王 韜，費建東，聶雙發(fā)，李 磊

河北北方學院附屬第一醫(yī)院胃腸外科，河北 張家口 075000

結(jié)腸癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢［1］，嚴重威脅人類生命健康。結(jié)腸癌早期不易發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已到晚期，失去最佳治療時機，因此急需提高結(jié)腸癌的診治水平，此外結(jié)腸癌的發(fā)展是個漸進的過程，重點應(yīng)放在腫瘤的基因干預方面。Hh 信號通路在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。薏苡仁油是從中藥薏苡仁中提取的脂質(zhì)成份，其對多種惡性腫瘤細胞的生長具有抑制作用，還可以促進細胞凋亡。本研究探討薏苡仁油對人結(jié)腸癌HT-29 細胞增殖、凋亡的影響，同時從Hh 信號通路的角度探討薏苡仁油對人結(jié)腸癌HT-29細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人結(jié)腸癌HT-29 細胞株（中國科學院上海細胞庫）；薏苡仁油（浙江康萊特藥業(yè)有限公司，批號：120201）；DMEM 高糖培養(yǎng)液、胎牛血 清（ 美 國Hyclone 公 司，批 號：SH30081.01，SV30087.02）；四甲基偶氮唑藍（MTT）干粉（美國Amresco 公司，批號：0793）；PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）；兔抗人抗體及羊抗兔Ⅱ抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號：10CM199）；細胞凋亡DAPI 染色劑試劑盒、Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）雙染凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：KGA251，KGA107）；trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DreamTaq Green PCR Master Mix（美國Thermo Fisher公司，批號：15596-0018、K1621、K1081）。

1.2 細胞培養(yǎng)HT-29 細胞于含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，溫度37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。常規(guī)胰酶消化接種于96 孔板，每孔4×103個細胞，培養(yǎng)24 h，使細胞同步化。將生長良好的HT-29 細胞分成6 組，觀察組分別用薏苡仁油10、20、40、80、160 μL/mL 不同濃度培養(yǎng)72 h，對照組用空白培養(yǎng)基（不含薏苡仁油）培養(yǎng)72 h。

1.3 觀察指標

1.3.1 MTT 法檢測HT-29 細胞增殖每孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h，去原培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩混勻，室溫放置10 min，于全自動酶標儀570 nm 測定各組吸光度值（A），并按公式計算增殖抑制率。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測HT-29 細胞凋亡按“1.2”項下常規(guī)培養(yǎng)HT-29 細胞并干預，用胰酶消化細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞2 次。棄去PBS 洗滌液，加入Binding Buffer 100 μL使細胞呈懸浮狀態(tài)，后加入Annexin V-FITC 5 μL 混勻后，再加入Propidium Iodide 5 μL，輕搖混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，再加入Binding Buffer 400 μL混勻后，用流式細胞儀進行檢測，實驗重復3次。

1.3.3 q-PCR 檢測Ptch、Smo、Shh 和Gli-1 mRNA表達將觀察組和對照組培養(yǎng)72 h 后的結(jié)腸癌HT-29 細胞，用trizol 法提取各組RNA，進行RNA濃度及純度檢測。FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA。按照SuperReal 熒光定量預混試劑增強版加入試劑后，進行PCR 擴增?；蛞锇幢?，以GAPDH 為內(nèi)參照物，應(yīng)用ImageJ 軟件進行灰度值分析。

表1 q-PCR各引物序列

1.3.4 蛋白印跡法檢測CyclinD1、p21、Caspase-3、Bcl-2、Ptch、Smo、Shh 和Gli-1 蛋白的表達 按試劑盒說明書操作，用蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑提取各組HT-29 細胞中的總蛋白，進行定量及變性后采用Western blot 檢測各組細胞中CyclinD1、p21、Caspase-3、Bcl-2、Ptch、Smo、Shh 和Gli-1 蛋白濃度，保存于-78℃，最后在凝膠成像分析系統(tǒng)上曝光、拍照，進行數(shù)據(jù)分析和處理。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，多組間比較采用方差分析，采用SNK-q 法對各組間指標進行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖抑制率空白組，薏苡仁油10、20、40、80、160 μL/mL 各濃度組對人結(jié)腸癌HT-29細胞增殖抑制率經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步采用SNK-q 檢驗對各組間HT-29 細胞增殖抑制率進行兩兩比較。結(jié)果顯示，各濃度水平組HT-29 細胞增殖抑制率差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。隨著薏苡仁油濃度的增加，抑制率表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。見表2。

表2 各組細胞增殖抑制率比較（±s）

表2 各組細胞增殖抑制率比較（±s）

注：a表示與薏苡仁油10 μL/mL組比較，P＜0.05；b表示與薏苡仁油20 μL/mL組比較，P＜0.05；c表示與薏苡仁油40 μL/mL組比較，P＜0.05；d表示與薏苡仁油80 μL/mL組比較，P＜0.05

組別薏苡仁油10 μL/mL組薏苡仁油20 μL/mL組薏苡仁油40 μL/mL組薏苡仁油80 μL/mL組薏苡仁油160 μL/mL組FP樣本量16 16 16 16 16 HT-29細胞增殖抑制率（%）10.23±1.72 15.34±1.52a 29.41±3.13ab 42.23±4.72abc 60.23±5.72abcd 473.426＜0.001

2.2 細胞凋亡率空白組，薏苡仁油10、20、40、80、160μl/mL 各濃度組的HT-29 細胞凋亡率經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步采用SNK-q檢驗對各組間HT-29細胞凋亡率進行兩兩比較結(jié)果顯示，各濃度水平組HT-29細胞凋亡率差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。隨著薏苡仁油濃度的增加，HT-29 細胞凋亡率表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。見表3。

表3 各組HT-29細胞凋亡率比較（±s）

表3 各組HT-29細胞凋亡率比較（±s）

注：a表示與空白組比較，P＜0.05；b表示與薏苡仁油10 μL/mL組比較，P＜0.05；c表示與薏苡仁油20 μL/mL組比較，P＜0.05；d表示與薏苡仁油40 μL/mL組比較，P＜0.05；e表示與薏苡仁油80 μL/mL組比較，P＜0.05

組別空白組薏苡仁油10 μL/mL組薏苡仁油20 μL/mL組薏苡仁油40 μL/mL組薏苡仁油80 μL/mL組薏苡仁油160 μL/mL組FP樣本量16 16 16 16 16 16 HT-29細胞凋亡率（%）4.23±1.72 8.33±2.62a 15.48±3.82ab 21.41±4.13abc 30.33±6.62abcd 42.48±8.82abcde 119.906＜0.001

2.3 Ptch、Smo、Shh 和Gli-1 mRNA 表達空白組，薏苡仁油10、20、40、80、160 μL/mL 各濃度組培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT-29 細胞，Hh 信號通路相關(guān)因子Ptch、Smo、Shh和Gli-1的mRNA相對表達量經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步采用SNK-q檢驗對各組間上述Hh信號通路相關(guān)因子相對表達量進行兩兩比較結(jié)果顯示，各濃度水平組上述Hh 信號通路相關(guān)因子相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。薏苡仁油濃度為10、20、40、80、160 μL/mL時上述Hh信號通路相關(guān)因子相對表達量均比空白組明顯下降，并隨薏苡仁油濃度升高，上述指標的相對表達量逐漸降低。見表4。

表4 各組Ptch、Smo、Shh和Gli-1 mRNA表達比較（±s）

表4 各組Ptch、Smo、Shh和Gli-1 mRNA表達比較（±s）

注：a 表示與空白組比較，P＜0.05；b 表示與薏苡仁油10 μL/mL 組比較，P＜0.05；c 表示與薏苡仁油20 μL/mL 組比較，P＜0.05；d表示與薏苡仁油40 μL/mL組比較，P＜0.05；e表示與薏苡仁油80 μL/mL組比較，P＜0.05

組別空白組薏苡仁油10 μL/mL組薏苡仁油20 μL/mL組薏苡仁油40 μL/mL組薏苡仁油80 μL/mL組薏苡仁油160 μL/mL組FP樣本量16 16 16 16 16 16 Ptch mRNA 0.52±0.04 0.48±0.03a 0.41±0.03ab 0.32±0.02abc 0.25±0.02abcd 0.14±0.01abcde 465.860＜0.001 Smo mRNA 0.94±0.08 0.84±0.07a 0.72±0.05ab 0.61±0.04abc 0.47±0.04abcd 0.31±0.02abcde 303.099＜0.001 Shh mRNA 0.89±0.07 0.81±0.05a 0.68±0.03ab 0.52±0.02abc 0.38±0.02abcd 0.21±0.01abcde 708.487＜0.001 Gli-1 mRNA 0.51±0.04 0.47±0.03a 0.42±0.03ab 0.33±0.02abc 0.20±0.02abcd 0.06±0.01abcde 669.247＜0.001

2.4 CyclinD1、p21、Caspase-3、Bcl-2、Ptch、Smo、Shh 和Gli-1 蛋白表達空白組及薏苡仁油10、20、40、80、160 μL/mL 各濃度組培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT-29 細 胞，CyclinD1、p21、Caspase-3、Bcl-2、Ptch、Smo、Shh 和Gli-1 蛋白的表達經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步采用SNK-q 檢驗對各組間上述指標的表達進行兩兩比較結(jié)果顯示，各濃度水平組間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。薏苡仁油濃度為10、20、40、80、160 μL/mL 時上述指標的蛋白表達量均比空白組明顯下降，并隨薏苡仁油濃度升高，上述指標的蛋白表達量逐漸降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。薏苡仁油濃度為10、20、40、80、160 μL/mL時p21 和Caspase-3 蛋白表達量均比空白組明顯上升，并隨薏苡仁油濃度升高，p21 和Caspase-3蛋白表達量逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 各組CyclinD1、p21、Caspase-3、Bcl-2、Ptch、Smo、Shh、Gli-1蛋白量比較（±s）

表5 各組CyclinD1、p21、Caspase-3、Bcl-2、Ptch、Smo、Shh、Gli-1蛋白量比較（±s）

注：a 表示與空白組比較，P＜0.05；b 表示與薏苡仁油10 μL/mL 組比較，P＜0.05；c 表示與薏苡仁油20 μL/mL 組比較，P＜0.05；d表示與薏苡仁油40 μL/mL組比較，P＜0.05；e表示與薏苡仁油80 μL/mL組比較，P＜0.05

組別空白組薏苡仁油10 μL/mL組薏苡仁油20 μL/mL組薏苡仁油40 μL/mL組薏苡仁油80 μL/mL組薏苡仁油160μL/mL組FP樣本量16 16 16 16 16 16 CyclinD1 1.51±0.20 1.34±0.17a 1.17±0.14ab 0.94±0.10abc 0.65±0.08abcd 0.31±0.04abcde 181.315＜0.001 p21 0.35±0.04 0.57±0.07a 0.82±0.09ab 1.12±0.14abc 1.45±0.15abcd 1.84±0.18abcde 335.849＜0.001 Caspase-3 0.35±0.03 0.47±0.06a 0.62±0.07ab 0.72±0.07abc 0.85±0.08abcd 1.04±0.09abcde 211.033＜0.001 Bcl-2 0.84±0.15 0.72±0.12a 0.61±0.08ab 0.48±0.07abc 0.32±0.05abcd 0.15±0.03abcde 122.419＜0.001 Ptch 0.68±0.05 0.60±0.04a 0.52±0.03ab 0.35±0.03abc 0.21±0.02abcd 0.08±0.01abcde 820.600＜0.001 Smo 0.95±0.06 0.82±0.04a 0.67±0.04ab 0.51±0.03abc 0.39±0.02abcd 0.26±0.01abcde 804.527＜0.001 Shh 0.89±0.05 0.74±0.04a 0.63±0.03ab 0.45±0.03abc 0.32±0.02abcd 0.24±0.01abcde 950.850＜0.001 Gli-1 0.61±0.04 0.52±0.03a 0.45±0.03ab 0.38±0.03abc 0.25±0.02abcd 0.18±0.01abcde 529.133＜0.001

3 討論

薏苡仁油是從薏苡仁中提取得到的脂肪油，其制劑康萊特注射液已批準上市，應(yīng)用于原發(fā)性非小細胞肺癌及原發(fā)性肝癌的治療中。研究表明，其可通過不同途徑抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，在食管癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中都有明顯的抗癌作用［2］。Hh信號通路在胚胎發(fā)育過程中參與胃腸道、肺、神經(jīng)管、皮膚和骨骼的形成，在成年組織中，Hh 信號途徑的傳導異?？赡芘c癌癥有關(guān)［3］。本文從Hh信號途徑角度探討薏苡仁油抗結(jié)腸癌細胞的機制。

保學明等［4］以薏苡仁酯作用于結(jié)腸癌SW480細胞，發(fā)現(xiàn)薏苡仁酯組較對照組可明顯抑制癌細胞增殖。薏苡仁油抑制結(jié)腸癌細胞增殖機制可能通過Fas-FasL 途經(jīng)進行，亦可能使薏苡仁油作用于細胞周期的G2+M 時相，并抑制細胞端粒酶活性［5］。薏苡仁油可抑制結(jié)腸癌細胞接種于裸鼠的脾轉(zhuǎn)移瘤和肝轉(zhuǎn)移瘤，推理薏苡仁油對于結(jié)腸癌晚期患者仍有明顯效果［6］。薏苡仁油的應(yīng)用還未普及，其藥理機制還不是十分明確，有待進一步研究。

已有研究表明，Hh 信號通路的基因改變可能與腫瘤的始動有關(guān)。Hh 信號通路主要是由配體Shh、12 次跨膜糖蛋白受體Ptch、7 次跨膜蛋白受體Smo、含有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子Gli 等構(gòu)成，當該信號通路收受到刺激，相應(yīng)下游蛋白激活并過度表達，進而參與腫瘤的異常增生，腫瘤被抑制時，相應(yīng)的下游蛋白表達也會下降［7］。 此外，CyclinDl、Caspase-3、P21、Bcl-2 均為Hh 信號通路相關(guān)蛋白。CyclinDl屬于細胞周期調(diào)節(jié)DNA復制過程的激酶，腫瘤增殖活躍的細胞相應(yīng)CyclinDl表 達 量 也 會 增 多［8］；P21 屬 于CDK 激 酶 抑 制 物（CDKIs），與腫瘤抑制作用密切相關(guān)；Caspase-3蛋白屬于Caspases 蛋白家族中的效應(yīng)凋亡蛋白，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，參與細胞凋亡的誘導［9］；Bcl-2 屬原癌基因，位于線粒體膜，可抑制許多因素引起的細胞凋亡，通常在正常組織中低表達，而在腫瘤組織中表達較高，腫瘤細胞的存活可能有賴于Bcl-2的細胞保護作用［10-13］。

有關(guān)薏苡仁油對結(jié)腸癌HT-29 細胞的抑制機制目前尚無報道，本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，薏苡仁油對人結(jié)腸癌HT-29 細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用，隨著薏苡仁油濃度的增加，抑制率和凋亡率也逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義。經(jīng)檢測，薏苡仁油組Ptch、Smo、Shh 和Gli-1 mRNA 和蛋白的表達較空白組增高，表達量隨薏苡仁油濃度的增加而增加。CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達量較空白組下降，并隨薏苡仁油濃度升高蛋白表達量逐漸降低。p21 和Caspase-3 蛋白表達量較空白組上升，并隨薏苡仁油濃度升高，p21和Caspase-3蛋白表達量逐漸升高。推測薏苡仁油對結(jié)腸癌HT-29細胞的抑制機制與Hh信號通路有關(guān)。

綜上所述，薏苡仁油對結(jié)腸癌HT-29 細胞具有抑制生長和促進凋亡作用，為結(jié)腸癌的防治提供了新的方法；其機制與調(diào)節(jié)Hh 通路相關(guān)成員CyclinD1、p21、Caspase-3、Bcl-2、Ptch、Smo、Shh和Gli-1 的表達有關(guān)。下一步我們將更深入探討其臨床應(yīng)用，同時為其他腫瘤的防治提供依據(jù)。