黃聰琳，王曉琳，，郭 敏，，趙曉麗，，姜 華

1 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省中醫(yī)藥研究院

鐮形棘豆Oxytropis falcate Bunge，藏藥名為“莪達(dá)夏”，作為藥材被收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（藏藥）》第一冊，系豆科棘豆屬多年生草本植物，主產(chǎn)于青海、甘肅、四川等省份。全草入藥，其味辛、性寒，有小毒，入肺、脾二經(jīng)，具有清熱解毒、生肌愈瘡、澀脈止血等功效［1］。類黃酮，即黃酮類化合物，作為鐮形棘豆的主要藥效活性物質(zhì)之一，具有良好的抑菌［2］、抗炎［3-4］、免疫調(diào)節(jié)［5-6］等作用。提高黃酮類化合物的含量，對提升鐮形棘豆藥材質(zhì)量、藥用價值意義重大。

黃酮類化合物是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，在植物生長發(fā)育以及抵抗逆境脅迫的過程中合成積累，并發(fā)揮重要的生理作用［7］。其合成代謝是植物中廣泛存在的生物化學(xué)途徑，受到UVB輻射、水分、溫度等多種環(huán)境因子誘導(dǎo)［8-9］。本研究通過對鐮形棘豆幼苗進(jìn)行不同強(qiáng)度的UVB 輻射處理，分析鐮形棘豆黃酮類化合物的含量，以及黃酮合成關(guān)鍵酶的活性，以期確定UVB 對藏藥鐮形棘豆黃酮類化合物積累的影響，為定向調(diào)控鐮形棘豆黃酮生物合成提供理論依據(jù)，為從藥用植物次生代謝產(chǎn)物積累角度闡釋藥材道地性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料以鐮形棘豆人工培養(yǎng)植株為試驗材料。鐮形棘豆成熟種子購自奇正藏藥股份有限公司，系甘南藏族自治州合作地區(qū)鐮形棘豆藥材中收集。鐮形棘豆植株于人工氣候室培養(yǎng)，控制溫度16±1℃，光照周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 UV-B 脅迫處理選取生長良好、長勢一致的鐮形棘豆30 天幼苗進(jìn)行UV-B 輻射處理：每天UVB 紫外線照射6 h 處理。紫外燈管為國產(chǎn)，發(fā)射光譜區(qū)域為280～390 nm。將UVB 燈管架于培養(yǎng)材料上方，通過調(diào)節(jié)距離幼苗高度實(shí)現(xiàn)不同輻射強(qiáng)度的設(shè)置，以UVB強(qiáng)度計測定。試驗設(shè)置低輻照強(qiáng)度Q1（約2.0 W/m2）和高輻照強(qiáng)度Q2（約3.0 W/m2）處理，CK 為無UVB 輻射的正常對照組。處理0、1、2、3、5、7 天后于每天同一時間采樣，將幼苗連根鏟出，剪去地下部分，稱取新鮮質(zhì)量，迅速保存于-20℃冰箱中，備用。

1.3 儀器與試劑Waters e2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；紫外輻射計（臺灣tenmars公司）；島津UV-1800 紫外分光光度計（日本島津公司）；CP225D 分析天平（德國Sartorius 公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma 公司）等。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所），鼠李檸檬素對照品由甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所制備［10］。高效液相色譜試驗（high performance liquid chromatography，HPLC）試驗用甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 黃酮供試品溶液的制備分別稱取UVB 處理0、1、2、3、5、7天的鐮形棘豆植株地上部分1.0 g，于研缽中研磨后，置50 mL圓底燒瓶中，加20 mL甲醇，加熱回流提取2 h，濾過，濾液補(bǔ)足體積至20 mL，蒸干，殘渣用10 mL 甲醇溶解后，加入0.6 mL 濃鹽酸，水浴回流1 h，濾過，濾液補(bǔ)足體積至10 mL，作為鐮形棘豆供試品溶液。

2.2 總黃酮含量的測定

2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品7.50 mg 置于50 mL 容量瓶中，加入80% 甲醇20 mL，于30℃水浴鍋中加熱使之溶解，放冷，用80% 甲醇定容至刻度，搖勻，即得0.15 mg/mL的蘆丁對照品溶液。精密量取0、1、0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，分別加入6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0 mL 去離子水；各加5% 亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，再加去離子水定容至25 mL，搖勻，放置15 min。第一份作為空白，在最大吸收波長510 nm 處用紫外分光光度計測定吸光度。以蘆丁對照品的濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光值A(chǔ) 值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程。得到的線性回歸方程為：Y=0.5129X-0.0038，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。

2.2.2 樣品測定取1.0 mL 黃酮供試品溶液至25 mL 容量瓶，加5.0 mL 去離子水，加5% 亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加10% 硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加4% 氫氧化鈉溶液10.0 mL，再加去離子水定容至25 mL，搖勻，放置15 min。在510 nm 波長下用紫外分光光度計測定吸光值。分別記錄數(shù)據(jù)，帶入求得的線性方程中，計算得出黃酮供試品溶液中總黃酮含量。

2.3 鼠李檸檬素含量測定[10]

2.3.1 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的鼠李檸檬素對照品15.0 mg，80% 甲醇超聲溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的對照品溶液。

2.3.2 色譜條件色譜柱為資生堂CAPCELL PAK C18-MGⅡ（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.4%磷酸水溶液-甲醇（30∶70），流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL，檢測波長為266 nm。在此色譜條件下，樣品分離良好，鼠李檸檬素色譜保留時間tR=11.2 min。

2.3.3 線性關(guān)系考察分別吸取對照品溶液適量，稀釋，得系列質(zhì)量濃度的對照品溶液。精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.3.2”項色譜條件進(jìn)行測定。以對照品質(zhì)量濃度（ug/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸處理，得鼠李檸檬素回歸方程為：Y=28644.1X+551086.0，R2=0.9981，進(jìn)樣質(zhì)量濃度37.5～150 μg/m，L 與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 鐮形棘豆黃酮合成關(guān)鍵酶活性測定

2.4.1 粗酶液制備取冷凍的鐮形棘豆樣品，按照固液比1∶4加入預(yù)冷的0.05 M Tris-HCl提取緩沖液（pH 8.0，內(nèi)含20 mM β-巰基乙醇，2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP 和100 μM 碘乙酸），加入少量石英砂，冰浴研磨至勻漿。4℃12 000×g離心15 min，取上清液，作為PAL（摘要處已添加）、CHS（摘要處已添加）、CHI（摘要處已添加）酶活測定的粗酶提取液。蛋白質(zhì)含量按Bradford方法測定。

2.4.2 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）的活性測定反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為1.5 mL，分別為：0.05 M Tris-HCl（pH8.0）850 μL，粗酶液0.5 mL，20 mL-苯丙氨酸150 μL，對照不加L-苯丙氨酸。35℃下反應(yīng)1 h后，在290 nm處測吸光值。以每小時在290 nm 處吸光度變化0.01 為一個酶活力單位，結(jié)果以U/g 新鮮質(zhì)量表示。

式中：?A 為1h 內(nèi)吸光度的差值，V總為酶液總體積（mL），V測為測定時的酶液用量（mL），F(xiàn)W 為樣品新鮮質(zhì)量（g）。

2.4.3 查爾酮合酶（chalcone synthase，CHS）和查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）的活性測定取CHS和CHI酶活測定試劑盒，按照試劑盒說明書的方法步驟進(jìn)行測定。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品CHS和CHI活性。

3 結(jié)果

3.1 鐮形棘豆黃酮類化合物含量測定通過對鐮形棘豆幼苗黃酮類化合物含量進(jìn)行動態(tài)測定，可以看出鐮形棘豆總黃酮含量在UVB 輻照處理后顯著增加，見圖1。低輻照強(qiáng)度Q1處理下，總黃酮含量增長較為平緩；高輻照強(qiáng)度Q2處理下，總黃酮含量增長幅度較大。表明UVB 輻射有提高總黃酮含量的效果。

通過對鐮形棘豆幼苗鼠李檸檬素含量的動態(tài)測定。鼠李檸檬素含量的增長趨勢與總黃酮含量的增長趨勢基本一致，兩種強(qiáng)度的UVB 輻射，均能夠提高鐮形棘豆幼苗中鼠李檸檬素的含量。見圖1。

圖1 UVB處理對鐮形棘豆黃酮類化合物積累的影響

3.2 鐮形棘豆黃酮類化合物合成相關(guān)酶活的測定Q1處理下的PAL酶活高于對照組，呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢，PAL酶活最高值出現(xiàn)在UVB輻射處理第3 天，酶活達(dá)到對照組的2.18 倍，處理第5 天有小幅度降低。Q2處理下的PAL酶活在UVB輻射1天出現(xiàn)小幅降低后增長，自UVB 輻射處理第3 天開始，PAL酶活開始高于對照組，并迅速于第5天達(dá)到最高值，為對照組的1.77倍。試驗表明，UVB輻射可以提高鐮形棘豆幼苗PAL的活性。見圖2。

圖2 UVB處理對鐮形棘豆苯丙氨酸解氨酶活性的影響

由鐮形棘豆幼苗CHS 的活性動態(tài)變化可以看出，Q1處理下的CHS 活性歷經(jīng)先增長后降低的過程，但是與對照組相比，仍然高于對照組。UVB 輻射處理第3 天CHS 活性最高，達(dá)到對照組的1.90倍。Q2處理下，CHS活性同樣經(jīng)歷先增長后降低的過程，但在UVB 輻射第3 天以后，CHS 活性均低于對照組。試驗表明，UVB 輻射可以提高鐮形棘豆幼苗CHS 的活性，Q1處理的CHS 活性升高效果高于Q2處理的。見圖3。

圖3 UVB處理對鐮形棘豆查爾酮合酶活性的影響

UVB 輻射對鐮形棘豆幼苗CHI 的影響見圖4。結(jié)果顯示，Q1處理下，CHI酶活呈現(xiàn)先升后降，而后再上升的趨勢，UVB處理第3、5天，CHI活性低于對照組。上升過程中，CHI 酶活最高達(dá)到對照組的1.11 倍。Q2處理下，CHI 酶活同樣呈現(xiàn)先升后降，而后再上升的趨勢，與Q1處理不同的是，除第1 天CHI活性高于對照組，為對照組的1.04倍以外，其他處理時間下，CHI活性均低于對照組。

圖4 UVB處理對鐮形棘豆查爾酮異構(gòu)酶活性的影響

4 討論

黃酮類化合物作為植物類重要的次生代謝產(chǎn)物，在植物生長發(fā)育的過程中，受到多種環(huán)境因素的影響。UVB 輻射對植物黃酮類化合物含量的調(diào)節(jié)作用在之前的研究中已經(jīng)有報道。例如，UVB輻照能夠增加大豆芽苗類黃酮含量的增長［11］，持續(xù)的UVB 輻射誘導(dǎo)致使馬鈴薯類黃酮含量不斷增加［12］，隨著外加UVB 輻射強(qiáng)度增加，鳳仙花總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨之增加［13］。黃酮類化合物是藏藥鐮形棘豆重要的活性部位，因此黃酮含量是衡量鐮形棘豆藥材品質(zhì)的特征之一，鼠李檸檬素是鐮形棘豆黃酮類化合物中含量較高的一類。本試驗結(jié)果表明，鐮形棘豆幼苗在受到外源的UVB 輻射后，隨著UVB 輻射時間的延長，總黃酮含量與鼠李檸檬素的含量不斷增加，UVB 輻射可以提高鐮形棘豆的藥效成分含量。

UVB 輻射能夠增加鐮形棘豆類黃酮的含量，黃酮類化合物種類眾多，與此對應(yīng)的生物合成途徑與參與的酶類眾多。植物類黃酮的生物合成起始于苯丙烷代謝途徑，苯丙氨酸解氨酶PAL 將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為合成黃酮的重要底物4-香豆酰-CoA。4-香豆酰-CoA在查爾酮合酶CHS的作用下，與3 分子丙二酰-CoA 結(jié)合生成查爾酮，由此將合成途徑引向類黃酮的生物合成［14］。PAL 和CHS 是黃酮類化合物生物合成起始的關(guān)鍵酶，CHI 催化查爾酮，使之進(jìn)入黃酮合成途徑的一個分支，我們因此觀察測定了PAL、CHS 和CHI 的活性變化。實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)UVB 可以較顯著地增強(qiáng)PAL、CHS 的活性，說明UVB 可以有效地促進(jìn)苯丙烷代謝途徑向生成黃酮類化合物的生物途徑轉(zhuǎn)化。UVB 對CHI活性影響不明顯，說明UVB對由CHI參與合成的這一類黃酮的促進(jìn)作用不顯著，而結(jié)合UVB 可以增強(qiáng)鼠李檸檬素含量的結(jié)果，也可以間接地說明鼠李檸檬素并不是出自CHI的這一分支。

與此同時，我們發(fā)現(xiàn)不同劑量的UVB 輻射對上述三種酶的影響不同。低劑量的UVB 輻射對提高黃酮合成相關(guān)酶PAL、CHS 及CHI 的活性效果優(yōu)于高劑量的UVB 輻射。高劑量的UVB 在輻射前期可增強(qiáng)CHS 及CHI 的活性，而在輻射后期，CHS 及CHI 活性反倒降低，低于對照組。在植株性狀上，高劑量的UVB 輻射后期，鐮形棘豆植株的莖、葉片出現(xiàn)顏色加深、略微變得干硬。我們推測高劑量的UVB 長時間輻射可能導(dǎo)致葉片的次生代謝組織受到破壞，導(dǎo)致類黃酮合成相關(guān)酶的活性受到抑制，CHI對UVB造成的輻射傷害更為敏感。

本試驗表明，UVB 輻射對鐮形棘豆類黃酮物質(zhì)的積累有明顯的促進(jìn)作用。UVB 輻射下，類黃酮物質(zhì)含量增高，也是植物應(yīng)對避免或減輕UVB輻射造成傷害的一種保護(hù)性反應(yīng)。低劑量的UVB能夠刺激鐮形棘豆黃酮合成相關(guān)酶的活性升高，促進(jìn)類黃酮的生物合成。然而，高劑量的UVB 長期輻射可能對鐮形棘豆幼苗造成不可修復(fù)的損傷，不利于類黃酮的積累。本試驗探討UVB 這一西北重要環(huán)境因子對鐮形棘豆藥效物質(zhì)積累的影響，豐富了藥用植物次生代謝積累對藥材道地性形成的認(rèn)識，為定向調(diào)控提高鐮形棘豆類黃酮含量提供理論依據(jù)。為鐮形棘豆黃酮合成相關(guān)酶功能的進(jìn)一步研究及類黃酮生物合成途徑的解析提供了基礎(chǔ)。