高修歌，楊丹，宋昕昊，彭麟，季輝，郭大偉，江善祥

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095

目前環(huán)境中抗生素與重金屬的復(fù)合污染現(xiàn)象日益嚴(yán)重，復(fù)合污染產(chǎn)生的環(huán)境效應(yīng)與單一污染不同[1]，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康構(gòu)成潛在威脅[2]。銅是水體污染中最常見的重金屬之一[3]，也是生命體必需的微量元素。水中的銅污染源有許多，如漁業(yè)生產(chǎn)中使用的CuSO4、從空氣中沉降進(jìn)入水體的懸浮物、農(nóng)業(yè)灌溉和工業(yè)生產(chǎn)排放的含銅廢液等。當(dāng)水中Cu2+濃度超出限度，會(huì)對(duì)水生動(dòng)物造成嚴(yán)重危害甚至導(dǎo)致死亡[4]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，由于未合理使用銅制劑導(dǎo)致水生動(dòng)物銅中毒的事件屢有發(fā)生。姚志峰等[5]研究發(fā)現(xiàn)，中華鱘體內(nèi)抗氧化酶的活性隨著Cu2+濃度的升高而降低，體內(nèi)氧化物質(zhì)不斷積累，對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成損傷，從而導(dǎo)致死亡。有學(xué)者指出，貝類可通過進(jìn)食等多種途徑吸收水環(huán)境中的碘化銅，對(duì)Cu2+有較強(qiáng)的富集能力[6]。當(dāng)Cu2+在體內(nèi)蓄積到一定量時(shí)，可通過食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+對(duì)斑馬魚胚胎96 h的半數(shù)致死濃度(50% lethal concentration, LC50)是2.5 μg·L-1，Cu2+可誘導(dǎo)斑馬魚心臟細(xì)胞凋亡[8]，且抑制胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育和孵化[9]。魚鰓是吸收Cu2+的主要部位，進(jìn)入機(jī)體的Cu2+首先在腸道富集，隨后通過生化反應(yīng)和血液運(yùn)輸至機(jī)體其他部位[10]，最終主要在肝臟中富集，造成肝組織損傷[11]。因此，Cu2+的生態(tài)毒性效應(yīng)仍是亟待解決的重要環(huán)境問題之一。

馬度米星銨(maduramicin)是一種聚醚類離子載體抗生素，廣泛用于肉雞球蟲病的防治[12]。其在雞體內(nèi)代謝較快且大部分以藥物原型通過雞糞進(jìn)入土壤中，進(jìn)一步污染水體等環(huán)境[13]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)新獸藥申報(bào)材料顯示，馬度米星銨經(jīng)水體染毒引起虹鱒魚死亡的96 h-LC50為5.0 mg·L-1，引起藍(lán)鰓太陽魚死亡的96 h-LC50為1.4 mg·L-1，對(duì)藍(lán)鰓太陽魚的毒性為高毒，馬度米星銨對(duì)大型溞48 h半數(shù)有效濃度(median effective concentration, EC50)為7.5 mg·L-1。馬度米星銨對(duì)克氏原螯蝦的96 h-LC50為67.03 mg·L-1[14]，說明克氏原螯蝦對(duì)馬度米星銨的耐受力較高[15]。馬度米星銨對(duì)斑馬魚的96 h-LC50為13.33 mg·L-1[16]。然而馬度米星銨對(duì)不同水生生物的毒性效應(yīng)仍不可知，有待進(jìn)一步探究。

鯽魚是我國(guó)最常見的淡水魚類之一，在我國(guó)廣泛養(yǎng)殖。鯽魚作為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物，可應(yīng)用于毒理學(xué)、比較病理學(xué)及環(huán)境科學(xué)等科研領(lǐng)域。鯽魚對(duì)農(nóng)藥、重金屬等化學(xué)品較為敏感，是研究水生態(tài)毒理學(xué)的理想模型之一[17-18]。王曉峰等[19]通過檢測(cè)鯽魚體內(nèi)多氯聯(lián)苯的含量，評(píng)價(jià)電子垃圾拆解地區(qū)的環(huán)境污染狀況。王宗保等[20]成功建立鯽魚肝臟腫瘤模型，為腫瘤學(xué)研究提供了新的可能。鯽魚在藥物安全性及療效評(píng)價(jià)方面也占有重要地位，已有學(xué)者研究了四環(huán)素、奧比沙星及甲苯達(dá)唑等藥物在鯽魚體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)、毒性及殘留[21-23]，為藥物合理使用提供了科學(xué)依據(jù)。

目前，環(huán)境中抗生素與重金屬的復(fù)合污染現(xiàn)象日益嚴(yán)重，抗生素與重金屬結(jié)合后可能扮演一種未知的環(huán)境角色，產(chǎn)生的環(huán)境效應(yīng)與單一污染的作用不同，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成潛在威脅[24]。馬度米星銨和Cu2+在水環(huán)境中可能共存，對(duì)水生物造成潛在危害。為明確Cu2+和馬度米星銨復(fù)合污染對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，本研究擬以鯽魚為試驗(yàn)動(dòng)物，從不同角度探討硫酸銅和馬度米星銨對(duì)鯽魚的單一及聯(lián)合毒性作用，以期為重金屬和抗生素的合理使用及水生態(tài)環(huán)境保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

增氧氣泵(S-50BX型，塞爾科技，中國(guó))，溶解氧測(cè)定儀(AR8010型，希瑪儀表集團(tuán)有限公司，中國(guó))，水質(zhì)硬度檢測(cè)儀(TDS型，力晨科技，中國(guó))，pH計(jì)(SX-610型，上海三信儀表廠，中國(guó))，體視顯微鏡(SZ51型，奧林巴斯公司，日本)，微型電動(dòng)勻漿器(1658050型，伯樂公司，美國(guó))，切片機(jī)(RM型，上海徠卡儀器，中國(guó))，微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop 2000型，賽默飛世爾公司，美國(guó))，PCR儀(T100型，伯樂公司，美國(guó))，熒光定量PCR儀(CFX96型，伯樂公司，美國(guó))，電泳儀(DYY-6C型，北京六一生物科技有限公司，中國(guó))，熒光顯微鏡(DP73型，奧林巴斯公司，日本)。

馬度米星銨(含量91.9%，浙江匯能生物股份有限公司)，CuSO4·5H2O(純度99.0%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，異丙醇(純度99.5%，上海申博化工有限公司)，DNase/RNase-Free Water、Tris-HCl、吉姆薩濃縮染液、乙二胺四乙酸二鈉、胰蛋白酶消化液購自北京索萊寶科技有限公司，三氯甲烷、丙酮、鹽酸和氫氧化鈉購自上海凌峰化學(xué)試劑公司，均為分析純，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(RR420A)、RNAiso Plus(9108)和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ)(RR047A)購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，總蛋白定量測(cè)定試劑盒(A045-4-2)、總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(A001-3-2)、過氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(A007-1-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測(cè)定試劑盒(A005-1-2)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(A003-1-2)、脫氧核糖核酸(DNA)損傷試劑盒(G010-1-1)購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物

體質(zhì)量(146±15) g的鯽魚購于南京特給力種植專業(yè)合作社，置于帆布魚池中(1 m×1 m×0.8 m)。實(shí)驗(yàn)用水為充分曝氣除氯的自來水(pH值約為7，溫度(20±2) ℃，溶氧量始終>6 mg·L-1，總硬度為80 mg·L-1)。鯽魚在上述水環(huán)境中適應(yīng)性馴養(yǎng)一周，保證12 h∶12 h的光照/黑暗周期，增氧泵24 h持續(xù)泵氧。馴養(yǎng)期間每天換水1次，定時(shí)按體質(zhì)量1%投喂不含抗生素的全價(jià)魚飼料并清理池底糞便及剩余飼料，一周內(nèi)自然死亡率低于5%才可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 硫酸銅對(duì)鯽魚的急性毒性

急性毒性實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)染毒法[25]，依據(jù)預(yù)試驗(yàn)得到的100%致死濃度和最大耐受濃度，等比設(shè)計(jì)7個(gè)濃度組(2.5、3.4、4.6、6.2、8.4、11.4和15.5 mg·L-1CuSO4)和空白對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行10尾鯽魚。鯽魚在試驗(yàn)前一天禁食直至試驗(yàn)結(jié)束，試驗(yàn)期間，每隔24 h更換一半染毒溶液并補(bǔ)充至初始濃度，在試驗(yàn)開始的第2～8小時(shí)內(nèi)觀察鯽魚的臨床表現(xiàn)，每隔24 h記錄鯽魚的中毒表現(xiàn)及死亡尾數(shù)，連續(xù)觀察96 h。試驗(yàn)過程中及時(shí)清出死魚，判斷標(biāo)準(zhǔn)為鰓蓋停止活動(dòng)，用玻璃棒輕觸魚尾部，5 min內(nèi)魚無反應(yīng)。采用寇氏法計(jì)算硫酸銅對(duì)鯽魚的96 h-LC50和安全濃度。

1.3.2 硫酸銅和馬度米星銨聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚的急性毒性

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明馬度米星銨對(duì)鯽魚的96 h-LC50為11.22 mg·L-1(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，以硫酸銅和馬度米星銨對(duì)鯽魚96 h-LC50值為一個(gè)毒性單位，按毒性1∶1的混合比例[8]，設(shè)置0.1、0.2、0.4、0.8和1.6毒性單位混合染毒液進(jìn)行聯(lián)合毒性試驗(yàn)，并設(shè)對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行10尾鯽魚，試驗(yàn)方法與單一染毒試驗(yàn)相同。采用Marking相加指數(shù)法[9]評(píng)價(jià)其聯(lián)合毒性大小，公式如下：

式中：S表示混合物毒性之和；A和B分別為單一染毒的LC50；Am和Bm分別為聯(lián)合染毒的LC50。運(yùn)用S值計(jì)算相加指數(shù)(additive index, AI)值，用AI判斷聯(lián)合毒性，當(dāng)S≤1時(shí)，AI=1/S-1；當(dāng)S>1時(shí)，AI=-S+1。AI>0時(shí)為協(xié)同作用，AI=0時(shí)為加和作用，AI<0時(shí)為拮抗作用。

1.3.3 硫酸銅和馬度米星銨聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚的亞急性毒性

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607—89)對(duì)養(yǎng)殖水體中銅離子的濃度要求及亞急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)基本原則，分別以硫酸銅和馬度米星銨聯(lián)合染毒時(shí)96 h-LC50的1/140和1/10作為低、高2個(gè)劑量組，并按毒性1∶1進(jìn)行聯(lián)合染毒，具體分組如表1所示。每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行24條鯽魚，持續(xù)染毒21 d。

1.3.4 樣品采集

在持續(xù)染毒第7天和第21天，分別從各組隨機(jī)取6尾鯽魚，頭部穿刺處死，解剖取肝臟，放入凍存管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)存于-80 ℃。染毒第21天，分別從各組隨機(jī)取6尾鯽魚，斷尾采血。在4 ℃條件下，3 000 r·min-1離心10 min，取上清，用于血生化分析。染毒第21天，分別從各組隨機(jī)取6尾鯽魚，斷尾采血，用于制備血涂片，同時(shí)，解剖取肝臟，用于制備肝細(xì)胞懸液。

1.3.5 血生化的測(cè)定

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)鯽魚血清中的堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性。

1.3.6 抗氧化酶活性的測(cè)定

從-80 ℃取出樣品，冰上解凍，按1∶9的質(zhì)量體積比加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，冰上勻漿，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo)?？偟鞍诐舛?、SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的酶活性及MDA含量的測(cè)定步驟參照試劑盒說明書。

1.3.7 抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)測(cè)定基因sod、cat和gpx的mRNA表達(dá)，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因引物(表2)，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。將待測(cè)鯽魚肝臟組織從-80 ℃冰箱中取出后在液氮中研磨后，快速轉(zhuǎn)移至2 mL管中，加入1 mL RNAiso，冰上勻漿。加入0.2 mL氯仿，渦旋后12 000 r·min-1離心15 min，轉(zhuǎn)移上清。加入1 mL異丙醇，渦旋后12 000 r·min-1離心10 min，棄液。加入75%乙醇(1 mL)洗滌，12 000 r·min-1離心5 min，棄液，洗滌2次。室溫干燥8～10 min，加DEPC水80 μL溶解，RNA溶液于-80 ℃短期保存。測(cè)定RNA樣品中RNA濃度及OD值，以O(shè)D260/OD280比值判斷RNA純度，比值為1.8～2.0的RNA作反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄過程及RT-qPCR程序參見本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文獻(xiàn)[16]，以ef1α為內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.8 外周血微核試驗(yàn)

鯽魚斷尾取血，前2～3滴丟棄，用預(yù)先經(jīng)肝素鈉溶液濕潤(rùn)過的槍頭吸取尾部的外周血，滴加到潔凈載玻片的一端，取另一蓋玻片以30°左右的夾角均勻推動(dòng)血液，在玻片上形成一層血膜，晾干后甲醇中固定15 min。血涂片置于染缸中，10%吉姆薩染液室溫下染色15 min。蒸餾水從一端沖洗，自然晾干。使用顯微鏡的油鏡觀察染色后的血膜并用MShot Image Analysis System軟件拍照。每張血涂片觀察并拍照1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算微核率，公式如下：

微核率(‰)=觀察到含微核細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×1000‰

表1 染毒劑量與分組Table 1 Exposure doses and group setting

1.3.9 單細(xì)胞凝膠電泳1.3.9.1 試劑溶液配制

稱取0.20 g 0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖，加PBS 40 mL，加熱溶解；稱取0.14 g 0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖，加PBS 20 mL，加熱溶解。0.4 mg·L-1Tris-HCl：稱取Tris 12.114 g，加水溶解，HCl調(diào)pH值至7.5，定容至250 mL。300 mmol·L-1NaOH：稱取NaOH 3.0 g，加水溶解，定容至250 mL。1 mmol·L-1EDTA-Na2：稱取EDTA-Na20.1861 g，加水溶解，定容至500 mL。堿性電泳緩沖液：將EDTA-Na2與NaOH溶液等體積混合，調(diào)節(jié)pH值>13，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.9.2 肝細(xì)胞懸液制備

鯽魚解剖取肝臟于離心管中，加入所取組織10倍體積的0.25%胰蛋白酶，4 ℃消化15 min，1 000 r·min-1離心5 r·min-1，棄上清，PBS清洗，過200目細(xì)胞篩，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)·mL-1左右。

1.3.9.3 單細(xì)胞凝膠電泳步驟

制備瓊脂糖膠。第1層：載玻片上滴加正常熔點(diǎn)瓊脂糖100 μL，加蓋玻片，4 ℃固化。第2層：取肝細(xì)胞懸液10 μL與低熔點(diǎn)瓊脂糖75 μL混勻，滴加至第1層，加蓋玻片，4 ℃固化。第3層：揭去蓋玻片，滴加低熔點(diǎn)瓊脂糖75 μL，加蓋玻片，4 ℃固化。

細(xì)胞裂解：玻片浸入冷的細(xì)胞裂解液中，4 ℃避光1.5 h。DNA堿解旋：向電泳槽中加入電泳緩沖液，載玻片浸于液面以下，堿解旋30 min。電泳：電壓25 V，電流300 mA，電泳30 min。中和：載玻片置于平皿中，加Tris-HCl，4 ℃中和10 min，中和3次，棄去Tris-HCl。染色鏡檢：加PI染液20 μL，加蓋玻片，避光染色10 min，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理及分析

用Excel分析數(shù)據(jù)，按寇式法計(jì)算LC50和安全濃度，公式如下：

95%可信限=lg-1(lgLC50±1.96×Sm)

式中：Xi是劑量對(duì)數(shù)，Pi是死亡率，Sm是標(biāo)準(zhǔn)誤，d是對(duì)數(shù)差，n是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)。采用SPSS 26.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析(One-way ANOVA, LSD)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，并用GraphPad Prism 8軟件作圖。用CASP 1.22軟件分析彗星圖像。

2 結(jié)果(Results)

2.1 硫酸銅和馬度米星銨單一或聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚的急性毒性

由表3可知，硫酸銅對(duì)鯽魚的96 h-LC50為3.6 mg·L-1，其95%置信區(qū)間是3.31～3.95 mg·L-1，安全濃度為0.36 mg·L-1。硫酸銅和馬度米星銨聯(lián)合暴露時(shí)，硫酸銅對(duì)鯽魚的96 h-LC50為1.4 mg·L-1，其95%置信區(qū)間是1.16～1.73 mg·L-1，安全濃度為0.14 mg·L-1；馬度米星銨對(duì)鯽魚的96 h-LC50為4.2 mg·L-1，其95%置信區(qū)間是3.45～5.16 mg·L-1，安全濃度為0.42 mg·L-1。采用水生毒理聯(lián)合效應(yīng)Marking相加指數(shù)法[9]評(píng)價(jià)硫酸銅和馬度米星銨的聯(lián)合毒性大小，生物毒性之和為0.76，AI值為0.31，AI>0，表明硫酸銅與馬度米星銨對(duì)鯽魚的聯(lián)合急性毒性為協(xié)同作用。

表2 RT-qPCR的引物序列Table 2 Primer sequences of RT-qPCR

2.2 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚肝臟抗氧化酶活性及MDA含量的影響

2.2.1 硫酸銅單一暴露對(duì)鯽魚肝臟抗氧化酶活性和MDA含量的影響

如圖1(a)所示，與空白對(duì)照組相比，Cu1組鯽魚肝臟中SOD活性無顯著變化(P>0.05)；染毒第21天，Cu2組SOD活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。染毒期間，Cu2組CAT活性均低于對(duì)照組；染毒第7天，Cu2組CAT活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，如圖1(b)所示。染毒第21天，Cu2組GPx活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，如圖1(c)所示。Cu1和Cu2組MDA含量在染毒期間逐漸升高，存在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系(圖1(d))，但與空白對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。

2.2.2 馬度米星銨單一暴露對(duì)鯽魚肝臟抗氧化酶活性和MDA含量的影響

與空白對(duì)照組相比，染毒第21天，MAD1組SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，如圖2(a)所示。染毒第7天，MAD1組CAT活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，如圖2(b)所示。染毒第21天，MAD2組GPx活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，如圖2(c)所示。染毒第21天，MAD2組MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，如圖2(d)所示。

2.2.3 硫酸銅和馬度米星銨聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚肝臟抗氧化酶活性和MDA含量的影響

如圖3(a)所示，染毒第7天，Cu1+MAD1組SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；染毒第21天，Cu2+MAD2組SOD活性顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。染毒第7天，Cu1+MAD1組CAT活性顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，如圖3(b)所示。染毒第21天，Cu2+MAD2組GPx活性顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，如圖3(c)所示。如圖3(d)所示，Cu1+MAD1和Cu2+MAD2組MDA含量均高于對(duì)照組；第21天，染毒組MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

圖1 硫酸銅單一暴露對(duì)鯽魚肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx) 活性和丙二醛(MDA)含量的影響注：Cu1代表0.01 mg·L-1 CuSO4處理組，Cu2代表0.14 mg·L-1 CuSO4處理組，下同；與對(duì)照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，n=6。Fig. 1 Effects of single copper sulphate exposure on the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and malondialdehyde (MDA) content in the liver of Carassius auratusNote: Cu1 means 0.01 mg·L-1 CuSO4 treatment group; Cu2 represents 0.14 mg·L-1 CuSO4 treatment group; the same below; *indicates significant difference at 0.05 level compared with control group (P<0.05), n=6.

2.3 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚肝臟抗氧化基因表達(dá)的影響

2.3.1 硫酸銅單一暴露對(duì)鯽魚肝臟抗氧化基因表達(dá)的影響

染毒期間，各組sod的mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)，如圖4(a)所示。如圖4(b)所示，染毒第7天，Cu2組cat的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；染毒第21天，Cu1組cat的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，Cu2組cat的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。試驗(yàn)期間，各組gpx的mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，但無顯著性差異(P>0.05)，如圖4(c)所示。

圖2 馬度米星銨單一暴露對(duì)鯽魚肝臟SOD、CAT、GPx活性和MDA含量的影響注：MAD1代表0.03 mg·L-1馬度米星銨處理組，MAD2代表0.42 mg·L-1馬度米星銨處理組，下同；與對(duì)照組比， *表示差異顯著(P<0.05)，**表示顯著差異(P<0.01)，n=6。Fig. 2 Effects of single maduramicin exposure on SOD, CAT, GPx activity and MDA content in the liver of Carassius auratusNote: MAD1 represents 0.03 mg·L-1 maduramicin treatment group; MAD2 indicates 0.42 mg·L-1 maduramicin treatment group; the same below; compared with the control group, *indicates a significant difference (P<0.05), **indicates a significant difference (P<0.01), n=6.

表3 硫酸銅與馬度米星銨單一及聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚的急性毒性Table 3 Acute toxicity of single and combined exposure of copper sulphate and maduramicin on Carassius auratus

2.3.2 馬度米星銨單一暴露對(duì)鯽魚肝臟抗氧化基因的影響

試驗(yàn)期間，各組sod和gpx的mRNA相對(duì)表達(dá)量上下波動(dòng)，與對(duì)照相比無顯著變化(P>0.05)，如圖5(a)和圖5(c)所示。如圖5(b)所示，各組cat的mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，其中第21天，MAD2組cat的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)。

2.3.3 硫酸銅和馬度米星銨聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚肝臟抗氧化基因表達(dá)的影響

試驗(yàn)期間，各聯(lián)合處理組sod和gpx的mRNA相對(duì)表達(dá)量上下波動(dòng)，與對(duì)照相比無顯著變化(P>0.05)，如圖6(a)和圖6(c)所示。由圖6(b)可知，Cu2+MAD2組cat的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚血生化的影響

硫酸銅和馬度米星銨單一及聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚血生化的影響如表4所示。染毒第21天，MAD2和Cu2+MAD2組ALT活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；其他染毒組與對(duì)照相比無顯著差異(P>0.05)。染毒第21天，Cu2組AST活性最高，顯著高于Cu1和對(duì)照組(P<0.05)。染毒第21天，Cu2+MAD2組ALP活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.5 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚紅細(xì)胞微核率的影響

由表5可知，硫酸銅和馬度米星銨單一及聯(lián)合染毒均誘導(dǎo)鯽魚紅細(xì)胞微核率上升，并且隨著劑量增加而升高。Cu2和Cu2+MAD2組紅細(xì)胞微核率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；MAD2組紅細(xì)胞微核率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；Cu2+MAD2組紅細(xì)胞微核率顯著高于Cu2、MAD2和Cu1+MAD1組(P<0.01)。

2.6 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚肝細(xì)胞的DNA損傷

如圖7所示，對(duì)照組中，鯽魚肝細(xì)胞DNA圖像為規(guī)則的圓形，沒有拖尾現(xiàn)象。隨著硫酸銅和馬度米星銨濃度的增加，細(xì)胞DNA出現(xiàn)斷裂，整體結(jié)構(gòu)變得松散，頭部DNA集中，尾部由DNA斷片組成，呈現(xiàn)類似彗星的圖像。隨著濃度升高，熒光強(qiáng)度變大且彗星尾部變長(zhǎng)。高濃度復(fù)合染毒組中彗星尾部大于單獨(dú)暴露組，說明復(fù)合暴露對(duì)鯽魚肝細(xì)胞DNA損傷更為嚴(yán)重。

圖4 暴露于硫酸銅中的鯽魚肝臟sod、cat和gpx的mRNA相對(duì)表達(dá)量注：與對(duì)照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示顯著差異(P<0.01)，n=6。Fig. 4 The relative mRNA level of sod, cat and gpx in the liver of Carassius auratus exposed to copper sulphateNote: Compared with the control group, *indicates a significant difference (P<0.05), **indicates a significant difference (P<0.01), n=6.

表4 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚血生化的影響Table 4 Effects of single and combined exposure of copper sulphate and maduramicin on blood biochemistry of Carassius auratus

圖5 暴露于馬度米星銨溶液中的鯽魚肝臟sod、cat和gpx的mRNA相對(duì)表達(dá)量注：與對(duì)照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，n=6。Fig. 5 The relative mRNA level of sod, cat and gpx in the liver of Carassius auratus exposed to maduramicinNote: *mean significant difference at 0.05 level compared with control group (P<0.05), n=6.

表5 硫酸銅和馬度米星銨單一及聯(lián)合暴露對(duì) 鯽魚紅細(xì)胞微核率的影響Table 5 Effects of single and combined exposure of copper sulphate and maduramicin on the micronucleus rate of erythrocytes of Carassius auratus

如圖8所示，鯽魚肝細(xì)胞DNA彗星圖像的尾部DNA百分比、尾距、尾部長(zhǎng)度和Oliver尾距隨著硫酸銅和馬度米星銨劑量升高均增高。Cu2、MAD2和Cu2+MAD2組上述指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

3 討論(Discussion)

3.1 硫酸銅和馬度米星銨單一與聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚的急性毒性

本研究中，硫酸銅對(duì)(146±15) g鯽魚的96 h-LC50為3.6 mg·L-1，按魚類急性毒性標(biāo)準(zhǔn)，Cu2+對(duì)鯽魚為高等毒性。文獻(xiàn)報(bào)道，Cu2+對(duì)(2.58±0.27) g豐產(chǎn)鯽的96 h-LC50為0.085 mg·L-1[26]，Cu2+對(duì)(13.2±0.8) g黃河鯉的96 h-LC50為1.12 mg·L-1[27]，Cu2+對(duì)(1.95±0.53) g棕二須魮的96 h-LC50為7.5 mg·L-1[28]。由此可見，不同種屬試驗(yàn)動(dòng)物的日齡和體質(zhì)量對(duì)Cu2+毒性反應(yīng)差異較大，但均表明高濃度Cu2+對(duì)魚類產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性效應(yīng)。馬度米星銨對(duì)鯽魚的96 h-LC50為11.22 mg·L-1(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，低于其對(duì)斑馬魚的96 h-LC50(13.33 mg·L-1)，均為高等毒性。當(dāng)二者聯(lián)合暴露時(shí)，其96 h-LC50進(jìn)一步降低至1.4 mg·L-1和4.2 mg·L-1，采用相加指數(shù)法評(píng)價(jià)二者聯(lián)合毒性為協(xié)同作用。評(píng)價(jià)聯(lián)合毒性的方法很多，不同的評(píng)價(jià)手段可能造成不同的結(jié)果[29]。Markering相加指數(shù)法常與時(shí)間結(jié)合以觀察相互作用的變化，是目前水生毒理學(xué)研究中較為常用的一種方法[30]。截至目前，尚未有Cu2+和馬度米星銨對(duì)水生動(dòng)物聯(lián)合毒性的報(bào)道，對(duì)于其他種屬水生動(dòng)物的聯(lián)合毒性亦值得深入研究。

圖6 暴露于硫酸銅和馬度米星銨溶液中的鯽魚肝臟sod、cat和gpx的mRNA相對(duì)表達(dá)量注：與對(duì)照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，n=6。Fig. 6 The relative mRNA levels of sod, cat and gpx in the liver of Carassius auratus exposed to copper sulphate and maduramicinNote: *means significant difference at 0.05 level compared with control group (P<0.05), n=6.

圖7 硫酸銅和馬度米星銨暴露對(duì)鯽魚肝細(xì)胞DNA損傷的影響注：(a) 空白對(duì)照組；(b) 0.03 mg·L-1馬度米星銨；(c) 0.01 mg·L-1硫酸銅；(d) 0.03 mg·L-1馬度米星銨+0.01 mg·L-1硫酸銅； (e) 0.42 mg·L-1馬度米星銨；(f) 0.14 mg·L-1硫酸銅；(g) 0.42 mg·L-1馬度米星銨+0.14 mg·L-1硫酸銅。Fig. 7 Effects of copper sulphate and maduramicin exposure on DNA damage of Carassius auratus liver cellsNote: (a) negative control group; (b) 0.03 mg·L-1 maduramicin; (c) 0.01 mg·L-1 copper sulfate; (d) 0.01 mg·L-1 copper sulfate+0.03 mg·L-1 maduramicin; (e) 0.42 mg·L-1 maduramicin; (f) 0.14 mg·L-1 copper sulfate; (g) 0.14 mg·L-1 copper sulfate+0.42 mg·L-1 maduramicin.

圖8 硫酸銅和馬度米星銨暴露對(duì)鯽魚肝臟細(xì)胞DNA損傷的定量分析注：不同小寫字母表示各處理組之間的顯著差異(P<0.05)，不同大寫字母表示各處理組之間的顯著差異(P<0.01)，n=6。Fig. 8 Quantitative analysis of DNA damage of Carassius auratus liver cells induced by copper sulphate and maduramicinNote: Different lower case letters indicate significant differences between treatment groups (P<0.05), and different upper case letters indicate significant differences between treatment groups (P<0.01), n=6.

3.2 硫酸銅和馬度米星銨單一或聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚的亞急性毒性

為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Cu2+和馬度米星銨二者聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚的亞急性毒性，本研究選取二者聯(lián)合染毒96 h-LC50的1/10和1/140進(jìn)行亞急性毒性試驗(yàn)。研究顯示，Cu2+和馬度米星銨可影響ALT、AST和ALP的活性，當(dāng)機(jī)體肝組織發(fā)生中毒、炎癥等情況時(shí)，血液中ALT與AST濃度升高[31]。ALP廣泛分布于肝臟、腸、腎和骨等組織，是參與機(jī)體去磷酸化和磷酸化反應(yīng)的非特異性表達(dá)酶[32]。肝組織受到損傷時(shí)，血清中ALP活性增強(qiáng)[33]。提示Cu2+和馬度米星銨對(duì)肝臟有損傷作用，然而聯(lián)合染毒組上述指標(biāo)與單一染毒組相比并無顯著差異，表明ALT、AST和ALP尚不能作為評(píng)價(jià)Cu2+和馬度米星銨的聯(lián)合毒性的生物標(biāo)志物。

SOD是一類廣泛分布于生物體內(nèi)的金屬酶，其活力可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度Cu2+與馬度米星銨聯(lián)合暴露導(dǎo)致SOD活性在染毒第21天顯著降低，而高濃度馬度米星銨暴露可在一定程度升高SOD活性，提示Cu2+單一及聯(lián)合染毒時(shí)，對(duì)鯽魚肝臟毒性超過機(jī)體承受能力，SOD活性受到抑制，從而對(duì)機(jī)體造成毒害作用[35]。而馬度米星銨對(duì)鯽魚肝臟的毒性小于Cu2+和聯(lián)合染毒組，機(jī)體可通過升高SOD活性減緩氧化損傷。CAT是生物體內(nèi)重要的酶，主要通過減少過氧化氫含量降低有害物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損傷[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，單一及聯(lián)合染毒組的CAT活性均呈下降趨勢(shì)，說明Cu2+和馬度米星銨會(huì)抑制CAT活性，降低機(jī)體清除過氧化氫的能力，使機(jī)體受到過氧化氫的毒害。GPx也是組成抗氧化系統(tǒng)中的一種酶，其功能是將機(jī)體內(nèi)的過氧化物轉(zhuǎn)換成水等無害物質(zhì)[37-38]，本研究發(fā)現(xiàn)各組GPx的活性整體呈下降趨勢(shì)，說明Cu2+和馬度米星銨可通過破壞抗氧化系統(tǒng)，進(jìn)而對(duì)機(jī)體造成氧化損傷。MDA是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[39]，MDA含量越高，機(jī)體受到的氧化損傷程度越高。本研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+與馬度米星銨單一和聯(lián)合暴露呈濃度依賴性地升高鯽魚肝臟中的MDA含量，但聯(lián)合暴露組MDA含量和單一暴露組相比無顯著差異，不能由此判斷Cu2+和馬度米星銨聯(lián)合毒性作用的類型?！稘O業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607—89)[40]要求水環(huán)境中Cu2+的濃度不能高于0.01 mg·L-1，本試驗(yàn)Cu2+對(duì)鯽魚染毒的低劑量為0.01 mg·L-1，研究發(fā)現(xiàn)，染毒后第21天，低濃度Cu2+顯著抑制catmRNA的表達(dá)，提示鯽魚長(zhǎng)期暴露于低濃度Cu2+會(huì)受到氧化損傷，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)環(huán)境監(jiān)控力度，以保護(hù)生態(tài)環(huán)境安全。

3.3 硫酸銅和馬度米星銨單一或聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚細(xì)胞微核和DNA損傷的影響

水中有害物質(zhì)會(huì)影響魚的造血器官，導(dǎo)致紅細(xì)胞染色體畸變甚至斷裂[41]，當(dāng)血液干細(xì)胞分裂形成新細(xì)胞時(shí)，殘留于紅細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的斷片形成微核[42]。魚吸收了重金屬等致突變物后，其外周血紅細(xì)胞產(chǎn)生的微核數(shù)目與致畸物濃度呈正比。因此，可通過檢測(cè)魚類外周血紅細(xì)胞微核數(shù)來評(píng)價(jià)水環(huán)境的污染狀況[43-44]。彗星試驗(yàn)是快速檢測(cè)單細(xì)胞DNA損傷的方法[7]。

研究表明，斑馬魚持續(xù)14 d暴露于0.5 mg·L-1的馬度米星銨溶液中，紅細(xì)胞微核率為(337±21.66)‰，是對(duì)照組的43.9倍[15]。有研究表明，將鯽魚置于0.02 mg·L-1的Cu2+溶液中7 d后，紅細(xì)胞微核率是對(duì)照組的6.3倍[45]。本研究中高濃度馬度米星銨和Cu2+組微核率分別是對(duì)照組的6.2倍和18.7倍，這種差異可能由試驗(yàn)動(dòng)物及染毒時(shí)間不同所致。高濃度的Cu2+和馬度米星銨可明顯損傷鯽魚肝細(xì)胞DNA，推測(cè)Cu2+和馬度米星銨對(duì)鯽魚的毒害作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，損害細(xì)胞內(nèi)的核糖、氨基酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，最終導(dǎo)致DNA鏈的斷裂，造成DNA損傷[46]。高濃度聯(lián)合染毒組紅細(xì)胞微核率和肝細(xì)胞尾部DNA百分比顯著高于單獨(dú)染毒組，表明高濃度Cu2+和馬度米星銨聯(lián)合暴露對(duì)鯽魚的遺傳毒性高于單一暴露。

綜上所述，Cu2+和馬度米星銨對(duì)鯽魚的聯(lián)合暴露急性毒性高于單一暴露，表現(xiàn)為協(xié)同作用；環(huán)境濃度下的Cu2+和一定濃度的馬度米星銨單一及聯(lián)合暴露均可引起一定程度的血液毒性和肝臟氧化損傷；Cu2+與馬度米星銨聯(lián)合暴露可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞微核和肝臟細(xì)胞DNA損傷，其遺傳毒性高于單一暴露。養(yǎng)殖水體或自然水體環(huán)境中應(yīng)加強(qiáng)Cu2+和馬度米星銨的復(fù)合污染的監(jiān)控與處理，以保障水生態(tài)安全及水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展。