王月敏，柯玉琴，李文卿*，李春英，鐘月仙，鄭朝元，魏曉玲

(1.福建省煙草專賣局 煙草科學研究所，福建 福州 350013；2.福建農(nóng)林大學 生命科學學院，福建 福州 350002；3.廣東省汕頭市農(nóng)業(yè)科學研究所，廣東 汕頭 515021；4.福建農(nóng)林大學 資源與環(huán)境學院/國際鎂營養(yǎng)研究所，福建 福州 350002)

光照和溫度是植物生長過程中重要的影響因素。光是光合作用的能量來源，也是形成葉綠素的必要條件，還調節(jié)碳同化中許多酶的活性[1]。光照強度對植物光合作用及生長代謝起著至關重要的作用[2]。煙株生長發(fā)育對環(huán)境溫度敏感，溫度不僅改變煙葉生長發(fā)育及組織形態(tài)，對物質代謝及色素積累也有重要影響[3]。生育期內溫度過高，會破壞煙葉的葉綠素形成，影響光合作用，導致代謝失調，對煙株生長發(fā)育及煙葉的產(chǎn)品質量造成不利影響[4-8]。煙草是喜光作物，充足的日照有利于煙株生長，但是煙株生長期內溫度過高時，葉綠素受到破壞，影響光合作用，煙葉品質降低，溫度和光照只有保持一定平衡才能協(xié)調發(fā)揮作用,日照充足而不強烈對煙葉生長更為有利[4,9]。煙株處于高溫和強光環(huán)境條件下時，首先發(fā)生變化的是其內在的生理過程，其中碳氮代謝酶的活性在適應逆境的物質和能量轉化過程中起著重要作用。不同植物在環(huán)境壓力下，碳氮代謝酶活性呈現(xiàn)不同趨勢，一般來說，高溫強光下植物體內與碳代謝相關的SS、SPS酶活性升高。NR、GS、GOGAT酶活性與氮代謝息息相關，NR對溫度十分敏感，大多數(shù)植物的NR在環(huán)境壓力下活性降低。GS/GOGAT循環(huán)是植物體內銨態(tài)氮同化的主要過程，產(chǎn)生的谷氨酰胺和谷氨酸是植物體內很多含氮物質的前體，此循環(huán)酶活性在不同環(huán)境因素和品種下呈現(xiàn)不同趨勢[10-14]。高溫條件容易引起植物體內蛋白質的分解，導致游離氨基酸含量的增加[15]。

福建煙區(qū)屬于亞熱帶季風氣候，主要種植春煙，隨著生育期的推遲，煙株對應的溫度和光照逐漸增強，到上部葉成熟采收時往往遇上高溫和強光天氣。高溫和強光會對煙葉的成熟產(chǎn)生諸多不利的影響，尤其是在生長后期，高溫強光的氣候條件容易導致中上部煙葉出現(xiàn)“高溫逼熟”的現(xiàn)象。通過光強與溫度調控來研究煙株光合色素含量、碳氮代謝酶活性及代謝產(chǎn)物含量，不僅可以揭示煙株物質生產(chǎn)、分配以及生理代謝過程，而且可以反映煙株逆境適應能力，對煙葉品質形成的機理進行解析，以及對烤煙生產(chǎn)過程中如何合理調節(jié)生育期具有重要的指導意義。目前研究較多的是溫度或光照單一脅迫對烤煙生長發(fā)育及生理代謝的影響，對于高溫強光交互脅迫對成熟期烤煙生理代謝的研究鮮見報道。本試驗通過設置不同光溫處理，探討了高溫強光對成熟期煙葉的生理過程的影響，以期為烤煙的生產(chǎn)措施制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與供試材料

選用當?shù)刂髟詿煵萜贩N翠碧一號為試驗材料，由福建省煙草專賣局煙草農(nóng)業(yè)科學研究所提供。試驗于2018年在福建省煙草專賣局煙草科學研究所宦溪科研基地進行。

1.2 試驗處理

采用盆栽土培，花盆上口直徑28 cm，下底直徑22 cm，高25 cm，每盆裝15.0 kg土壤。土壤為壤土，pH值為5.11，堿解氮含量為102.4 mg/kg，速效磷含量為16.8 mg/kg，速效鉀含量為94.8 mg/kg，有機質含量為16.2 g/kg。每盆施用煙草專用肥20 g(N∶P2O5∶K2O=12%∶7%∶22%)。煙苗長到七葉一心時移栽，在室外露天種植；煙株打頂后1周移入植物生長箱(武漢瑞華儀器設備有限責任公司)進行高溫和強光處理，處理時間為48 h。試驗共設4個處理，每個處理重復4次。

T1：25 ℃遮光，光照強度為1600 μmol/(m2·s)；在T2處理煙株測定的葉片上，用硫酸紙將倒2～倒3葉遮住半片葉片(硫酸紙遮光率為30%)，用于取樣測定生理指標；

T2：25 ℃強光，光照強度為1600 μmol/(m2·s)；

T3：35 ℃遮光，光照強度為1600 μmol/(m2·s)；在T4處理煙株測定的葉片上，用硫酸紙將倒2～倒3葉遮住半片葉片，用于取樣測定生理指標；

T4：35 ℃強光，光照強度為1600 μmol/(m2·s)。

1.3 測定方法

煙株在植物生長箱中處理48 h后，取出煙株，分別取各處理倒2～倒3葉，剪碎混勻后用于測定各項生理指標。光合參數(shù)采用CIRAS-II型(由英國PP-system公司生產(chǎn))便攜式光合儀測定；葉綠素熒光參數(shù)采用Hansatech 公司生產(chǎn)的Pocket PEA便攜式葉綠素熒光計測定；葉綠素含量參照張憲政[16]的丙酮浸提法進行測定；二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)活性應用上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法進行測定；硝酸還原酶(NR)活性測定采用活體法[17]；谷氨酰胺合成酶(GS)活性參照鄒琦[17]的方法測定；蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)活性參照劉以前等[18]的方法測定；蔗糖、還原糖、果糖、可溶性糖、淀粉等含量的測定方法參照《現(xiàn)代植物生理學實驗指南》[19]。

煙葉中蛋白質水解氨基酸含量的測定方法：準確稱取葉片干粉30 mg于1.5 mL離心管中，加入1 mL 80%甲醇，超聲溶解30 min，以12000 r/min 4 ℃離心20 min，吸取上清液，用0.22 μm濾頭過濾，用高效液相色譜儀進行測定，儀器型號為Waters XEVO-TQS。

2 結果與分析

2.1 不同處理對葉片光合色素含量的影響

葉綠體色素是植物體內進行光合作用的重要色素。從表1可見，35 ℃強光處理的Chla和Chl含量極顯著低于其它3個處理，其它3個處理差異不顯著。35 ℃遮光處理Chlb含量最高，顯著高于35 ℃強光處理和25 ℃強光處理；其次是25 ℃遮光處理，其Chlb含量極顯著高于35 ℃強光處理。不同光照處理的Chlx.c含量在25 ℃溫度時差異不顯著;25 ℃溫度的兩個光處理Chlx.c含量極顯著高于35 ℃兩個光處理；在25 ℃條件下，遮光導致Chl和Chlx.c含量下降；在35 ℃高溫下遮光導致Chl和Chlx.c含量上升。說明在25 ℃適宜溫度條件下，短期強光處理會激發(fā)Chl和Chlx.c色素含量增加，而高溫處理顯著導致煙株葉片總葉綠素和類胡蘿卜素的大量降解。

表1 不同光溫處理對葉片光合色素含量的影響

2.2 不同處理對碳代謝酶活性的影響

2.2.1 不同處理對葉片蔗糖合成酶活性的影響 從圖1可見:25 ℃溫度條件下，遮光導致葉片SS酶活性極顯著下降；35 ℃溫度條件下，遮光導致葉片SS酶活性極顯著上升。遮光條件下，35 ℃溫度處理的葉片SS酶活性極顯著高于25 ℃溫度處理；強光條件下，35 ℃溫度處理的葉片SS酶活性極顯著低于25 ℃溫度處理。說明25 ℃適宜溫度條件下，短期強光處理導致葉片SS酶活性顯著上升，促進葉片蔗糖的合成；35 ℃溫度條件下強光處理則明顯抑制了葉片SS酶活性；遮光條件下升溫導致SS酶活性上升，強光條件下升溫導致SS酶活性下降。

圖1 不同光溫處理對打頂煙株SS活性的影響

2.2.2 不同處理對葉片蔗糖磷酸合成酶活性的影響 從圖2可見:25 ℃溫度條件下，遮光導致葉片SPS酶活性極顯著下降；35 ℃溫度條件下，遮光導致葉片SPS酶活性極顯著上升。在相同光條件下，35 ℃溫度處理的葉片SPS酶活性均顯著高于25 ℃溫度處理。說明25 ℃適宜溫度條件下，短期強光處理導致葉片SPS酶活性顯著上升，促進葉片蔗糖的合成；35 ℃溫度條件下強光處理則極顯著抑制了葉片SPS酶活性；兩種光條件下升溫均導致SPS酶活性上升。

圖2 不同光溫處理對打頂煙株SPS活性的影響

2.2.3 不同處理對葉片淀粉合成酶活性的影響 從圖3可見：25 ℃溫度條件下，遮光導致葉片淀粉合成酶活性極顯著下降；35 ℃溫度條件下，遮光導致葉片淀粉合成酶活性極顯著上升。在相同光條件下，35 ℃溫度處理的葉片淀粉合成酶活性均極顯著高于25 ℃溫度處理。說明25 ℃適宜溫度條件下，短期強光處理導致葉片淀粉合成酶活性顯著上升，促進葉片淀粉的合成；35 ℃溫度條件下強光處理則極顯著抑制了葉片淀粉合成酶活性；兩種光條件下升溫均導致淀粉合成酶活性上升。

圖3 不同光溫處理對煙草淀粉酶活性的影響

2.3 不同處理對葉片碳代謝物質的影響

從表2可見，無論25 ℃還是35 ℃溫度條件，強光條件下煙葉中蔗糖、還原糖、可溶性糖和淀粉等的含量均顯著或極顯著高于遮光處理；果糖含量在25 ℃溫度條件下，強光處理顯著高于遮光處理，35 ℃溫度條件下，強光處理高于遮光處理，但差異不顯著。相同光照條件下，35 ℃溫度處理的蔗糖、還原糖和可溶性糖等的含量均顯著或極顯著高于25 ℃溫度處理；果糖含量僅在遮光條件下，35 ℃處理顯著高于25 ℃處理，強光條件下隨溫度上升果糖含量上升但差異不顯著；相同光處理條件下淀粉含量隨溫度上升表現(xiàn)為顯著下降。說明不同溫度條件下，增強光照均可促進煙株糖類物質和淀粉的合成積累，相同光照條件下從25 ℃升到35 ℃可以促進糖類物質含量的增加，但導致淀粉含量的下降。

表2 不同光溫處理對葉片糖和淀粉含量的影響

2.4 不同處理對葉片氮代謝酶活性的影響

2.4.1 不同處理對葉片NR活性的影響 從圖4可見，25 ℃強光處理的煙葉硝酸還原酶活性極顯著高于其它3個處理，其它3個處理間NR活性差異不顯著；但在35 ℃溫度條件下，NR活性明顯低于25 ℃遮光處理。說明25 ℃適宜溫度條件下，短時間強光處理顯著促進了煙株葉片NR活性上升，溫度升至35 ℃時，NR活性有所下降，且光照強度對其影響不顯著。

圖4 不同光溫處理對打頂煙株NR活性的影響

2.4.2 不同處理對葉片GS活性的影響 從圖5可見，35 ℃強光處理的谷氨酰胺合成酶活性極顯著高于其它3個處理，其它3個處理之間GS活性較為接近，差異不顯著。說明GS活性相對比較穩(wěn)定，僅在高溫強光條件下表現(xiàn)為顯著上升。

圖5 不同光溫處理對打頂煙株GS活性的影響

2.4.3 不同處理對葉片GOGAT活性的影響 從圖6可見，在相同溫度條件下，強光處理葉片的谷氨酸合成酶活性極顯著高于遮光處理；強光條件下，35 ℃溫度處理GOGAT活性極顯著高于25 ℃溫度處理，遮光條件下35 ℃溫度處理GOGAT活性比25 ℃處理有所上升，但差異不顯著。說明光照強度對GOGAT活性的影響較為顯著，而僅在強光條件下溫度變化對GOGAT活性的影響較為顯著。

圖6 不同光溫處理對打頂煙株GOGAT活性的影響

2.5 不同處理對煙株葉片蛋白質水解氨基酸含量的影響

從表3可見，3-磷酸甘油酸衍生氨基酸主要有絲氨酸和甘氨酸兩種。其中，在25 ℃條件下生長的煙葉中絲氨酸含量顯著高于35 ℃條件下的；相同溫度條件下，25 ℃時，強光條件下生長的煙葉絲氨酸含量顯著高于遮光下的，35 ℃溫度下表現(xiàn)相反。在25 ℃條件下甘氨酸含量未測出；在35 ℃條件下，強光條件下煙葉的甘氨碳含量高于遮光下的。

表3 不同光溫條件對3-磷酸甘油酸衍生氨基酸含量的影響

從表4可見，在兩種溫度條件下，強光處理的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等磷酸烯醇式丙酮酸衍生氨基酸含量略高于遮光處理，但25 ℃條件下差異不顯著，35 ℃條件下差異達到極顯著水平。35 ℃處理煙株苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸含量極顯著高于25 ℃處理。

表4 不同光溫條件對磷酸烯醇式丙酮酸衍生氨基酸含量的影響

從表5可見，25 ℃條件下，與遮光處理相比，強光處理煙株的纈氨酸、亮氨酸和丙氨酸等丙酮酸衍生氨基酸含量有較明顯增加，但差異不顯著；35 ℃處理的煙株纈氨酸、亮氨酸和丙氨酸含量極顯著高于25 ℃處理，且強光處理極顯著高于遮光處理。

表5 不同光溫條件對丙酮酸衍生氨基酸含量的影響

從表6可見，α-酮戊二酸衍生氨基酸包含脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸和精氨酸等，在相同光強條件下，谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸和精氨酸等氨基酸含量隨著溫度的升高均表現(xiàn)為顯著增加；在25 ℃溫度條件下，谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸和精氨酸等氨基酸含量隨光強增加而增加，其中谷氨酰胺和谷氨酸達到極顯著水平；35 ℃溫度條件下，谷氨酰胺、谷氨酸和精氨酸等氨基酸含量隨光強增加而顯著增加，組氨酸表現(xiàn)顯著降低。在25 ℃溫度條件下，遮光處理煙株葉片的脯氨酸含量顯著高于不遮光處理;35 ℃溫度處理表現(xiàn)相反，且均極顯著低于25 ℃溫度處理的。

表6 不同光溫條件對α-酮戊二酸衍生氨基酸含量的影響

從表7可見，草酰乙酸衍生氨基酸包含蘇氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸和天冬酰胺等6種。25 ℃溫度處理煙株葉片的蘇氨酸、賴氨酸和異亮氨酸含量極顯著低于35 ℃溫度處理，且強光處理與遮光處理差異不顯著；但35 ℃溫度處理時，強光處理的煙葉蘇氨酸、賴氨酸和異亮氨酸含量極顯著高于遮光處理。不同處理煙株葉片的天冬氨酸含量差異不顯著。25 ℃溫度處理煙株葉片的甲硫氨酸含量隨光強的增加而增加，但差異不顯著；35 ℃溫度遮光處理煙株葉片的甲硫氨酸含量最高，極顯著高于其它3個處理，35 ℃溫度強光處理煙株葉片的甲硫氨酸含量與25 ℃溫度處理差異不顯著。25 ℃溫度處理煙株葉片的天冬酰胺含量隨光強的增加表現(xiàn)為顯著減少；35 ℃溫度處理煙株葉片的天冬酰胺含量隨光強的增加表現(xiàn)為極顯著增加；35 ℃溫度遮光處理的天冬氨酸含量高于25 ℃遮光處理，但差異不顯著，35 ℃溫度強光處理煙株葉片的天冬氨酸含量極顯著高于其它3個處理。

表7 不同光溫條件對草酰乙酸衍生氨基酸含量的影響

3 討論

光合色素在光能的吸收、傳遞和轉換過程中起著重要作用[1]。植物在生長期間，光合色素不斷合成與分解，含量也不斷發(fā)生變化。葉綠素是在系列酶促反應中合成的，合成的最適溫度為26～30 ℃，高溫下葉綠素合成的酶促反應受到抑制，并且降解量更大，降解、轉化更充分，葉綠素含量降低[1，20]。葉綠素合成的最后階段一般為需光反應，光照不足會使葉綠素合成受到影響，因此溫度與光照是影響植物體內葉綠素含量的重要因素[1,16-21]。本文研究中，25 ℃短期強光處理下，Chl含量顯著增加，說明適宜溫度下，光照充足會促進葉綠素的合成，葉綠素含量增加，有利于光能的充分利用；而高溫處理時，Chl和Chlx.c的含量均顯著降低，說明高溫導致煙株葉片中的總葉綠素和類胡蘿卜素大量降解。35 ℃強光處理時，葉綠體色素含量均顯著低于其他處理，在高溫強光交互脅迫下，煙株葉綠體結構遭到破壞，葉綠素的合成受到抑制并加速分解，其含量顯著降低，不利于煙株生長和品質的形成。

碳代謝是植物體內基本的代謝活動，直接影響煙株的生長發(fā)育、產(chǎn)量以及品質[22-23]。光合作用與碳代謝密切相關，兩者呈正相關，光溫條件影響碳代謝酶的活性[24-25]。在高等植物體內，參與糖代謝主要為SS及SPS兩種酶：SS既控制蔗糖分解又可催化蔗糖合成，調節(jié)蔗糖分解與合成的可逆反應；SPS主要催化蔗糖的合成，兩者活性的變化直接影響植物體內糖的合成[25-27]。淀粉合成酶是植物體內控制淀粉合成的關鍵酶[28]。當這3種酶的活性高時，植物新陳代謝快，光合作用能力強，有利于合成更多含碳物質，促進有機物的積累[29]。本文研究表明，在25 ℃條件下，短期強光處理SS、SPS及淀粉合成酶活性顯著上升; 35 ℃強光條件下，3種酶活性則顯著下降;在兩種光條件下，升溫均導致SPS及淀粉合成酶活性上升，說明在試驗條件下，25 ℃短期強光及升溫有利于促進蔗糖及淀粉的合成。從煙葉中蔗糖、還原糖、可溶性糖和淀粉等的含量看，相同溫度下，光照增強，煙株的糖類物質及淀粉含量增加，這與SS、SPS及淀粉合成酶活性規(guī)律相吻合；相同光照條件下，升溫促進糖類物質的積累，這與SS及SPS酶活性規(guī)律一致，說明適宜溫度下短期強光及升溫均有利于煙葉內糖類物質及淀粉的積累，這與任雷在甜瓜上的研究結果一致[10]。

氮代謝是植物體內重要生命活動，植物體內的蛋白質和氨基酸大部分是通過氮代謝合成的，氮代謝相關酶活性以及氮代謝產(chǎn)物含量也可作為衡量植物抗逆性的指標[14]。NR、GS及GOGAT是植物體內氨氮和硝氮同化的關鍵酶，NR催化NO3-還原成NO2-，而GS和GOGAT是同化銨態(tài)氮的關鍵酶[12]。氨基酸對煙葉的氮代謝和煙草香味物質的形成具有重要意義，氨基酸是合成蛋白質的重要原料，適量的氨基酸有利于提高煙葉的香氣量和豐滿度，氨基酸含量過低則煙氣寡淡無味且豐滿度差，過高則燃吸過程中會產(chǎn)生氨氣，導致煙氣刺激辛辣，不利于煙葉品質的形成[1，30-31]。本試驗中，適宜溫度下短時間強光處理顯著促進了煙株葉片中NR活性上升，其他處理差異不大；高溫強光處理的GS、GOGAT活性極顯著高于其它處理，與此同時大多數(shù)水解氨基酸含量在高溫強光條件下顯著高于其他3個處理，這可能是由于水溶蛋白及游離氨基酸總量的增加，其原因可能是高溫強光脅迫下，氮代謝相關酶活性提高，誘導逆境蛋白的合成，脅迫的增加進一步導致蛋白質大量水解，致使游離氨基酸總量增加，增加的游離氨基酸可能在調節(jié)滲透壓、維持細胞水勢及細胞結構、消除物質毒害及儲存氮素方面起著重要作用，氮同化的加強需要大量的碳架，葉片中的碳流會從合成糖類的方向轉為合成氨基酸[32-33]。高溫強光環(huán)境顯著提高煙株氮代謝能力：一方面，由于高溫強光條件下氮代謝相關酶活性增加[34-35]；另一方面，為了減少環(huán)境脅迫對細胞膜的傷害，很多有害物質也會轉化成含氮物質，提高植物氮代謝能力[7，13]。氮同化作用增強，含氮物質增加，不利于中上部煙葉品質的形成。

福建種植春煙，在烤煙生長后期常遇上高溫和強光天氣。從本研究看，高溫和強光導致煙株碳的合成代謝和氮的同化代謝均加強。更多的糖類物質積累可能導致葉片增厚甚至粗筋爆葉；而氮代謝的加強可能導致煙葉中堿性物質的增加，影響煙氣平衡，最終均會導致煙葉感官評吸質量的下降。因此，適時早栽和適時成熟采收對福建的烤煙生產(chǎn)極為重要;另外，本研究高溫強光處理時間僅為48 h，進一步延長高溫和強光的處理時間會對煙株產(chǎn)生哪些不利影響還有待進一步研究。

4 結論

在高溫強光脅迫下，煙株葉片的葉綠體結構遭到破壞，葉綠素合成受到抑制，分解加快，含量顯著下降，煙株光合作用過程受到抑制；煙株體內代謝過程受到影響，SS酶活性顯著下降，蔗糖、還原糖、果糖、可溶性糖含量均高于其余3個處理，說明高溫強光處理下，SS催化蔗糖合成與分解的反應過程向合成蔗糖方向進行，煙株糖類物質積累增加。在高溫強光脅迫下，NR酶活性低于25.0 ℃強光處理，與其余兩組處理差別不大，GS、GOGAT酶活性極顯著高于其它處理，與此同時大多數(shù)游離氨基酸含量顯著高于其他3個處理，說明高溫強光環(huán)境顯著提高煙株的代謝能力，含氮物質合成增多，不利于煙葉品質的形成。