鄧思波，黃敏慧，張迎春，吳建偉，崔古貞，2，陳崢宏*，王濤*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

近年來，抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)在感染性疾病治療方面的應(yīng)用受到了極大關(guān)注，其抗微生物作用機(jī)制已成為研究焦點(diǎn)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPs不僅能作用于微生物細(xì)胞膜，還可以通過誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生、損傷細(xì)胞的DNA或線粒體等方式導(dǎo)致真菌等微生物細(xì)胞破壞[3-9]。家蠅抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A，MAF-1A)是由26個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小分子陽離子多肽，其氨基酸序列結(jié)構(gòu)與目前發(fā)現(xiàn)的AMPs不同[10]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，MAF-1A具有良好的體外抗白念珠菌(Candidaalbicans，C.albicans)活性，且作用后C.albicans的抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因、線粒體相關(guān)基因等的表達(dá)發(fā)生明顯變化，表明MAF-1A能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗菌效應(yīng)，具有多靶點(diǎn)抗C.albicans作用[11-12]，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在探討MAF-1A對(duì)C.albicans細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制，為MAF-1A的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)、為抗C.albicans藥物研發(fā)提供作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1MAF-1A化學(xué)合成 MAF-1A的氨基酸序列為KKFKETADKLIESAK QQLESLAKEMK委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)MOC)固相合成法合成，高效液相色譜(reversed-phase high-performance liquid chromatography，HPLC)純化、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS)驗(yàn)證，多肽合成純度≥98%。

1.1.2菌株C.albicans(ATCC10231)由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3主要試劑和儀器 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar，SDA)、沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(sabouraud dextrose broth，SDB)、氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LC)、活性氧檢測試劑盒、維生素C、還原型谷胱甘肽、真菌基因組脫氧核糖核苷酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取試劑盒(北京Solarbio)，線粒體膜電位(5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide，JC-1)測定試劑盒(上海MCE)，ND2000超微量紫外分光光度計(jì)(美國Nanodrop)，SYNERGY熒光多功能酶標(biāo)儀(貴陽奧秘商貿(mào))，IQuant400凝膠成像系統(tǒng)(美國Amersham Pharmacia)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株活化及菌懸液制備 無菌操作下取C.albicans凍存物劃線接種于SDA平板，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，SDB培養(yǎng)基制備濃度為2×109cfu/L菌懸液。

1.2.2ROS水平檢測 以終濃度為0、625、1 250及2 500 mg/L MAF-1A分別處理C.albicans24 h，以4 mg/L FLC為藥物對(duì)照，按試劑盒說明加2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA)熒光試劑，37 ℃避光孵育20 min，無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.2.3抗氧化劑對(duì)MAF-1A抗C.albicans活性的影響 用不同濃度(0、781 及1 560 mg/L)的維生素C(vitamins C，VC)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)預(yù)處理C.albicans30 min后，參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)M27-A3方法[13]，采用微量稀釋法檢測MAF-1A的抗C.albicans最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration，MIC)，以抑制80%C.albicans生長為MIC。

1.2.4線粒體膜電位檢測 以終濃度為0、625、1 250及2 500 mg/L的MAF-1A分別處理C.albicans24 h，氧化磷酸化解偶聯(lián)劑(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，cccp)為陽性對(duì)照，按試劑盒說明加JC-1染色工作液，37 ℃避光孵育15 min，無菌PBS洗滌2次，多功能酶標(biāo)儀檢測JC-1的熒光轉(zhuǎn)變，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長由525 nm(綠光，F(xiàn)L1)到590 nm(紅光，F(xiàn)L2)轉(zhuǎn)變，通過計(jì)算FL2/FL1比值得出線粒體膜電位的變化。

1.2.5MAF-1A與C.albicans脫氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid，DNA)結(jié)合的凝膠阻滯分析 參考真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取C.albicans的DNA，并使用超微量紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測所得DNA的濃度和純度。將DNA溶液與不同濃度的MAF-1A(0、625、1 250 及2 500 mg/L)等體積混合，以無菌超純水作為對(duì)照，各組混合液置于37 ℃孵育6 h，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(含0.01核酸染色劑)，凝膠成像分析儀觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞內(nèi)ROS含量

與0 mg/L組相比，不同濃度MAF-1A組C.albicans細(xì)胞內(nèi)ROS量明顯增加(P<0.01)，且胞內(nèi)ROS 的含量隨著MAF-1A濃度的增加而增加，呈劑量依賴性。見圖1。

注：與0 mg/L MAF-1A組比較，(1)P<0.01；(2)P<0.001。

2.2 MIC

結(jié)果顯示，MAF-1A抗C.albicans的MIC為625 mg/L；抗氧化劑GSH和VC預(yù)處理C.albicans30 min，MAF-1A抗C.albicans的MIC升高2倍，由625 mg/L增加到1 250 mg/L，即GSH和VC可使MAF-1A抗C.albicans的活性降低。

2.3 線粒體膜電位

結(jié)果顯示，與0 mg/L組比較，可見cccp組C.albicans線粒體膜電位明顯降低(P<0.001)，但不同濃度MAF-1A作用后，C.albicans線粒體膜電位未發(fā)生明顯的變化(P>0.05)。見圖2。

注：(1)與0 mg/L MAF-1A組比較，P<0.001。

2.4 MAF-1A對(duì)C.albicans DNA的影響

不同濃度MAF-1A與C.albicansDNA孵育后，可見明顯的凝膠阻滯現(xiàn)象，大量DNA被阻滯在凝膠加樣孔附近，且DNA電泳條帶均出現(xiàn)了一定的滯后現(xiàn)象，并且隨著MAF-1A濃度增加，DNA條帶亮度減弱。見圖3。

注：0為空白對(duì)照組；1～4分別為0、625、1 250及2 500 mg/L MAF-1A組。

3 討論

ROS是生物氧代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，主要包括超氧陰離子(O-2)、羥基自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(1O2)等，通常存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)過多的ROS生成時(shí)，通常會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常[14-17]。正常生理狀態(tài)下，C.albicans細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與ROS處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平維持在較低的生理范圍，但當(dāng)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS時(shí)，大量的ROS能導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)、肽鏈氧化以及氨基酸側(cè)鏈可逆或不可逆的氧化，氧自由基反應(yīng)引起的脂質(zhì)過氧化可損傷細(xì)胞膜，同時(shí)也能引起的DNA損傷包括化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變、單雙鏈的斷裂與交叉連接等，進(jìn)而影響其生理功能[18-22]。有研究發(fā)現(xiàn)，某些AMPs能誘導(dǎo)C.albicans細(xì)胞內(nèi)ROS的含量增加，對(duì)病原體造成不可逆的損害[23-25]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MAF-1A作用后的C.albicans細(xì)胞內(nèi)ROS急劇增加(P<0.01)，并呈劑量依賴性，表明MAF-1A可以誘導(dǎo)C.albicans細(xì)胞產(chǎn)生ROS；而VC及GSH作用C.albicans后，MAF-1A對(duì)C.albicans的抗菌效果明顯降低，說明MAF-1A的抗菌作用能被抗氧化劑抑制，以上提示MAF-1A可通過誘導(dǎo)胞質(zhì)內(nèi)ROS的產(chǎn)生發(fā)揮抗C.albicans活性。

線粒體是真核細(xì)胞能量中心，對(duì)維持細(xì)胞的能量代謝具有重要作用[26-27]，而線粒體膜電位的平衡是線粒體正常運(yùn)行的基本條件之一。有實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，AMPs可引起線粒體膜電位去極化，導(dǎo)致線粒體功能障礙，功能受損的線粒體可以通過 caspase 等途徑引起細(xì)胞死亡[23,27]。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)MAF-1A作用后，C.albicans菌細(xì)胞線粒體膜電位平衡未出現(xiàn)較大的波動(dòng)(P>0.05)，提示C.albicans的線粒體并不是MAF-1A抗菌作用的主要靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，部分AMPs進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)，能與菌體DNA結(jié)合進(jìn)而影響菌體細(xì)胞的正常生理功能，從而達(dá)到抑菌效果[28-29]。瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)常用來考察AMPs與菌體DNA的結(jié)合作用，通過分析其電泳遷移率來分析AMPs與菌體DNA的結(jié)合情況，若AMPs與C.albicans的DNA發(fā)生結(jié)合，則其在電泳中的遷移率就會(huì)受到影響，即與單獨(dú)的DNA(0 mg/L)相比，與MAF-1A共孵育的DNA條帶出現(xiàn)滯后、變暗淡現(xiàn)象，且在加樣孔有DNA滯留，這可能是由于MAF-1A與C.albicans的DNA鏈結(jié)合導(dǎo)致，結(jié)果表明MAF-1A進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后可與菌細(xì)胞的DNA結(jié)合，提示MAF-1A可通過結(jié)合DNA鏈，干擾DNA的復(fù)制等正常生理活動(dòng)，進(jìn)而發(fā)揮抗C.albicans效果。

綜上所述，本研究認(rèn)為 MAF-1A可能通過誘導(dǎo)C.albicans細(xì)胞內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生及與DNA結(jié)合作用來發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)抗C.albicans作用。