吳林菁，張幸幸，蔡正倫，陳英，肖婷，周雪，張嫩玲，張彥燕，陶玲，沈祥春

(貴州醫(yī)科大學 藥學院 & 天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室, 貴州 貴陽 550025; 藥用植物功效與利用國家重點實驗室, 貴州 貴陽 550025; 貴州省普通高等學校天然藥物藥理與成藥性評價重點實驗室, 貴州 貴陽 550025; 貴州省特色天然藥物資源高效利用工程中心，貴州 貴陽 550025)

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是因嘌呤代謝異常導致的以高尿酸為特征的代謝性疾病，是痛風發(fā)作的重要病理基礎(chǔ)，更是高血壓、冠心病、肥胖癥及胰島素抵抗等疾病發(fā)生的危險因素，并增加心血管疾病和糖尿病死亡率，如何有效防治高尿酸血癥已成為目前醫(yī)療界的研究熱點[1-3]。從傳統(tǒng)醫(yī)學辨證角度，血尿酸升高是由膏人中滿，氣血運行不暢，積聚成濁、或進一步流注經(jīng)絡(luò)而成，屬“尿酸濁”范疇[4-5]。中醫(yī)認為高尿酸血癥的治療需從整體辨治，把握通腑瀉濁大法，辨清虛實急緩加減用藥，臨床上治療高尿酸血癥的中藥多以清熱利濕、健脾益氣、固腎泄?jié)釣橹鱗6-8]。艷山姜來源于姜科植物艷山姜Alpiniazerumbet(Pers.)Burtt.et Smith的新鮮或干燥果實，具有溫中燥濕，行氣止痛，截瘧等功效[9]。艷山姜的主要化學成分為揮發(fā)油類、黃酮類和二萜類等化合物[10-12]，本課題組經(jīng)過多年研究證實，艷山姜揮發(fā)油具有顯著的心血管活性[12-14]，主要體現(xiàn)在抗高血壓、動脈粥樣硬化、調(diào)血脂、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化等藥理作用[15-19]。本研究結(jié)合高尿酸血癥疾病發(fā)生發(fā)展的特點，考察艷山姜揮發(fā)油對氧嗪酸鉀誘導高尿酸血癥小鼠的血清尿酸平衡及腎保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物 SPF級雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(京)2019-0010，所有動物于試驗前12 h禁食不禁水。

1.1.2藥品與試劑 實驗所用藥材經(jīng)貴州醫(yī)科大學龍慶德副教授鑒定為姜科山姜屬植物艷山姜Alpiniazerumbet(Pets.)Burtt.et Smith 的干燥成熟果實，采自貴州省黔西南州貞豐縣連環(huán)鄉(xiāng)巧巖村。別嘌呤醇(合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號20200101)，氧嗪酸鉀(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號A2003023)，吐溫-80(國藥集團化學試劑有限公司，批號20180104)，無水硫酸鈉(重慶江川化工有限公司，批號20130320)，尿酸試劑盒、肌酐試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器 ZNHW型電熱套(鄭州標普電子科技有限公司)，E104/02型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，Microfuge 20R型冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特公司)，XW-80A漩渦混合儀(上海馳唐電子有限公司)，KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，UPW-UP-10超純水處理器(成都天莘寧科技有限公司)，LUX 3020-426多功能酶標儀(賽默飛世爾科技公司)，Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀(濟南丹吉爾電子有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1艷山姜揮發(fā)油的提取制備 將艷山姜干燥果實破碎至種子破裂，按藥典要求均勻取樣，精密稱取500 g，加12倍蒸餾水浸泡1 h，按2020年版《中國藥典》(四部)通則2204揮發(fā)油測定法提取7 h，收集揮發(fā)油，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2小鼠高尿酸血癥模型的構(gòu)建 50只健康SPF級昆明種雄性小鼠，隨機分為空白對照組、模型對照組(氧嗪酸鉀組，250 mg/kg)、陽性對照組(別嘌呤醇組，35 mg/kg)和艷山姜高、低劑量組(160 mg/kg、100 mg/kg)，每組各10只。模型組、艷山姜高、低劑量組和陽性對照組每日腹腔注射氧嗪酸鉀鹽(250 mg/kg)，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水；1 h后按劑量灌胃給藥艷山姜揮發(fā)油和陽性藥物，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥前，小鼠禁食12 h，給藥結(jié)束后1 h，采集生物樣品。

1.2.3樣品收集 在末次給藥后1 h，小鼠眼球后靜脈叢取血，室溫放置45 min，4 ℃ 5 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，置于-20 ℃保存儲存?zhèn)溆茫蝗⊙?，斷頸處死小鼠，于冰臺上快速分取肝臟和腎臟組織，生理鹽水清洗后，置于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標

1.3.1生化指標測定 血清尿酸、肌酐活性按照試劑盒方法測定。

1.3.2腎臟蘇木精-伊紅染(HE)染色 小鼠眼球取血處死后，取出腎臟組織，用10%中性甲醛溶液固定、脫水、制備成3 μm厚石蠟切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察各組小鼠腎臟組織學變化。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 血清尿酸、肌酐水平

與空白比較，模型組小鼠血清尿酸水平顯著升高(P<0.01)，提示氧嗪酸鉀造模成功，小鼠血清肌酐水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，艷山姜揮發(fā)油高、低劑量組可以顯著改善氧嗪酸鉀鹽誘導的高尿酸小鼠尿酸、肌酐指標的異常變化(P<0.05)，且艷山姜低劑量組對尿酸的降低作用高于艷山姜高劑量組，但艷山姜高劑量組降低肌酐的作用優(yōu)于艷山姜低劑量組。結(jié)果見表1和圖1。

注：(1)與空白組比較，P<0.01；(2)與空白組比較，P<0.05；(3)與模型組比較，P<0.05；(4)與模型組比較，P<0.01。

表1 各組小鼠血清尿酸及肌酐水平

2.2 腎組織病理學變化

與空白對照組比較，模型組見明顯的腎被膜增厚水腫，腎小管不同程度變性壞死、細胞管型及炎性細胞浸潤等病理改變，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組與艷山姜揮發(fā)油高、低劑量組小鼠腎組織病變有不同程度減輕，其中陽性對照組病變有所減輕，艷山姜低劑量組明顯減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，艷山姜高劑量組未見明顯病理改變。見圖2。

注：A、B、C、D、E分別為空白對照組、模型組、陽性對照組、艷山姜揮發(fā)油高劑量組、艷山姜揮發(fā)油低劑量組。

3 討論

尿酸酶能促使尿酸迅速氧化成尿囊素，不再被腎小管重吸收而排泄，由于人類進化過程中喪失了此基因，故在造模中降低尿酸酶活性不僅與人類發(fā)病機制更貼近，而且成模時間短，效果明顯[20-22]。本研究使用抑制尿酸酶活性的化學藥物氧嗪酸鉀，抑制小鼠體內(nèi)尿囊素的生成，以提高體內(nèi)尿酸的水平，制備高尿酸血癥小鼠模型。高尿酸血癥的主要治療原則是控制血尿酸水平，目前治療高尿酸血癥的主力軍仍是西藥，主要包括抑制尿酸生成的藥物如別嘌醇、非布司他，促進尿酸排泄的藥物如苯溴馬隆、丙磺舒、磺吡酮，以及尿酸氧化酶類藥物[23]。西藥治療高尿酸血癥雖療效顯著，但往往均需要長期服用，且伴隨有不同癥狀不同程度的副反應(yīng)，大大限制了其臨床使用，因此尋找安全有效的降尿酸藥物迫在眉睫。中藥由于其副作用較小，不良反應(yīng)不明顯且療效較好，成為近些年研究開發(fā)抗高尿酸血癥藥物的熱點。

本研究表明艷山姜揮發(fā)油具有降低高尿酸血癥小鼠尿酸水平和改善腎功能作用，具體表現(xiàn)為艷山姜揮發(fā)油高、低劑量組可以顯著降低氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥小鼠血清尿酸、肌酐水平，同時改善腎臟病理變化。

綜上所述，本研究以具有顯著心血管活性的貴州地產(chǎn)特色民族藥艷山姜揮發(fā)油部位為研究對象，采用氧嗪酸鉀誘導高尿酸血癥小鼠模型，驗證了艷山姜揮發(fā)油能夠顯著降低高尿酸血癥模型小鼠血清中尿酸、肌酐水平，以及對腎損傷具有一定保護作用，表明艷山姜揮發(fā)油具有較好的降低血清尿酸水平的作用，而其作用機制還有待進一步深入研究。