葛韻芝，許 寅，丁 超

上海市公共衛(wèi)生臨床中心,上海 201508

結(jié)直腸癌是男性癌癥死亡的第三和女性癌癥死亡的第二大原因［1-3］。由于該病病程隱匿，在臨床上，大多數(shù)結(jié)直腸癌患者直到Ⅱ～Ⅲ期才得到確診［1］，這使得結(jié)直腸癌難以在早期被干預(yù)。因此，手術(shù)與藥物化療仍然在結(jié)直腸癌治療中發(fā)揮重要作用［4］。近年來(lái)，結(jié)直腸癌患者的五年生存率未見(jiàn)明顯提升［5］。目前，研究表明，中藥單用或聯(lián)合化療藥物可以改善結(jié)直腸癌患者生存與生活質(zhì)量［6］。四君子湯，見(jiàn)于宋代《太平惠民和劑局方》，用于脾胃氣虛證，近年來(lái)常被用于結(jié)直腸癌的臨床治療［7-9］。作為補(bǔ)氣健脾的經(jīng)典方，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草組成。研究表明，其能改善結(jié)直腸癌患者血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）與酸性成纖維生長(zhǎng)因子（acid fibroblast growth factor，aFGF）水平［8］；影響結(jié)腸癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和端粒長(zhǎng)度［10］；改善結(jié)腸癌患者細(xì)胞凋亡及腸道屏障恢復(fù)情況［11］。然而，由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，四君子湯對(duì)結(jié)直腸癌療效的分子機(jī)制尚不清楚。

作為中醫(yī)研究的新領(lǐng)域，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以通過(guò)使用建立中藥復(fù)方化合物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅仁侄螐南到y(tǒng)的角度闡明中醫(yī)藥的作用機(jī)制［12-13］。在本研究中，我們通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?、富集分析及魯棒性分析等方法?duì)四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了研究，為其臨床應(yīng)用與藥物開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP）、中醫(yī)藥資料庫(kù)（traditional Chinese medicine database，TCM database@Taiwan）、中醫(yī)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（traditional Chinese medicine integrative database ，TCMID）、中藥潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)平臺(tái)（traditional Chinese medicine potential target database，TCMPTD）與草藥成分和靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（herbal ingredients'targets database，HIT）用于中藥復(fù)方四君子湯的化合物與靶標(biāo)收集，數(shù)據(jù)納入條件為生物利用度（oral bioavailability，OB）大于30% 及類(lèi)藥性（druglikeness，DL）大于0.18；OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、DisgeneT 數(shù)據(jù)庫(kù)與GeneCard 數(shù)據(jù)庫(kù)用于結(jié)直腸癌靶標(biāo)收集，數(shù)據(jù)納入關(guān)鍵詞為結(jié)直腸癌；String數(shù)據(jù)庫(kù)用于分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用（proteinprotein interaction，PPI），篩選分?jǐn)?shù)為0.850；Reactome 數(shù)據(jù)庫(kù)、Omicsbean數(shù)據(jù)庫(kù)和DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)用于進(jìn)行KEGG和GO（gene ontology）富集分析，納入標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05；Cytoscape 3.2.1 軟件用于四君子湯化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析。數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件信息見(jiàn)表1。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件信息

1.2 四君子湯化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析使用Venn 分析工具選取四君子湯與結(jié)直腸癌的共同靶標(biāo)。使用“Cytoscape 3.2.1”軟件構(gòu)建四君子湯治療結(jié)直腸癌的化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。使用“Cytoscape 3.2.1”軟件中的Network Analyzer 工具對(duì)該化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，導(dǎo)出并計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)的相關(guān)拓?fù)鋮?shù)，包括：節(jié)點(diǎn)度（degree）、介數(shù)中心性（betweenness centrality）、緊密中心性（closeness centrality）以及拓?fù)湎禂?shù)（topological coefficient）。依據(jù)SHI［14］等人的方法，使用Venn 分析工具選取并保留4種參數(shù)皆在前50%的節(jié)點(diǎn)。

1.3 四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及富集分析用“Cytoscape 3.2.1”軟件將“1.2”項(xiàng)中保留的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。將化合物所關(guān)聯(lián)的靶標(biāo)進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本體（gene Ontology，GO）富集分析。

1.4 四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中化合物貢獻(xiàn)分析在四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)中將不同化合物敲除，通過(guò)“Cytoscape 3.2.1”軟件中的“Network Analyzer”工具，使用LIU［15］等的方法對(duì)化合物敲除后的四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行魯棒性R 值分析。將化合物以魯棒性R 值排序，評(píng)估化合物在網(wǎng)絡(luò)中的貢獻(xiàn)程度以選取四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在關(guān)鍵化合物并分析四君子湯的潛在作用機(jī)制。

1.5 四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在關(guān)鍵化合物分析及通路比較將“1.4”項(xiàng)中得到的關(guān)鍵化合物所關(guān)聯(lián)的靶標(biāo)進(jìn)行KEGG 和GO 富集分析。將關(guān)鍵化合物的信號(hào)通路及生物功能與四君子湯的信號(hào)通路及生物功能進(jìn)行比較，分析預(yù)測(cè)四君子湯治療結(jié)、直腸癌的潛在關(guān)鍵化合物組合及四君子湯的潛在作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 化合物靶標(biāo)收集及四君子湯化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及Venn 分析工具，共搜集四君子湯中化合物217個(gè)、四君子湯化合物靶標(biāo)305個(gè)和結(jié)直腸癌靶標(biāo)1349 個(gè)。建立四君子湯化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包括四君子湯化合物119個(gè)、四君子湯與結(jié)直腸癌的共同靶標(biāo)156 個(gè)。該網(wǎng)絡(luò)含275 個(gè)節(jié)點(diǎn)與1716 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為12.85，其中化合物平均節(jié)點(diǎn)度為15.84，靶標(biāo)平均節(jié)點(diǎn)度為10.79。見(jiàn)圖1。

圖1 四君子湯化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

2.2 四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)如圖2A所示，使用Venn 分析工具對(duì)化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)度、介數(shù)中心性、緊密中心性及拓?fù)湎禂?shù)進(jìn)行分析，共保留4 種參數(shù)皆在前50% 的節(jié)點(diǎn)40 個(gè)。如圖2B 所示，建立四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包括四君子湯化合物7 個(gè)、核心靶標(biāo)33 個(gè)。該網(wǎng)絡(luò)含40 個(gè)節(jié)點(diǎn)與70 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為4.24，其中化合物平均節(jié)點(diǎn)度為10，靶標(biāo)平均節(jié)點(diǎn)度為2.69。七種化合物分別為高麗槐素、羅通定、山萘酚、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、豆甾醇與人參皂苷rh2。使用Omicsbean和DAVID工具對(duì)該網(wǎng)絡(luò)中的四君子湯治療結(jié)直腸癌核心靶標(biāo)進(jìn)行KEGG 及GO 的富集分析，保留排名前10 的條目，結(jié)果見(jiàn)圖3。四君子湯治療結(jié)直腸癌核心靶標(biāo)富集分析結(jié)果分為信號(hào)通路分析、生物進(jìn)程分析、分子功能分析與細(xì)胞組分分析，其中得到的主要信號(hào)通路有PI3K-Akt 信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路及VEGF 信號(hào)通路等；主要生物進(jìn)程有對(duì)含氧化合物的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的調(diào)控及對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)等；主要分子功能包括蛋白質(zhì)二聚化活性、酶結(jié)合與蛋白質(zhì)結(jié)合等；主要細(xì)胞組分有膜區(qū)響應(yīng)、神經(jīng)元投射及細(xì)胞投射等。

圖2 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析

2.3 四君子湯治療結(jié)直腸癌核心化合物分析使用魯棒性R值評(píng)價(jià)，敲除7種化合物對(duì)四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性的影響，并進(jìn)行排序，見(jiàn)表2。選取對(duì)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性影響較高的4 種化合物進(jìn)入后續(xù)分析，指示其對(duì)四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性貢獻(xiàn)最大。見(jiàn)圖3。4 種化合物為高麗槐素、羅通定、山萘酚和常春藤皂苷元。4 種化合物及其靶標(biāo)分別治療結(jié)直腸的化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4。

圖4 4種化合物治療結(jié)直腸癌的化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

表2 7種化合物對(duì)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性的影響

圖3 四君子湯治療結(jié)直腸癌核心靶標(biāo)富集分析結(jié)果

2.4 四君子湯治療結(jié)直腸癌的藥理機(jī)制預(yù)測(cè)4種化合物與四君子湯治療結(jié)直腸癌的共有信號(hào)通路、生物進(jìn)程、分子功能與細(xì)胞組分見(jiàn)圖5。主要共有信號(hào)通路包括PI3K-Akt 信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路及PPAR 信號(hào)通路；主要共有分子功能有藥物結(jié)合；主要細(xì)胞組分有質(zhì)膜區(qū)響應(yīng)與神經(jīng)元影響。4 種化合物與四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在信號(hào)傳導(dǎo)途徑與藥理機(jī)制預(yù)測(cè)見(jiàn)圖6。我們預(yù)測(cè)四君子湯及其核心化合物高麗槐素、羅通定、山萘酚與常春藤皂苷元能夠通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路及PPAR 信號(hào)通路影響生物體脂代謝、細(xì)胞生存、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡進(jìn)而參與結(jié)直腸癌的治療。

圖5 4種化合物與四君子湯治療結(jié)直腸癌的共同富集分析結(jié)果

圖6 4種化合物與四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在信號(hào)傳導(dǎo)途徑與藥理機(jī)制預(yù)測(cè)

3 討論

由于結(jié)直腸癌病理機(jī)制復(fù)雜且治療困難，針對(duì)結(jié)直腸癌的藥物開(kāi)發(fā)目前仍然未見(jiàn)突破［5］。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論注重整體理論，通過(guò)對(duì)多靶點(diǎn)的干預(yù)改善疾病的進(jìn)程，因此中醫(yī)藥在治療復(fù)雜疾病方面具有一定優(yōu)勢(shì)［16-17］。在藥物開(kāi)發(fā)中，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法能夠同時(shí)基于化學(xué)與生物信息對(duì)藥物與機(jī)體的互相作用進(jìn)行探討［18］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和中醫(yī)藥理論的整體觀(guān)念具有共同點(diǎn)，能夠系統(tǒng)地分析中藥復(fù)方改善復(fù)雜疾病中人體功能網(wǎng)絡(luò)失衡的作用機(jī)制［19］。近年來(lái)，中藥復(fù)方已經(jīng)越來(lái)越多地參與到結(jié)直腸癌的治療中［8-11］。

在本研究中，我們基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了四君子湯治療結(jié)直腸癌的藥理機(jī)制。評(píng)估節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)而衡量其在網(wǎng)絡(luò)中的重要性是常用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究手段［14］。通過(guò)建立四君子湯化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)并使用拓?fù)鋮?shù)篩選方法進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化，我們建立了四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包括7個(gè)化合物以及33個(gè)靶標(biāo)，7個(gè)化合物分別為高麗槐素、羅通定、山萘酚、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、豆甾醇與人參皂苷rh2，其中山萘酚被報(bào)道能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖與遷移［20］，常春藤皂苷元與豆甾醇能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［21-22］。使用富集分析工具發(fā)現(xiàn)四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在主要信號(hào)通路為PI3K-Akt 信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路及PPAR信號(hào)通路及VEGF信號(hào)通路等，其中PI3K-Akt信號(hào)通路與結(jié)直腸癌直接相關(guān)［23］，雌激素信號(hào)通路可以通過(guò)影響G 蛋白偶聯(lián)雌激素受體增加結(jié)直腸癌的增殖［24］，cGMP-PKG 信號(hào)通路與結(jié)直腸癌患者生存相關(guān)［25］，PPAR 信號(hào)通路能夠靶向FABP4 促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移［26］，VEGF 信號(hào)通路能夠直接影響結(jié)直腸癌的耐藥性［27］。該結(jié)果提示，在四君子湯中，7 種化合物可能通過(guò)影響以上信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌的治療產(chǎn)生影響。

魯棒性是指生物信息網(wǎng)絡(luò)在受到內(nèi)外干擾的情況下維持其網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性的能力，魯棒性越高表示網(wǎng)絡(luò)越穩(wěn)定［28］。在生物信息網(wǎng)絡(luò)中，通過(guò)加入或敲除靶標(biāo)引起的網(wǎng)絡(luò)擾動(dòng)已經(jīng)被認(rèn)為是探討靶標(biāo)重要性的關(guān)鍵。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性考察已經(jīng)是一種常用的研究方法［15，29］。在本研究中，我們將7 種化合物的關(guān)聯(lián)靶標(biāo)在四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分別敲除，進(jìn)而使用魯棒性評(píng)估7 種化合物對(duì)四君子湯化合物-靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)的貢獻(xiàn)大小。通過(guò)篩選，我們保留了高麗槐素、羅通定、山萘酚和常春藤皂苷元4 種化合物，提示這4 種化合物可能是四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在有效化合物。通過(guò)建立4 種化合物的網(wǎng)絡(luò)并與四君子湯治療結(jié)直腸癌進(jìn)行富集分析對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)4 種化合物與四君子湯治療結(jié)直腸癌的信號(hào)通路在PI3K-Akt 信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路及PPAR 信號(hào)通路上高度重合；同時(shí)，藥物結(jié)合、質(zhì)膜區(qū)響應(yīng)與神經(jīng)元影響等生物進(jìn)程、分子功能與細(xì)胞組分也被四君子湯和4 種化合物靶標(biāo)的共同富集，其中，藥物結(jié)合被報(bào)道與結(jié)直腸癌中藥物靶點(diǎn)直接相關(guān)［30］，腸神經(jīng)元在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［31］，質(zhì)膜區(qū)響應(yīng)與結(jié)腸直腸腺瘤檢測(cè)有關(guān)［32］。該結(jié)果提示PI3K-Akt 信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路及PPAR 信號(hào)通路可能是四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在作用機(jī)制；藥物結(jié)合、質(zhì)膜區(qū)響應(yīng)與腸神經(jīng)元影響可能是四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。

在癌癥治療中，化合物對(duì)信號(hào)通路以及物質(zhì)基礎(chǔ)的影響最終會(huì)影響生物功能及進(jìn)程［33］。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，通過(guò)建立化合物-靶標(biāo)作用網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)行化合物潛在作用機(jī)制的預(yù)測(cè)［34］。在本研究中，我們對(duì)四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行了預(yù)測(cè)。PPAR 信號(hào)通路能夠影響機(jī)體的脂代謝［35］與細(xì)胞生存［36］；PI3K-Akt 信號(hào)通路直接參與生物體內(nèi)的脂代謝［37］、細(xì)胞生存［38］、細(xì)胞周期［39］及細(xì)胞凋亡［40］；cGMP-PKG 信號(hào)通路則與細(xì)胞的增殖以及凋亡密切相關(guān)［41］；同時(shí)，藥物結(jié)合能夠影響腫瘤細(xì)胞凋亡［42］，質(zhì)膜區(qū)響應(yīng)是細(xì)胞周期改變中的重要環(huán)節(jié)［43］，腸神經(jīng)元改變通過(guò)影響細(xì)胞周期與凋亡進(jìn)程促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［31］。本研究中，我們預(yù)測(cè)中藥復(fù)方四君子湯中的高麗槐素、羅通定、山萘酚和常春藤皂苷元可能通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt、cGMP-PKG與PPAR信號(hào)通路以及藥物結(jié)合、質(zhì)膜區(qū)響應(yīng)與神經(jīng)元影響等生物功能進(jìn)而影響機(jī)體內(nèi)的脂代謝、細(xì)胞生存、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡進(jìn)程，從而發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌的治療作用；其中，山萘酚并未影響cGMP-PKG 信號(hào)通路。該結(jié)果提示四君子湯以及其中的化合物高麗槐素、羅通定、山萘酚和常春藤皂苷元能夠多靶點(diǎn)多通路地通過(guò)協(xié)同作用影響結(jié)直腸癌治療；四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在作用機(jī)制與調(diào)控PI3KAkt、cGMP-PKG 與PPAR 信號(hào)通路并影響下游生物功能密切相關(guān)。

在本研究中，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，我們預(yù)測(cè)四君子湯治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制可能主要集中在7 種化合物與33 個(gè)靶標(biāo)上；高麗槐素、羅通定、山萘酚和常春藤皂苷元可能是四君子湯治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵化合物；四君子湯治療結(jié)直腸癌的潛在作用機(jī)制與調(diào)控PI3K-Akt、cGMP-PKG和PPAR信號(hào)通路以及藥物結(jié)合、質(zhì)膜區(qū)響應(yīng)和腸神經(jīng)元進(jìn)而影響脂代謝、細(xì)胞生存、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡有關(guān)。該研究能夠?yàn)樗木訙纳平Y(jié)直腸癌的臨床治療及藥物開(kāi)發(fā)提供思路與物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，四君子湯治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制仍未徹底明晰。在未來(lái)的研究中，我們將使用體內(nèi)外藥理學(xué)驗(yàn)證的方法，對(duì)本研究中的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證并考察4 種化合物在結(jié)直腸癌治療中的協(xié)同作用。