彭煜暉，梁欣明，付文莉，喻艷琴，段娟娟，吳昌學(xué)*，張啟芳*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種由髓系造血祖細(xì)胞異常增殖和分化引起的高度異質(zhì)性的惡性克隆性疾病，可繼發(fā)于腫瘤相關(guān)疾病的化療、放療，或者是由其他血液相關(guān)疾病轉(zhuǎn)化而來，患者都具有不同分析遺傳學(xué)的異常，這與AML的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]；通過骨髓細(xì)胞的異常增殖和分化，浸潤(rùn)到血液、骨髓血和其他組織中，導(dǎo)致造血功能受損和各種并發(fā)癥[2-3]。對(duì)于大多數(shù)類型急性白血病，化療仍是主要的治療手段?；熕幬锎蠖嗤ㄟ^誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤的作用[4]。阿糖胞苷(cytarabine，Ara-C)是白血病治療中最為經(jīng)典的藥物之一，能夠誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，至今急性白血病的大部分治療方案仍以其為基本組成[5-6]。Ara-C進(jìn)入人體后會(huì)轉(zhuǎn)化和Ara-C三磷酸，對(duì)DNA合成進(jìn)行抑制，是一種S期特異性藥物[7]；并且Ara-C能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，還可伴c-Myc、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)基因的下調(diào)[8]。c-Myc作為最為普遍的致癌轉(zhuǎn)錄因子之一，廣泛參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程并且在多種腫瘤中異常表達(dá)，c-Myc與侵襲性疾病和不良預(yù)后有關(guān)，其高表達(dá)能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和分化失調(diào)[9-11]。在套細(xì)胞淋巴瘤 Jeko-1 細(xì)胞株中沉默c-Myc，對(duì)細(xì)胞的增殖分化活性有明顯的抑制[12]；更重要的是，幾乎所有AML細(xì)胞的增殖和存活都依賴于c-Myc[13]；抑制c-Myc基因能夠阻止白血病的發(fā)生和白血病細(xì)胞的增殖和存活[14-15]。因此，c-Myc常作為抗白血病治療的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)[16]。由于c-Myc沒有酶的活性位點(diǎn)，其抑制劑治療白血病效果較差、且尚未取得成功[13]。因此，c-Myc靶基因的確定在治療白血病尤為重要。由于Ara-C在AML中作用機(jī)制的尚未闡明，導(dǎo)致耐藥和復(fù)發(fā)成為治療的難題，本研究探討Ara-C對(duì)AML細(xì)胞MV4-11的細(xì)胞活力、凋亡和HMGB1/c-Myc表達(dá)的影響及作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞來源 人AML細(xì)胞MV4-11為地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室所保留。

1.1.2主要試劑與儀器 lscove's DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)CORNING)，澳洲胎牛清(美國(guó)Gibco)，Ara-C(美國(guó)SIGMA-ALDRICH)，兔抗單克隆抗體c-Myc、高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)和過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記抗兔的二抗(美國(guó)CST)，超敏華軒發(fā)光試劑盒(enhanced chemiluminescence，ECL)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國(guó)Millipore)，二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒和蛋白三色Marker(美國(guó)Thermo)，抗體稀釋液、5%脫脂奶粉封閉液、十二烷基苯硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠配置試劑盒(中國(guó)碧云天)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美國(guó)Sigma)；GeneGnome XRO NPC化學(xué)發(fā)光成像儀(英國(guó)SYNGENE)，Varioskan LUX 多通道酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo Fisher Scientific)，Bio-Rad MiniⅡ/Ⅲ垂直電泳儀和Bio-Rad powerpacHC高流電源(美國(guó) Bio-Rad)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞活力檢測(cè) 將人AML細(xì)胞MV4-11置于10%胎牛血清和1% Antibiotic-Antimycotic的lscove’s DMEM培養(yǎng)基，5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)MV4-11細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×104個(gè)/孔，接種于96孔板中；使用DMSO、0.5、1.0及1.5 μmol/L Ara-C處理(DMSO、0.5、1.0及1.5 μmol/L組)，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK8)說明書要求，分別于24、48和72 h檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的光密度(optical density，OD)值。

1.2.2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 分別用DMSO、Ara-C處理人AML細(xì)胞MV4-11細(xì)胞，Ara-C終濃度為0.5、1.0及1.5 μmol/L，于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，收集細(xì)胞；利用Annexin V/PI雙染法凋亡試劑盒檢測(cè)Ara-C對(duì)MV4-11細(xì)胞凋亡的影響；將樣本上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以DMSO組作為空白對(duì)照，用FlowJo V10軟件(treestar)分析數(shù)據(jù)。

1.2.3蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)Caspase 3、c-Myc及HMGB1蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人AML細(xì)胞MV4-11細(xì)胞作為空白組，1.0 μmol/L Ara-C處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人AML細(xì)胞MV4-11細(xì)胞3、6、12、24及48 h；收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，蛋白上樣20 μg，80 V恒壓電泳并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，室溫分別孵育Caspase3一抗(1∶1 000)、c-Myc一抗(1∶1 000)及HMGB1一抗(1∶1 000)2 h，然后室溫孵育抗兔二抗(1∶1 000)1 h，ECL超敏化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)Caspase 3、c-Myc及HMGB1蛋白的表達(dá)，并利用Image J分析圖像強(qiáng)度。

1.2.4c-Myc與AML患者預(yù)后 利用cBioportal(http://www.cbioportal.org/)在線分析工具下載Acute Myeloid Leukemia(OHSU，Nature 2018)數(shù)據(jù)；利用R包(survminer)將341個(gè)樣本分c-Myc高表達(dá)組(n=231)和c-Myc低表達(dá)組(n=110)，分析c-Myc與AML患者生存期的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力

使用DMSO、0.5、1.0及1.5 μmol/L Ara-C處理MV4-11細(xì)胞24、48及72 h后，CCK8試劑盒檢測(cè)Ara-C對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明，與DMSO組相比，各組MV4-11細(xì)胞不同時(shí)間的活力均降低，且具有濃度依賴性(P<0.000 1)。見圖1。

注：與DMSO組比較，(1)P<0.000 1。

2.2 細(xì)胞凋亡

0.5、1.0及1.5 μmol/L Ara-C處理MV4-11細(xì)胞48 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與DMSO組相比，隨著Ara-C濃度的增加，凋亡細(xì)胞所占的比例明顯升高，且具有濃度依賴性(P<0.05)，表明Ara-C能誘導(dǎo)MV4-11細(xì)胞的凋亡。見圖2。

注：A、B分別為流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果和細(xì)胞凋亡定量結(jié)果；(1)與DMSO組相比，P<0.001。

2.3 Caspase 3蛋白表達(dá)

1.0 μmol/L Ara-C處理3、6、12、24及48 h后，蛋白印跡檢測(cè)Caspase 3的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與DMSO組相比，1.0 μmol/L Ara-C處理后Caspase 3表達(dá)水平降低，且具有時(shí)間依賴(P<0.05)，提示Ara-C處理MV4-11細(xì)胞后能夠使Caspase3活化，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。見圖3。

注：A、B分別為檢測(cè)Caspase 3結(jié)果和蛋白定量結(jié)果；與DMSO組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05，(3)P<0.001，(4)P<0.000 1。

2.4 c-Myc表達(dá)對(duì)AML患者生存的影響

使用cBioportal數(shù)據(jù)庫(kù)下載Acute Myeloid Leukemia(OHSU，Nature 2018)數(shù)據(jù)，分析c-Myc對(duì)AML患者生存的影響。結(jié)果表明，c-Myc高表達(dá)與AML患者較差生存期呈正相關(guān)(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同c-Myc表達(dá)對(duì)AML患者生存的影響

2.5 c-Myc和HMGB1蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果表明，與空白組相比，1 μmol/L Ara-C處理MV4-11細(xì)胞3、6、12、24及48 h 后HMGB1和c-Myc的蛋白表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為HMGB1和c-Myc蛋白表達(dá)；B、C分別為c-Myc和HMGB1定量結(jié)果；與空白組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.001，(3)P<0.000 1，(4)P<0.05。

3 討論

AML屬于血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，主要特征為發(fā)病快、病情進(jìn)展迅速、控制難、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差及發(fā)病率隨著年齡的增加而上升[17-18]。因AML發(fā)病原因尚不明確，如不及時(shí)進(jìn)行治療，患者生存期較短[19]。目前，對(duì)于AML治療主要以化療為主，而Ara-C是AML鞏固治療中使用頻率較高的藥物[20]。本研究旨在探索Ara-C誘導(dǎo)MV4-11細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞活力的分子機(jī)制研究。研究結(jié)果表明，與DMSO組相比，隨著Ara-C濃度的增加，MV4-11細(xì)胞的活力被抑制及凋亡數(shù)量增加(P<0.05)，表明Ara-C能夠抑制細(xì)胞活力和誘導(dǎo)MV4-11細(xì)胞的凋亡，并且具有濃度依賴性；利用cBioportal數(shù)據(jù)庫(kù)下載數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明c-Myc與AML患者的總生存期呈正相關(guān)(P<0.05)，即c-Myc高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)；與DMSO組相比，Ara-C下調(diào)了HMGB1/c-Myc的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，進(jìn)一步說明Ara-C誘導(dǎo)MV4-11細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

Ara-C是一種用于細(xì)胞增殖期的嘧啶類抗代謝藥物，通過抑制細(xì)胞DNA的合成，干擾細(xì)胞的增殖，并且能通過Caspase9誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[21]。同樣，本研究結(jié)果表明Ara-C能夠抑制MV4-11細(xì)胞的活力及誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡(P<0.05)，且具有濃度依賴性(P<0.05)。

c-Myc能直接與基因啟動(dòng)子區(qū)的E-box結(jié)合，調(diào)控多種基因的表達(dá)，參與細(xì)胞周期以及細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、分化和代謝等關(guān)鍵進(jìn)程[22]。已有研究顯示，c-Myc過表達(dá)可促進(jìn)原癌基因RAS突變引發(fā)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)[23]；敲低c-Myc能顯著抑制細(xì)胞增殖和腫瘤的生長(zhǎng)[24]；白血病細(xì)胞異常生長(zhǎng)和增殖與c-Myc的高表達(dá)呈正相關(guān)，并且患者較差預(yù)后[25]。這些研究與本研究結(jié)果一致，c-Myc高表達(dá)與AML患者的總生存期呈正相關(guān)(P<0.05)；Ara-C能抑制MV4-11細(xì)胞中c-Myc的蛋白表達(dá)水平且具有濃度依賴(P<0.05)。本課題組前期研究顯示，在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中HMGB1與c-Myc的表達(dá)有一定相關(guān)性，即HMGB1對(duì)c-Myc表達(dá)具有正向調(diào)控作用[26]。也有研究結(jié)果顯示，c-Myc磷酸化水平會(huì)隨著HMGB1的表達(dá)變化而變化[27]；更重要的是HMGB1在白血病發(fā)病機(jī)制有著重要的作用，化療后白血病細(xì)胞能釋放HMGB1，從而抑制Bcl-2表達(dá)和Caspase3活性，最后對(duì)白血病細(xì)胞壞死性凋亡起著負(fù)調(diào)節(jié)作用[28-29]。在慢性粒細(xì)胞白血病中，敲低HMGB1能在G1期阻滯細(xì)胞周期，同時(shí)通過下調(diào)環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖[30]；在人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞HCCLM3中，沉默HMGB1的表達(dá)能夠抑制c-Myc和磷酸化c-Myc的表達(dá)[27]；結(jié)直腸癌研究也表明，HMGB1可通過影響糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3β)/c-Myc通路，從而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力[31]。這些研究結(jié)果與本研究一致，表明Ara-C能夠抑制MV4-11細(xì)胞HMGB1和c-Myc蛋白表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞活力。

綜上，Ara-C可通過下調(diào)HMGB1/c-Myc的表達(dá)來抑制人AML細(xì)胞活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這為后續(xù)的研究工作提供一定的基礎(chǔ)，有望在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本研究的假設(shè)。