強(qiáng)睪丸功能和精子發(fā)生。此外，Res已補(bǔ)充到精液保存液中，提高精子質(zhì)量，總之Res對(duì)改善卵巢和睪丸功能具有潛在的有益作用。CM Assuno等研究發(fā)現(xiàn)在公牛精液稀釋液中添加Res可使解凍后的精子質(zhì)量提高，且呈劑量依賴性，當(dāng)添加0.05 μm濃度的Res時(shí)，與精子質(zhì)量相關(guān)的變量值更大，且補(bǔ)充Res對(duì)體外受精后胚胎發(fā)育到卵裂期和囊胚期的比例沒(méi)有影響。Chong-Yang Li發(fā)現(xiàn)其不僅可以保護(hù)線粒體功能和頂體完整性，還可以提高體外受精（IVF）后的囊胚率和質(zhì)量。Chunrong Lv等發(fā)現(xiàn)在精液冷凍劑中添加濃度10 μm或50 μm的Res，可改善解凍后山羊精子質(zhì)量，這可能是由于其抑制ROS生成而發(fā)生的。在公牛精液補(bǔ)充劑中添加白藜蘆醇會(huì)以劑量依賴的方式提高解凍后的精子質(zhì)量，Eva Tvrdá從新鮮牛精液中洗出精子，將其懸浮在2.9%檸檬酸鈉中，添加不同濃度Res，最終發(fā)現(xiàn)Res可以逆轉(zhuǎn)ROS介導(dǎo)的牛精子運(yùn)動(dòng)能力、活力和細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的損傷的效率，當(dāng)其濃度在50 μmol/L時(shí)，具有顯著的抗氧化作用，可以防止ROS對(duì)精子的有害影響，保持雄性生殖細(xì)胞的受精潛能，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

抗氧化劑常常被用來(lái)減少破壞氧化連鎖反應(yīng)所生成的氧化應(yīng)激。一些研究表明，錳抑制氧化應(yīng)激損傷，可以緩解氧化應(yīng)激和改善體外條件下的精子活力及質(zhì)量，還有人發(fā)現(xiàn)Mn2+的補(bǔ)充除提升精子質(zhì)量外，還可提高精子鞭毛的運(yùn)動(dòng)和鞭打速度。Eybl研究表明，Mn2+處理急性鎘中毒對(duì)睪丸有明顯的保護(hù)作用防止體內(nèi)氧化損傷。目前錳對(duì)雄性生殖方面研究不多，其具體作用位置與作用機(jī)制也不太明確，以抗氧化劑添加在冷凍液中的研究更是寥寥無(wú)幾。Cheema等人在凍存液中加入Mn2+，發(fā)現(xiàn)其以劑量依賴的方式顯著改善凍牛解凍后的運(yùn)動(dòng)能力，最大可添加至150 μm。因此可以推測(cè)Mn2+作為抗氧劑對(duì)精子在低溫保存過(guò)程中的抗氧化作用可能有一定積極影響，保持酶系統(tǒng)正常運(yùn)行，清除活性自由基或通過(guò)降低氧化應(yīng)激從而能降低細(xì)胞凋亡冷凍損傷對(duì)牛精子的影響。盡管錳是多種生理過(guò)程正常運(yùn)行所必需的必需微量元素，但長(zhǎng)期存在精液中也會(huì)使其中毒。本試驗(yàn)在冷凍液中添加適量MnCl2會(huì)改善驢凍后精液品質(zhì)，說(shuō)明其抗氧化功能可以在一定程度上緩解精子受活性氧的損害。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)證明在冷凍液中添加40 μm的白藜蘆醇、5 μm的MnCl2可以改善驢凍精質(zhì)量，顯著提升冷凍-解凍后精子活力、質(zhì)膜完整、頂體完整性，減少ROS含量，提升抗氧化酶活性，這可能與它們的抗氧化特性有關(guān)，但白藜蘆醇和MnCl2能否提高德州驢凍精的人工授精效果還有待進(jìn)一步研究。吉

參考文獻(xiàn)：略