黃鈺婷，李敬堯，張琪，王丹，周群芳，盧曉霞,*

1. 地表過(guò)程分析與模擬教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院，北京 100871 2. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

新煙堿類殺蟲(chóng)劑(neonicotinoid insecticide)是一類具有優(yōu)越殺蟲(chóng)活性的殺蟲(chóng)劑。1985年，德國(guó)拜耳公司(Bayer)成功開(kāi)發(fā)出第一種商用新煙堿類殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)啉(imidacloprid, C9H10ClN5O2)[1]。此后，不斷有新的新煙堿類殺蟲(chóng)劑被開(kāi)發(fā)出來(lái)，廣泛用于農(nóng)業(yè)、景觀以及動(dòng)物身上害蟲(chóng)的防治。目前，新煙堿類殺蟲(chóng)劑是全球殺蟲(chóng)劑中體量最大的品種，全球銷售額約為34億美元，約占全球殺蟲(chóng)劑銷售額的20%，其代表產(chǎn)品吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)嗪和啶蟲(chóng)脒等憑借其低毒、高效、廣譜的特點(diǎn)，在農(nóng)產(chǎn)品種植領(lǐng)域擁有極大的市場(chǎng)份額。其中，吡蟲(chóng)啉2014年的全球銷售額已超過(guò)11億美元，啶蟲(chóng)脒(acetamiprid, C10H11ClN4，1996年由日本曹達(dá)株式會(huì)社開(kāi)發(fā)出并實(shí)現(xiàn)商業(yè)化)2014年的全球銷售額接近3億美元[2]。

隨著新煙堿類殺蟲(chóng)劑的大量使用，其在環(huán)境中的殘留對(duì)生態(tài)安全、糧食安全以及人類健康的潛在影響也引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。已有研究表明，土壤[3]、水[4]、蔬菜水果[5]、甚至牛奶[6]等物質(zhì)中都有不同程度的新煙堿類殺蟲(chóng)劑的檢出。呂正標(biāo)[7]測(cè)定了中國(guó)杭州市自來(lái)水樣品中新煙堿類殺蟲(chóng)劑的殘留情況，發(fā)現(xiàn)檢出率最高的為吡蟲(chóng)啉(87%)，其次為啶蟲(chóng)脒(83%)和噻蟲(chóng)胺(54%)，平均殘留濃度最高的為啶蟲(chóng)脒(5.8 ng·L-1)，其次為吡蟲(chóng)啉(4.0 ng·L-1)和烯啶蟲(chóng)胺(2.5 ng·L-1)。譚穎等[8]研究了中國(guó)北京市當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)蔬菜水果樣品中各種新煙堿類殺蟲(chóng)劑的殘留情況，發(fā)現(xiàn)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的檢出率均達(dá)100%，濃度均值分別為0.73～1.11 μg·kg-1和1.07～1.55 μg·kg-1。Wang等[9]對(duì)中國(guó)山東某農(nóng)村及周邊城市的295份人體尿液樣本(農(nóng)村235份，城市60份)中的吡蟲(chóng)啉進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示農(nóng)村和城市樣本中吡蟲(chóng)啉檢出率分別為100%和95%，殘留濃度中位數(shù)分別為0.16 μg·L-1和0.15 μg·L-1。Chen等[10]檢測(cè)了中國(guó)無(wú)錫市120份成人血清樣品中的9種新煙堿類殺蟲(chóng)劑的濃度，結(jié)果顯示吡蟲(chóng)啉檢出率為28.3%，噻蟲(chóng)胺為16.7%，噻蟲(chóng)啉為14.2%，啶蟲(chóng)脒為12.5%，濃度范圍為32.0～427 pg·mL-1。

新煙堿類殺蟲(chóng)劑是煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)的激動(dòng)劑，對(duì)昆蟲(chóng)有很好的選擇性[11]。nAChR通過(guò)結(jié)合突觸前膜釋放的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)發(fā)生膜電位去極化，增強(qiáng)對(duì)Na+、K+和Ca2+的通透性，從而使信號(hào)在細(xì)胞之間傳遞。突觸間的乙酰膽堿酯酶可以降解ACh，使神經(jīng)元恢復(fù)到極化狀態(tài)。新煙堿類殺蟲(chóng)劑如吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒也可與nAChR結(jié)合引起信號(hào)傳遞，但他們不能被乙酰膽堿酯酶降解，使得nAChR不停地受到刺激，沖動(dòng)傳導(dǎo)無(wú)法中斷，從而擾亂昆蟲(chóng)正常的神經(jīng)活動(dòng)，最后導(dǎo)致死亡[12]。

近幾年來(lái)，一些研究表明吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒對(duì)哺乳動(dòng)物甚至人類的神經(jīng)發(fā)育有一定的毒性效應(yīng)。在流行病學(xué)研究中，Yang等[13]發(fā)現(xiàn)孕婦住處吡蟲(chóng)啉的使用量與胎兒無(wú)腦畸形有正相關(guān)關(guān)系。Keil等[14]發(fā)現(xiàn)407個(gè)出生前暴露過(guò)吡蟲(chóng)啉的兒童得自閉癥的概率稍高于262個(gè)未暴露的兒童。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，Bal等[15]發(fā)現(xiàn)暴露于濃度>10 mmol·L-1的吡蟲(chóng)啉不到1 min即可損害具有煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)的小鼠耳蝸核星狀細(xì)胞的膜特性，如膜電位的顯著去極化。在體外實(shí)驗(yàn)中，Kimura-Kuroda等[16]以新生大鼠小腦神經(jīng)元為對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在表達(dá)了nAChRsα3、α4、α7亞基mRNA的小腦神經(jīng)元中，濃度>1 μmol·L-1的吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒與煙堿一樣可引起明顯的興奮性Ca2+內(nèi)流。

目前關(guān)于吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒等新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)人的神經(jīng)毒性效應(yīng)與機(jī)制仍知之甚少。本文以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞為模型，采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究不同濃度吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒暴露對(duì)細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)、nAChRsα7亞基的mRNA和蛋白表達(dá)、乙酰膽堿酯酶活性以及氧化應(yīng)激的影響，為這2種殺蟲(chóng)劑的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細(xì)胞和試劑

本實(shí)驗(yàn)采用的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)。吡蟲(chóng)啉(純度99.82%)和啶蟲(chóng)脒(純度99.45%)購(gòu)自美國(guó)百靈威科技有限公司，并溶解于經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾的二甲基亞砜(DMSO)備用。吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的分子結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)如表1所示。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用的DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS，不含鈣、鎂、酚紅)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清、雙抗混合液(10 000 Units·mL-1青霉素及10 000 μg·mL-1鏈霉素)以及0.25%胰蛋白酶(含EDTA)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 細(xì)胞暴露實(shí)驗(yàn)

SK-N-SH細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

在細(xì)胞活力測(cè)試中，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-N-SH細(xì)胞按照5×105個(gè)·mL-1的密度，在96孔板中每孔均勻鋪200 μL，置于培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)內(nèi)，貼壁生長(zhǎng)24 h，之后棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞一次，然后每孔加入200 μL加藥培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱內(nèi)暴露24 h。吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪的暴露濃度分別設(shè)置了7個(gè)水平(0.6、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 mmol·L-1)和11個(gè)水平(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mmol·L-1)，同時(shí)設(shè)置了一個(gè)溶劑對(duì)照(0.1% DMSO)。每組設(shè)置5個(gè)平行。

在細(xì)胞形態(tài)、nAChRsα7亞基的mRNA和蛋白表達(dá)、乙酰膽堿酯酶活性和氧化應(yīng)激測(cè)試中，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-N-SH細(xì)胞按照5×105個(gè)·mL-1的密度，在六孔板中每孔均勻鋪3 mL，置于培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)內(nèi)，貼壁生長(zhǎng)24 h，之后棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞一次，然后每孔加入3 mL加藥培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱內(nèi)暴露24 h。吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪的暴露濃度分別設(shè)置了3個(gè)水平(0.01、0.1和1.0 mmol·L-1)，同時(shí)設(shè)置了一個(gè)溶劑對(duì)照(0.1% DMSO)。每組設(shè)置3個(gè)平行。暴露濃度的設(shè)置基于細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]。

1.3 細(xì)胞指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 細(xì)胞活力測(cè)定

細(xì)胞活力測(cè)定使用Alamar Blue檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。細(xì)胞暴露完成后，棄去100 μL培養(yǎng)基，然后每孔加入10 μL Alamar Blue檢測(cè)試劑，在培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)內(nèi)避光孵育4～6 h，待培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開(kāi)始變成粉紅色時(shí)，測(cè)定每孔在530 nm激發(fā)光激發(fā)條件下激發(fā)出的590 nm發(fā)射光的強(qiáng)度，此光強(qiáng)值與每孔中的活性細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)暴露組與溶劑對(duì)照組中細(xì)胞活力的比值與1的差值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)抑制率。

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

在倒置光學(xué)顯微鏡(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司)下觀察細(xì)胞形態(tài)，顯微鏡放大倍數(shù)為目鏡16×物鏡40。

1.3.3 nAchRα7亞基mRNA表達(dá)的測(cè)定

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI 7500 Fast)測(cè)定細(xì)胞中nAchRα7亞基mRNA表達(dá)水平。細(xì)胞暴露完成后，棄去培養(yǎng)基。每孔加入1 mL Trizol(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，冰上裂解5 min。將每孔中吹打均勻的液體加入的1.5 mL離心管(A管)中，加入200 μL氯仿進(jìn)行萃取，蓋緊蓋子。劇烈晃動(dòng)15 s，充分混勻后室溫靜置5 min。離心機(jī)在4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min。離心后將收集上層無(wú)色液體至1.5 mL干凈離心管(B管)，加入500 μL異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫孵育10 min。離心機(jī)在4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min。棄上清，每管加入1 mL用DEPC水(中國(guó)北京誠(chéng)業(yè)科技有限公司)配制的75%乙醇充分洗滌RNA沉淀。離心機(jī)在4 ℃、7 500 r·min-1條件下離心10 min。重復(fù)洗滌操作一次。棄去B管上清，適度晾干，然后加入20 μL無(wú)酶水，輕彈混勻，測(cè)濃度。根據(jù)Go ScriptTMReverse Transcription System試劑盒(美國(guó)Promrga公司)的說(shuō)明，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。定量PCR實(shí)驗(yàn)前于70 ℃在15 min內(nèi)去除反轉(zhuǎn)錄酶。實(shí)驗(yàn)中用到的基因的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如表2所示，內(nèi)參基因?yàn)棣?Actin基因。按照擴(kuò)增試劑盒SYBR Green Supermix(中國(guó)北京誠(chéng)業(yè)科技有限公司)的要求配制20 μL反應(yīng)混合液，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)熱30 s，循環(huán)數(shù)為40，每個(gè)循環(huán)中95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)1 min。使用2-△△CT的計(jì)算方法計(jì)算qPCR中實(shí)驗(yàn)組相對(duì)對(duì)照組的mRNA表達(dá)量倍數(shù)，以對(duì)照組為1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.4 nAchRα7亞基蛋白表達(dá)的測(cè)定

采用Weston Blot法測(cè)定nAchRα7亞基蛋白表達(dá)水平。細(xì)胞暴露完成后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗2次(置于冰上操作)。向每孔中加入100 μL細(xì)胞裂解液，并用干凈的細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞刮下。收集裂解液中的細(xì)胞至2 mL離心管中，在冰上裂解1 h。裂解完畢后，14 000 r·min-1離心15 min(4 ℃)，收集上清液于另一離心管中，棄去沉淀，使用BCA法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)濃度。上樣緩沖液與樣品按1∶3體積比混合于600 μL離心管中，95 ℃加熱15 min使蛋白質(zhì)變性。在12孔預(yù)制膠中每孔上樣18 μL進(jìn)行電泳，電泳電壓恒壓100 V，時(shí)間為70 min。電泳結(jié)束后，將膠取下，恒流270 mA轉(zhuǎn)PVDF膜60 min，得到的PVDF膜先用含5%脫脂奶粉的TBST溶液進(jìn)行封閉1 h，然后用一抗(抗nAchRα7，美國(guó)Abcam公司)孵育膜過(guò)夜。孵育完畢后，用TBST洗膜3次，然后用二抗(山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor? 488)，美國(guó)Abcam公司)孵育80 min。孵育完畢后，用TBST洗膜3次。將PVDF膜放在一張保鮮膜上。使用ECL(美國(guó)Thermo Fisher公司)顯影后，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，根據(jù)計(jì)算結(jié)果與蛋白質(zhì)濃度之比，獲得目標(biāo)蛋白人nAchRα7亞基的相對(duì)表達(dá)量。β-actin蛋白作為上樣參考。將曝光過(guò)一次的膜用TBST清洗3次，然后使用膜再生液處理，洗掉膜上結(jié)合的一抗。重新用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉膜1 h，重新孵育β-actin的一抗過(guò)夜。之后步驟同nAchRα7的處理。

表2 RT-qPCR使用的引物序列Table 2 Primer sequences used in RT-qPCR

1.3.5 乙酰膽堿酯酶活性測(cè)定

采用人乙酰膽堿酯酶(AChE)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)，利用雙抗體夾心法測(cè)定樣品中的AChE活性。細(xì)胞暴露完成后，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次。用0.05%胰蛋白酶將細(xì)胞從六孔板上消化并收集到2 mL離心管中，2 000 r·min-1離心20 min(4 ℃)，棄去上清液，用PBS清洗沉淀2次，2 000 r·min-1離心20 min(4 ℃)，棄去上清液，用PBS重懸細(xì)胞，至細(xì)胞濃度達(dá)到1×106個(gè)·mL-1。在液氮中反復(fù)凍融收集到的細(xì)胞3次，2 000 r·min-1離心20 min(4 ℃)，收集上清液并使用BCA法測(cè)定其中的蛋白質(zhì)濃度(PierceTMBCA Protein Assay Kit試劑盒，美國(guó)Thermo Fisher公司)。在96孔板微孔中包被固定好人AChE抗體，加入樣品并在37 ℃下孵育30 min，使樣品中的AChE與固定的抗體結(jié)合。用洗滌液洗滌微孔5次，再加入有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的AChE抗體，37 ℃孵育30 min，使新加入的抗體包被在AChE上，形成抗體-抗原-酶標(biāo)復(fù)合體。用洗滌液洗滌微孔5次，依次加入底物過(guò)氧化脲與3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。HRP催化過(guò)氧化脲與TMB反應(yīng)，生成藍(lán)色產(chǎn)物。藍(lán)色產(chǎn)物在酸環(huán)境下轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，通過(guò)測(cè)定其在450 nm波長(zhǎng)的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)樣品比對(duì)，定量檢測(cè)加入樣品中AChE的活性濃度。計(jì)算結(jié)果與蛋白濃度之比，可得AChE在細(xì)胞中相對(duì)活性濃度。

1.3.6 細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)定

還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值常作為指示生物體內(nèi)氧化應(yīng)激的指標(biāo)[22]。本實(shí)驗(yàn)中采用細(xì)胞內(nèi)GSSG/GSH的變化表征氧化應(yīng)激。利用總谷胱甘肽試劑盒(中國(guó)碧云天公司)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量。細(xì)胞暴露完成后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞一次，離心收集細(xì)胞，棄去上清。加入細(xì)胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑，利用液氮和37 ℃水浴對(duì)樣品進(jìn)行2次快速的凍融，4 ℃或冰浴放置5 min，10 000 r·min-1離心10 min(4 ℃)，然后取一部分上清液用于總谷胱甘肽(GSSG+GSH)的測(cè)定，另一部分加入GSH清除試劑，用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSSG含量。向兩部分樣品中分別加入蛋白去除試劑和總谷胱甘肽檢測(cè)工作液，在25 ℃下孵育5 min，再加入0.5 mg·mL-1NADPH混勻，立即測(cè)定其在412 nm下的吸光度?？偣入赘孰暮颗c氧化型谷胱甘肽含量相減，即得到還原性谷胱甘肽含量。

1.3.7 轉(zhuǎn)錄組分析

將0.1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉暴露組和溶劑對(duì)照組的細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶(含EDTA)從培養(yǎng)皿上消化下來(lái)，用PBS緩沖液洗凈，每組設(shè)置3個(gè)平行，交付上海生工生物工程股份有限公司用Illumina Hiseq 2500進(jìn)行全RNA測(cè)序分析。在高通量測(cè)序的結(jié)果中篩選出吡蟲(chóng)啉暴露組和溶劑對(duì)照組基因表達(dá)量差異顯著的基因，在相關(guān)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)當(dāng)中查詢其功能，并歸納出表達(dá)變化基因的功能。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS Statistics 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用T檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)結(jié)果顯著性，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果(Results)

2.1 吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪暴露對(duì)SK-N-SH細(xì)胞活力的影響

SK-N-SH細(xì)胞在不同濃度吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪培養(yǎng)液中暴露24 h后的細(xì)胞活力和細(xì)胞活力抑制率如圖1所示。與對(duì)照組相比，吡蟲(chóng)啉的10%抑制濃度(IC10)約為1.5 mmol·L-1。當(dāng)吡蟲(chóng)啉濃度<1.2 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力沒(méi)有受到顯著影響(P>0.05)；當(dāng)吡蟲(chóng)啉濃度≥1.5 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，且有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。由于吡蟲(chóng)啉的溶解度有限，無(wú)法觀察到吡蟲(chóng)啉的50%抑制濃度(IC50)值。與對(duì)照組相比，啶蟲(chóng)脒的IC10約為2.0 mmol·L-1，IC50約為10.6 mmol·L-1。當(dāng)啶蟲(chóng)脒濃度<1 mmol·L-1，細(xì)胞活力沒(méi)有受到顯著影響(P>0.05)；當(dāng)啶蟲(chóng)脒濃度≥1 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，且有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。由于通常情況下人體內(nèi)新煙堿類殺蟲(chóng)劑的暴露劑量較低[8,23]，根據(jù)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定了3個(gè)梯度的低濃度水平(0.01、0.1和1 mmol·L-1)進(jìn)行后續(xù)暴露實(shí)驗(yàn)。在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，與溶劑對(duì)照相比，0.01～1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉/啶蟲(chóng)脒暴露下的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。不同濃度吡蟲(chóng)啉暴露下的細(xì)胞形態(tài)如圖2所示。

圖1 不同濃度吡蟲(chóng)啉(a)和啶蟲(chóng)脒(b)對(duì)細(xì)胞活力的影響注：DMSO表示二甲基亞砜溶劑對(duì)照(0.1% DMSO)，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，與溶劑對(duì)照比較。Fig. 1 Effects of imidacloprid (a) and acetamiprid (b) at different concentrations on cell viabilityNote: DMSO stands for dimethyl sulfoxide solvent control (0.1% DMSO); *represents P<0.05, **represents P<0.01, ***represents P<0.001, as compared to the solvent control.

圖2 溶劑對(duì)照和3種濃度吡蟲(chóng)啉暴露下的細(xì)胞形態(tài)(20×20)注：(a) 溶劑對(duì)照；(b) 0.01 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉；(c) 0.1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉；(d) 1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉。Fig. 2 Cell morphology in solvent control and in groups exposed to different concentrations of imidacloprid (20×20)Note: (a) solvent control; (b) 0.01 mmol·L-1 imidacloprid; (c) 0.1 mmol·L-1 imidacloprid; (d) 1 mmol·L-1 imidacloprid.

2.2 吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪暴露對(duì)SK-N-SH細(xì)胞nAchR α7亞基mRNA和蛋白表達(dá)的影響

SK-N-SH細(xì)胞在溶劑對(duì)照和3個(gè)濃度(0.01、0.1和1 mmol·L-1)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪培養(yǎng)液中暴露24 h后nAchRα7亞基mRNA表達(dá)水平的變化如圖3所示。與溶劑對(duì)照組相比，1 mmol·L-1的2種殺蟲(chóng)劑暴露組中nAchRα7亞基的mRNA表達(dá)均顯著上升(P<0.05)。

SK-N-SH細(xì)胞在溶劑對(duì)照和3個(gè)濃度(0.01、0.1和1 mmol·L-1)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪培養(yǎng)液中暴露24 h后nAchRα7亞基蛋白表達(dá)的比較如圖4和圖5所示。與溶劑對(duì)照組相比，1 mmol·L-1的2種殺蟲(chóng)劑暴露組中nAchRα7亞基的蛋白表達(dá)均顯著上升(P<0.01)。這個(gè)結(jié)果與mRNA的結(jié)果一致。

圖3 不同濃度吡蟲(chóng)啉(a)和啶蟲(chóng)脒(b)對(duì)細(xì)胞內(nèi)nAChR α7亞基mRNA含量的影響注：*表示P<0.05，與溶劑對(duì)照相比。Fig. 3 Effects of imidacloprid (a) and acetamiprid (b) at different concentrations on the content of nAChR α7 subunit mRNA in cellsNote: *represents P<0.05, compared with the solvent control.

圖4 不同濃度吡蟲(chóng)啉組細(xì)胞內(nèi)nAChR α7亞基凝膠電泳蛋白質(zhì)條帶圖(a)和含量(b)注：***表示P<0.001，與溶劑對(duì)照相比。Fig. 4 Protein band diagram (a) and content (b) of nAChR α7 subunit gel electrophoresis in cells under exposure to different concentrations of imidaclopridNote: ***represents P<0.001, compared with the solvent control.

圖5 不同濃度啶蟲(chóng)脒組細(xì)胞內(nèi)nAChR α7亞基凝膠電泳蛋白質(zhì)條帶圖(a)和含量(b)注：**表示P<0.01，與溶劑對(duì)照相比。Fig. 5 Protein band diagram (a) and content (b) of nAChR α7 subunit gel electrophoresis in cells under exposure to different concentrations of acetamipridNote: **represents P<0.01, compared with the solvent control.

2.3 吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪暴露對(duì)SK-N-SH細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性的影響

SK-N-SH細(xì)胞在溶劑對(duì)照和3個(gè)濃度(0.01、0.1和1 mmol·L-1)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪培養(yǎng)液中暴露24 h后AChE活性的比較如圖6所示。與溶劑對(duì)照組相比，0.1 mmol·L-1和1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉暴露組中AChE活性顯著降低(P<0.01)，0.01 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉暴露組中AChE活性也降低，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(P>0.05)，3個(gè)濃度啶蟲(chóng)脒暴露組中AChE活性無(wú)明顯變化(P>0.05)。

2.4 吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪暴露對(duì)SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

SK-N-SH細(xì)胞在溶劑對(duì)照和3個(gè)濃度(0.01、0.1和1 mmol·L-1)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪培養(yǎng)液中暴露24 h后GSSG/GSH的比較如圖7所示。與溶劑對(duì)照組相比，1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉暴露組中GSSG/GSH顯著上升(P<0.05)，0.01 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉暴露組中GSSG/GSH有明顯上升，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(P>0.05)，3個(gè)濃度啶蟲(chóng)脒暴露組中GSSG/GSH也有上升，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(P>0.05)。

2.5 吡蟲(chóng)啉暴露對(duì)SK-N-SH細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響

以上研究結(jié)果顯示，在相同暴露條件下，吡蟲(chóng)啉對(duì)細(xì)胞的影響大于啶蟲(chóng)脒。為進(jìn)一步揭示吡蟲(chóng)啉的影響，取0.1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉暴露組和溶劑對(duì)照組進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并與已有的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定表達(dá)變化基因的功能。與對(duì)照組相比，0.1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉暴露組出現(xiàn)了很多有顯著表達(dá)差異的基因，其中一些主要富集在神經(jīng)退行性疾病如亨廷頓病、帕金森病和阿爾茲海默病等相關(guān)通路，如圖8所示。

圖6 不同濃度吡蟲(chóng)啉(a)和啶蟲(chóng)脒(b)對(duì)細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)相對(duì)活性的影響注：**表示P<0.01，與溶劑對(duì)照相比。Fig. 6 Effects of imidacloprid (a) and acetamiprid (b) at different concentrations on the relative activity of acetylcholinesterase (AChE) in cellsNote: **represents P<0.01, compared with the solvent control.

圖7 不同濃度吡蟲(chóng)啉(a)和啶蟲(chóng)脒(b)對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)的影響注：*表示P<0.05，與溶劑對(duì)照相比。Fig. 7 Effects of imidacloprid (a) and acetamiprid (b) at different concentrations on intracellular oxidized glutathione/reduced glutathione (GSSG/GSH)Note: *represents P<0.05, compared with the solvent control.

3 討論(Discussion)

吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪都屬于第一代新煙堿類殺蟲(chóng)劑(氯代煙堿型)，但部分結(jié)構(gòu)不同。吡蟲(chóng)啉屬于N-硝基胍類，而啶蟲(chóng)咪屬于氰基脒類，這使得兩者與nAChR的結(jié)合能力不同，因而毒性也不同。在細(xì)胞活力測(cè)試中，吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪對(duì)SK-N-SH細(xì)胞的IC10分別約為1.5 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1(暴露24 h)，這表明吡蟲(chóng)啉對(duì)SK-N-SH細(xì)胞活力的抑制大于啶蟲(chóng)咪。新煙堿類殺蟲(chóng)劑的主要作用靶點(diǎn)為nAChR，即殺蟲(chóng)劑中的藥效基團(tuán)與nAChRs的氨基酸殘基相互作用[17]。在脊椎動(dòng)物中，目前已經(jīng)識(shí)別出17種不同的nAChRs亞基(α1～α10、β1～β4、γ、δ、ε)，除α8外，其余亞基在人類中都存在，這些亞基的多種組合方式構(gòu)成了nAChRs功能的多樣性[24-25]。nAChRα7是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最多的一種nAChRs亞型，與大腦的學(xué)習(xí)、記憶以及感覺(jué)門控等認(rèn)知功能有關(guān)。nAChRs通過(guò)結(jié)合突觸前膜釋放的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，對(duì)Na+、K+和Ca2+的通透性增強(qiáng)[12]，從而使電信號(hào)在細(xì)胞之間傳遞。突觸間的AChE可以降解乙酰膽堿，終止乙酰膽堿對(duì)突觸后膜的興奮作用，維持正常的神經(jīng)傳導(dǎo)活動(dòng)。此外，AChE還參與細(xì)胞的發(fā)育和成熟，能促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生。本研究中，暴露于1 mmol·L-1的吡蟲(chóng)啉或啶蟲(chóng)咪24 h均使SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)nAchRα7亞基的蛋白表達(dá)顯著上升，這可能是吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪與nAchRα7結(jié)合后細(xì)胞為應(yīng)對(duì)乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)減少而產(chǎn)生的一種補(bǔ)償機(jī)制。0.01 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1的吡蟲(chóng)啉或啶蟲(chóng)咪與nAchRα7亞基的結(jié)合較少，因而對(duì)nAchRα7亞基的蛋白表達(dá)影響不明顯。0.1 mmol·L-1和1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉對(duì)SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)AChE活性有顯著的抑制效應(yīng)，這與有機(jī)磷的作用類似[26]，表明吡蟲(chóng)啉可能會(huì)與AChE結(jié)合，抑制其活性，或通過(guò)其他方式抑制AchE活性。3個(gè)濃度(0.01、0.1和1 mmol·L-1)啶蟲(chóng)咪對(duì)AchE活性均無(wú)影響，表明啶蟲(chóng)咪與AChE不會(huì)結(jié)合。吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)咪對(duì)AChE活性影響的不一致，與2種殺蟲(chóng)劑的藥效基團(tuán)不同有關(guān)。

圖8 與溶劑對(duì)照相比，0.1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉暴露組顯著差異基因富集通路Fig. 8 Compared with solvent control, enrichment pathways of significantly different genes in 0.1 mmol·L-1 imidacloprid exposure group

氧化還原態(tài)平衡是機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本內(nèi)涵之一，它可以影響到基因的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶和生物大分子的活性、細(xì)胞和器官的功能，以及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、壞死等許多生理、病理生理過(guò)程。因此，監(jiān)測(cè)細(xì)胞的氧化-還原態(tài)非常重要[27]。GSH和GSSG是體內(nèi)的一個(gè)氧化還原對(duì)，可較好地反映人體內(nèi)氧化還原狀態(tài)。本研究中，不同濃度的吡蟲(chóng)啉或啶蟲(chóng)咪均使GSSG/GSH上升，但只有1 mmol·L-1的吡蟲(chóng)啉使GSSG/GSH顯著上升，其余不顯著。

在轉(zhuǎn)錄組水平上，0.1 mmol·L-1吡蟲(chóng)啉暴露可引起上千個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，包括與神經(jīng)退行性疾病(亨廷頓舞蹈病、帕金森病和阿爾茨海默病)有關(guān)的基因和與酒精性脂肪性肝病及氧化磷酸化有關(guān)的基因，這些基因之間聯(lián)系十分緊密。除此之外，與泛素蛋白、剪接體、核糖體、RNA轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因表達(dá)也出現(xiàn)顯著變化，但是這些基因之間聯(lián)系不密切。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果可為下一步研究指明方向。

綜上所述，吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒作為nAChRs的激動(dòng)劑，可與乙酰膽堿競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合了吡蟲(chóng)啉或啶蟲(chóng)脒的nAChRs，無(wú)法行使其正常功能。細(xì)胞為了對(duì)抗這種因乙酰膽堿受體效價(jià)下降所造成的功能下降，一方面提高nAChRs亞基的表達(dá)量以增加未結(jié)合殺蟲(chóng)劑的nAChRs的量，另一方面降低AChE的活性(在吡蟲(chóng)啉暴露中發(fā)現(xiàn))，提高乙酰膽堿與nAChRs結(jié)合的概率。吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒與nAChRs結(jié)合后，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，尤其是吡蟲(chóng)啉。在本研究中，除細(xì)胞活力外，其余各指標(biāo)未觀察到明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，可能與2種殺蟲(chóng)劑復(fù)雜的致毒機(jī)制有關(guān)。