蔡明, 袁榮華，楊逸凡

(南通大學第二附屬醫(yī)院 甲乳外科, 江蘇 南通 226000)

乳腺癌為女性最常見癌癥類型，1980—2010年乳腺癌發(fā)病年增加率達3.1%[1]，估計到2030年全世界乳腺癌新發(fā)病例將近220萬[2]。乳腺癌已成為當前女性癌癥死亡的主因，占所有癌癥死亡的14.3%[3-4]。由于對腫瘤早期診斷和綜合治療策略的進步，乳腺癌患者的預后得到一定改善[5]。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)在乳腺癌細胞的增殖、入侵和遷移中發(fā)揮重要作用[6-8]，內(nèi)源性配體的核孤立受體在生長發(fā)育、細胞平衡和癌癥發(fā)生進展中亦發(fā)揮作用，其中某些受體的表達過度或下調(diào)對患者的生存具有預測意義[9-11]。孤兒受體表現(xiàn)出腫瘤特異性的致癌或腫瘤抑制劑樣活性[12]。核孤立受體NR4A2作為轉(zhuǎn)錄因子，已被證實具有一定腫瘤抑制作用[13-15]。在胰腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌等細胞系中過表達NR4A2可誘發(fā)腫瘤細胞生長抑制，并下調(diào)細胞增殖、遷移和侵襲能力[16-18]。目前，關(guān)于NR4A2在乳腺癌中的研究較少[19]。本研究采用乳腺癌細胞MCF-7細胞系進行NR4A2過表達和干擾處理，觀察NR4A2對乳腺癌細胞增殖和凋亡的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人正常乳腺上皮細胞MCF 10A和乳腺癌細胞系HBL101、MDA-MD-435、MCF-7和HS598T細胞系(ATCC，中國)，10%胎牛血清(Gibco，USA)，50 U/mL青霉素(Gibco，USA)，100 mg/L鏈霉素(Gibco，USA)，RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，USA)，oe-NR4A2、si-NR4A2和si-NC質(zhì)粒(上海吉瑪公司，中國)；磷酸鹽緩沖液(賽默飛世爾，USA)，Lipofectamine 2000(賽默飛世爾，USA)，Trizol(賽默飛世爾，USA)，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司，中國)。RIPA裂解液(R0010，solarbio)，BCA試劑盒(賽默飛世爾，USA)，PVDF膜(ISEQ00010，Millipore，Billerica，MA，USA)，兔抗人NR4A2(ab54366)、PCNA(ab92552)、Bax(ab32503)、Bcl-2(ab32124)和GAPDH(ab8226 Abcam，UK)，HRP標記羊抗兔IgG抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)，ECL熒光檢測試劑盒(BB-3501，Ameshame，UK)。CCK8(Sigma，USA)，酶標儀(北京諾亞威儀器儀表有限公司，中國)，胰酶(賽默飛世爾，USA)，Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Sigma，USA)，HEPES緩存液(賽默飛公司，USA)。細胞培養(yǎng)箱(thromo3111，USA)，ABI PRISM?7300系統(tǒng)(Prism?7300，上海坤科儀器設(shè)備有限公司，中國)，Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)(BIO-RAD，USA)，酶標儀(北京諾亞威儀器儀表有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 分別將人正常乳腺上皮細胞MCF 10A和乳腺癌細胞系HBL101、MDA-MD-435、MCF-7、HS598T細胞系置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基，3～4 d傳代，選擇對數(shù)生長期且生長狀態(tài)較好的細胞進行實驗。

1.2.2細胞分組 取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細胞系按1×105/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，轉(zhuǎn)染前1天用不含血清和雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞分別轉(zhuǎn)染oe-NC(oe-NC組)、si-NC(si-NC組)、NR4A2過表達質(zhì)粒(oe-NR4A2組)和si-NR4A2干擾序列(si-NR4A2組)，按照Lipofectamine 2000說明書進行轉(zhuǎn)染。將2 μg oe-NR4A2質(zhì)粒、50 ng si-NR4A2干擾序列或si-NC快速離心，加入170 μL磷酸鹽緩沖液后混勻，靜置5 min；后加8 μL Lipofectamine 2000，輕蕩混勻，室溫下靜置20 min，添加5 μmol/LDAPT；將以上混合液加入6孔板，輕輕混勻；轉(zhuǎn)染后8 h更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 觀察指標

1.3.1qRT-PCR檢測NR4A2、PCNA、Bcl-2和Bax的mRNA表達水平 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行熒光定量PCR檢測。依次加入以下組分：25 μL SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)，各2 μL PCR上、下游引物，l μL ROX Referesi-NCe Dye參比染料(50×)，4 μL DNA模板，以及16 μL ddH2O。采用ABI PRISM?7300系統(tǒng)進行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)32次后72 ℃延伸1 min。ΔCt=CT目的基因-CTGAPDH，ΔΔCt=Ct實驗組-ΔCt對照組，以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示各目的基因相對表達量。引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2Western blot檢測NR4A2、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達 各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，預冷PBS洗3遍，以含PMSF的RIPA裂解液提取細胞中總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，去離子水調(diào)零。加入50 μg蛋白樣品，70 V恒壓電泳3 h。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，恒流150 mA轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉4 ℃封閉2 h。TBST洗膜后，加入一抗兔抗人NR4A2(1∶2 000)、PCNA(1∶5 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)及GAPDH(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗3 次，每次6 min。加入HRP標記羊抗兔IgG抗體(1∶5 000)孵育2 h。重復TBST洗膜，取ECL熒光檢測試劑盒A液和B液、等體積混勻，200 μL滴于膜上，在凝膠成像儀中曝光成像。應(yīng)用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)采集圖像，以Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值，表示相對蛋白含量。

1.3.3CCK8法檢測各組細胞增殖水平 取對數(shù)生長期的各組細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制備成1×104個/mL的細胞懸液，接種至96 孔培養(yǎng)板，每組各設(shè)8孔，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)48 h取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK8繼續(xù)培養(yǎng)1 h。應(yīng)用酶標儀于450 nm處讀取各孔吸光度值(OD)值。

1.3.4集落形成實驗 取對數(shù)生長期細胞接種于75 mm平皿內(nèi)(細胞懸液中單個細胞比例>95%)，每皿800個細胞，各加入3%瓊脂1 mL(已融化，65 ℃水浴中放置)，迅速加入并混勻；培養(yǎng)48 h后，磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)洗滌2次，甲醇固定20 min，10% Giemse染色20 min，去離子水沖洗，晾干。解剖鏡下計數(shù)每皿>20個細胞以上的集落數(shù)，計算集落形成率。

1.3.5流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用不含EDTA胰酶消化并收集細胞于流式管中，2 000 r/min離心30 min，棄上清。預冷PBS洗滌3次后，2 000 r/min重復離心20 min，棄上清；按照Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書，將HEPES緩存液、Annexin-V-FITC與PI(50∶1∶2)配成Annexin-V-FITC/PI染液，加入染液100 μL混勻，室溫孵育15 min后加入 HEPES緩存液1 mL 振蕩混勻。應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡，檢測器激發(fā)波長488 nm。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 NR4A2在乳腺上皮細胞及各乳腺癌細胞系中的表達

與人正常乳腺上皮細胞MCF 10A比較，乳腺癌HBL101、MDA-MD-435、MCF-7及HS598T細胞系中NR4A2 mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中MCF-7細胞系中表達量最低，故選擇該細胞進行后續(xù)實驗。見圖1。

注：(1)與人正常乳腺上皮細胞MCF 10A比較，P<0.05。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組NR4A2 mRNA表達

與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞NR4A2 mRNA表達量升高；而與si-NC組比較，si-NR4A2組NR4A2 mRNA表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；oe-NC組和si-NC組NR4A2 mRNA表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組NR4A2蛋白表達

與oe-NC組比較，oe-NR4A2細胞NR4A2蛋白表達量升高；而與si-NC組比較，si-NR4A2組NR4A2蛋白表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；oe-NC組和si-NC組NR4A2蛋白表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：A為各組細胞NR4A2蛋白條帶圖，B為各組細胞NR4A2蛋白水平統(tǒng)計圖；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.4 轉(zhuǎn)染后各組細胞增殖能力

與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞OD值降低；而與si-NC組比較，si-NR4A2組OD值升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；oe-NC組和si-NC組增殖能力比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

注：(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.5 轉(zhuǎn)染后各組細胞集落形成能力

與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞集落形成數(shù)減少；而與si-NC組比較，si-NR4A2組細胞集落形成數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；oe-NC組和si-NC組集落形成數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

注：A為各組細胞集落形成情況(100×)，B為各組細胞集落形成數(shù)統(tǒng)計圖；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.6 轉(zhuǎn)染后各組細胞凋亡情況

與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞凋亡率升高；而與si-NC組比較，si-NR4A2組凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；oe-NC組和si-NC組細胞凋亡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖6。

注：A為流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡流式率，B為各組細胞凋亡率統(tǒng)計圖；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.7 PCNA、Bcl-2和Bax mRNA表達

為研究NR4A2是如何影響乳腺癌細胞發(fā)生發(fā)展的，本研究通過qRT-PCR檢測增殖相關(guān)因子PCNA及凋亡相關(guān)因子Bcl-2和BaxmRNA的表達，結(jié)果顯示(圖7)，與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞的PCNA、Bcl-2 mRNA表達水平降低，BaxmRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與si-NC組比較，si-NR4A2組PCNA、Bcl-2 mRNA表達水平上升，BaxmRNA表達水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。oe-NC組、si-NC組細胞PCNA、Bcl-2和BaxmRNA表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.8 PCNA、Bcl-2和Bax蛋白表達

與oe-NC組比較，si-NC組各基因表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞PCNA、Bcl-2蛋白表達水平明顯減少，Bax蛋白表達水平上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與si-NC組比較，si-NR4A2組PCNA、Bcl-2蛋白表達水平上調(diào)，Bax蛋白表達水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖8。

注：A為各組細胞PCNA、Bcl-2和Bax的蛋白條帶圖，B為各組細胞PCNA、Bcl-2和Bax的蛋白表達統(tǒng)計圖；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

3 討論

既往研究報道，早期乳腺癌干預更有利于提高患者生存率[20]。同時，了解乳腺癌發(fā)生機制有助于制定有效防治策略[21]。然而，驗證已識別基因及其分子機制以供臨床應(yīng)用有待進一步研究。乳腺癌中已發(fā)現(xiàn)數(shù)個小異常代謝途徑、潛在生物標志物和藥物靶基因，但其具體分子網(wǎng)絡(luò)尚未清晰[22-25]。核受體是積極參與人類生理學和病理學進程的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)下游分子事件并調(diào)節(jié)復雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[26]。核受體是一類高度保守的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子家族，后者可調(diào)控正常人體組織和腫瘤組織的許多關(guān)鍵過程[27]。大多數(shù)成員受經(jīng)典配體激素調(diào)節(jié)，但孤核受體是沒有配體或尚未發(fā)現(xiàn)配體的核受體[28]。數(shù)十種孤核受體廣泛分布于機體各組織，在胚胎發(fā)育、新陳代謝和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[29]。因此，選擇性孤核受體調(diào)節(jié)劑的篩選和開發(fā)在腫瘤治療中具有重要臨床意義[30]。

惡性腫瘤以不受控制的腫瘤生長、侵襲性和轉(zhuǎn)移為特征，且涉及多種突變事件，包括轉(zhuǎn)錄因子。在本研究中，過表達NR4A2可抑制細胞增殖和集落形成，促進細胞凋亡，同時PCNA和Bcl-2表達明顯減少，Bax表達上升；而對NR4A2表達進行干擾后，細胞增殖和集落形成均顯著活躍，細胞凋亡被抑制，同時PCNA和Bcl-2表達明顯增加，Bax表達下調(diào)。提示NR4A2可能通過改變癌細胞增殖相關(guān)抗原蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達從而對乳腺癌細胞增殖和凋亡發(fā)揮作用。因此，本研究揭示NR4A2在乳腺癌中具有一定抑癌作用。本研究推測NR4A2過表達可抑制MCF-7乳腺癌細胞系增殖和集落形成，并促進其凋亡；反向干擾NR4A2進一步雙向證實本研究結(jié)論。

通過本課題，本研究推測NR4A2對MCF-7乳腺癌細胞系增殖、凋亡、集落形成能力的影響，并認為NR4A2對乳腺癌具有一定抑制作用。NR4A2對乳腺癌的影響機制與其調(diào)節(jié)其細胞增殖和凋亡，并影響相關(guān)蛋白的表達相關(guān)。NR4A2有可能是治療乳腺癌的潛在分子靶標，未來進一步探討NR4A2分子機制具有重要有意義。然而截至目前，本研究尚未能明確NR4A2對乳腺癌細胞調(diào)控的具體分子機制。未來尚基于更多分子技術(shù)和手段，以確定NR4A2下游結(jié)合蛋白或直接調(diào)控分子。