單曉英，張祥華，王 巖

莒縣中醫(yī)醫(yī)院，山東 莒縣 276500

白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是兒童最常見的癌癥之一，約占兒童癌癥病例總數(shù)的25%～35%［1］。急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）作為AML 的亞型之一，其特征在于染色體15和17之間的相互平衡易位，將早幼粒細(xì)胞白血病（promyelocytic leukemia，PML）基因與維甲酸受體（retinoic acid receptor α，RARα）基因融合并導(dǎo)致白血病表型［2-3］。自全反式維甲酸和三氧化二砷被引入APL的治療以來，患兒的總生存率有了顯著提升，然而，對(duì)這兩種藥物耐藥的復(fù)發(fā)/難治性患兒的治療仍是臨床上有待解決的難題［2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一組堿基數(shù)超過200 且與白血病關(guān)系密切的非編碼RNA，它們通過與蛋白質(zhì)、miRNA 或基因組DNA 相互作用而介導(dǎo)白血病細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲等［3］。其中，H19 已被證實(shí)能夠有效預(yù)測(cè)AML 預(yù)后，是潛在的白血病治療靶點(diǎn)［4］。冬凌草甲素（Oridonin）是一種從唇形香茶屬植物冬凌草中提取的四環(huán)二萜類化合物，在多種白血病細(xì)胞中表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性等活性［5-7］。但小劑量冬凌草甲素在干預(yù)APL 中的效果有限且機(jī)制尚未完全闡明，故本研究擬探討沉默LncRNA-H19 聯(lián)合小劑量冬凌草甲素對(duì)APL 細(xì)胞NB4 增殖和凋亡的影響并分析其可能機(jī)制，以期為APL 的藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；冬凌草甲素（純度＞98%，北京環(huán)宇生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20180726，用二甲基亞砜配制成10 mmol/L 母溶液）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：1635367）；羅斯韋爾公園紀(jì)念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)：8118352）；Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：1864617）；Trizol（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：501751108）；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain Reaction，RT-PCR）試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)：1908366）；Annexin V 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD 公司，批號(hào)：9009901；碘化丙錠染料（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：1696417）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）、細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：113119201486）；放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：272631736124）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：001203766845）。

1.2 主要儀器電子天平［瑞士梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）有限公司］；恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Forma 公司）；Milli-Q Plus 純水器（法國(guó)Millipore 公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Backman 公司）；Real-time PCR 分析儀（美國(guó)ABI公司）；電泳儀（美國(guó)BioRad公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組將NB4 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：5%CO2、37℃、飽和濕度。每天換液1 次，每2 天傳代1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為對(duì)照組（未經(jīng)任何處理）、LncRNA-H19 siRNA 組（沉默LncRNA-H19）、冬凌草甲素組（用5 μmol/L冬凌草甲素處理）、聯(lián)合干預(yù)組（轉(zhuǎn)染LncRNA-H19 siRNA后，用5 μmol/L冬凌草甲素處理）。

1.3.2 轉(zhuǎn)染采用Lipofectmine 2000將LncRNAH19 siRNA 轉(zhuǎn)染至NB4 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h 后換新鮮的RPMI-1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，直至48 h 收取細(xì)胞，提取RNA測(cè)定LncRNA-H19表達(dá)情況。

1.3.3 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中LncRNA-H19表達(dá)用Trizol 試劑提取細(xì)胞中的總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再用cDNA 作為模板合成擴(kuò)增目的基因，采用β-actin 作為內(nèi)參照基因。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)。LncRNA-H19 基因的上游引物序列為：5′-CTACAGCTTACTTCAAGGCCAG-3′；下游引物序列為5′-TCAGAGACAGTCAAGCGGTAT-3′。β-actin 的上游引物序列為：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′；下游引物序列為5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。

1.3.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常細(xì)胞或LncRNA-H19 siRNA 細(xì)胞，接種于96 孔板上，密度6×103個(gè)細(xì)胞/孔。各組分別采用相應(yīng)的干預(yù)措施，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h。在0、24、48、72和96 h，每孔加入10 μL的CCK8 溶液，于37℃持續(xù)孵育2 h，再用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常細(xì)胞或LncRNA-H19 siRNA 細(xì)胞，接種于6 孔板上，密度為5×105個(gè)細(xì)胞/孔。各組分別采用相應(yīng)的干預(yù)措施，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，以1500 r/min 離心5 min，棄上清液，用PBS 漂洗3 次，棄上清液。再將細(xì)胞重懸浮于200 μL 的Bingding Buffer，并分別加入10 μL 的Annexin V-FITC 和5 μL 的碘化丙錠染料，混勻，于25℃避光反應(yīng)15 min。最后加入300 μL 的Bingding Buffer，1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.6 Western Blot 法檢測(cè)細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)水平取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞并接種于6 孔板上，密度為5×105個(gè)細(xì)胞/孔。各組分別采用相應(yīng)的干預(yù)措施，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用RIPA裂解液處理細(xì)胞，并采用BCA法定量總蛋白濃度。以每孔30 μg 上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF 膜，用5% 脫脂奶粉封閉液于25℃封閉1 h 后分別加入兔抗人β-catenin（1∶2000）、兔抗人Cyclin D1（1∶2000）、兔抗人兔抗人C-myc（1∶2000）、兔抗人PI3K（1∶2000）、兔抗人AKT（1∶2000）單克隆抗體，于4℃孵育過夜。用TBST 漂洗3 次后，加入辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔IgG，于37℃孵育30 min，用ECL發(fā)光劑顯影。采用Quantity One 軟件分析條帶灰度值，選擇β-actin作為上樣內(nèi)參。

目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用One-Way ANOVA 分析，兩組間比較采用LSD 分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素對(duì)NB4 細(xì)胞中LncRNA-H19 表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，LncRNA-H19 siRNA 組和聯(lián)合干預(yù)組NB4 細(xì)胞中LncRNA-H19 表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；冬凌草甲素組NB4 細(xì)胞中LncRNA-H19表達(dá)量無明顯變化（P＞0.05）。見圖1。

圖1 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對(duì)NB4細(xì)胞中LncRNA-H19表達(dá)的影響

2.2 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素對(duì)NB4 細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組比較，LncRNA-H19 siRNA組和聯(lián)合干預(yù)組24、48、72 和96 h 以及冬凌草甲素組48、72 和96 h 的細(xì)胞增殖抑制率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于LncRNA-H19 siRNA組和冬凌草甲素組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對(duì)NB4細(xì)胞增殖的影響

2.3 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素對(duì)NB4 細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較，LncRNA-H19 siRNA組、冬凌草甲素組和聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞凋亡率明顯高于LncRNA-H19 siRNA組和冬凌草甲素組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的影響

2.4 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素對(duì)NB4 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，LncRNA-H19 siRNA 組和聯(lián)合干預(yù)組NB4 細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1、C-myc、PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；冬凌草甲素組NB4細(xì)胞中僅有PI3K蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)率明顯低于LncRNA-H19 siRNA組和冬凌草甲素組。見圖4—8。

圖4 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對(duì)NB4細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)的影響

圖5 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對(duì)NB4細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

圖6 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對(duì)NB4細(xì)胞中C-myc蛋白表達(dá)的影響

圖7 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對(duì)NB4細(xì)胞中PI3K蛋白表達(dá)的影響

圖8 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對(duì)NB4細(xì)胞中AKT蛋白表達(dá)的影響

3 討論

APL 是一種以骨髓中早幼粒細(xì)胞增多為特點(diǎn)的髓系白血?。?］。雖然砷劑的應(yīng)用能夠有效提高APL 的治愈率，但其作為一種毒性物質(zhì)，短期可引起胃腸道反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和肝臟損傷，在患兒中的長(zhǎng)期安全性也有待考證［9］。

冬凌草甲素是冬凌草最重要的活性成分，既往研究表明其具有一定的抗白血病作用，已明確的作用機(jī)制包括調(diào)控轉(zhuǎn)移、凋亡相關(guān)蛋白MMP、Bax、Bcl-2表達(dá)［7］、增加細(xì)胞活性氧水平進(jìn)而穩(wěn)定RARα蛋白［10］、觸發(fā)伴侶蛋白介導(dǎo)的白血病BCR-ABL蛋白酶體降解［5］、激活NF-κB、mTOR/P70、RAF/ERK、STAT5 信號(hào)通路等［11］。冬凌草甲素的抗腫瘤效應(yīng)呈劑量和時(shí)間依賴性。張曉芬等［12］報(bào)道1、2、4 μg/mL冬凌草甲素對(duì)急性T淋巴細(xì)胞白血病jurkat細(xì)胞增殖的抑制率分別為10.80%、32.32%、42.27%，本研究結(jié)果也顯示用5 μmol/L 冬凌草甲素干預(yù)24、48、72 和96 h 后對(duì)NB4 細(xì)胞的抑制率僅為6.63%、11.72%、18.09和25.38%，抑制率偏低。

LncRNA-H19 位于人染色體p15.5，是首個(gè)被鑒定的印記LncRNA，具有高度保守性，出生后除骨骼肌和心臟外，在其他組織中幾乎無表達(dá)，但在應(yīng)激狀態(tài)或腫瘤發(fā)生時(shí)重新啟動(dòng)表達(dá)［13］。在AML細(xì)胞系HL-60、THP-1 和U937 中，LncRNA-H19 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡［14］。然而，LncRNA-H19 對(duì)APL 細(xì)胞的影響未見相關(guān)報(bào)道，其在白血病中的作用機(jī)制仍未完全明確。在本研究中，與對(duì)照組NB4細(xì)胞比較，LncRNA-H19沉默組細(xì)胞中的LncRNA-H19 表達(dá)明顯降低，細(xì)胞增殖率明顯降低，凋亡率明顯增加，提示沉默LncRNA-H19具有抑制APL 發(fā)生發(fā)展的作用。聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率高于LncRNA-H19 siRNA組合冬凌草甲素組，說明沉默LncRNA-H19 聯(lián)合冬凌草甲素能夠有效抑制APL細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞增殖和凋亡受到多種腫瘤相關(guān)因子的調(diào)控。Wnt/β-catenin是介導(dǎo)腫瘤形成的關(guān)鍵通路，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，β-catenin 磷酸化降解受阻，在細(xì)胞質(zhì)中大量蓄積并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，其與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游的cyclin D1、C-myc等效應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)細(xì)胞異常增殖和凋亡抵抗，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［15］。Cyclin D1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因，在細(xì)胞周期進(jìn)程中呈周期性變化，通過與其他蛋白相互作用而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖［16］。C-myc作為致癌基因，是決定細(xì)胞由GO/G1進(jìn)入S期的“開關(guān)”，其編碼的蛋白與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。C-myc 在血液腫瘤中高表達(dá)并與高增殖率、侵襲性表型、耐藥以及不良預(yù)后相關(guān)［17］。PI3K/AKT信號(hào)通路通過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)下游相關(guān)蛋白的活化過程，介導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡，研究表明在白血病中存在該通路的異常激活，是抗白血病治療的靶點(diǎn)之一［18-20］。在本研究中，LncRNA-H19 siRNA 組和聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1、C-myc、PI3K 和AKT蛋白表達(dá)量以及冬凌草甲素組細(xì)胞中PI3K蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，而聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞中的以上蛋白表達(dá)量又低于LncRNA-H19 siRNA組或冬凌草甲素組，說明沉默LncRNA-H19 聯(lián)合冬凌草甲素通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路及其下游因子Cyclin D1、C-myc以及PI3K/AKT信號(hào)通路抑制APL進(jìn)展，且效果優(yōu)于LncRNA-H19 或冬凌草甲素單一干預(yù)法，尤其是明顯優(yōu)于低劑量冬凌草甲素。